楊利梅，張影茹，于 浩，朱惠蓉，2*，王 炎*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤研究所，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤科，上海 201203）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤。2018 年，我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例51.83 萬(wàn)例［1］。炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是結(jié)腸癌發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［2-3］，“炎癥-異常隱窩-腺瘤-癌癥” 是結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生的基本路徑，促炎細(xì)胞因子通過(guò)激活促生存和增殖途徑加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［4-5］，因此，控制“炎-癌轉(zhuǎn)化” 對(duì)防治CRC意義重大?！凹炔》雷儭?是中醫(yī)藥治療疾病的重要思想理論，結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化具有起病緩、病程長(zhǎng)的特點(diǎn)，因而對(duì)腸道炎癥遷延階段進(jìn)行早期干預(yù)是抑制腸炎發(fā)展為腸道實(shí)體瘤形成的重要方法［6］。

薏苡附子敗醬散出自《金匱要略》，是治療腸癰的代表方。當(dāng)代醫(yī)家多用此方治療消化道慢性炎癥性疾?。?］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，薏苡附子敗醬散可以預(yù)防炎癥相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生，并從腸道微生物群和免疫等方面對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究［8-9］。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以調(diào)節(jié)IL-5、IL-6、IL-17、IL-10、IL-2 和IFN-γ 等炎性因子的表達(dá)［10-11］，同時(shí)NF-κB 作為可以被炎性介質(zhì)激活致癌的轉(zhuǎn)錄因子，在連接炎癥和致癌作用方面起關(guān)鍵作用，許多天然藥物可以通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路活化抑制癌變［12-13］。因此，本研究將從炎性微環(huán)境角度對(duì)薏苡附子敗醬散干預(yù)結(jié)腸癌的作用進(jìn)行驗(yàn)證，并從NF-κB 信號(hào)通路探討薏苡附子敗醬散預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 72 只SPF 級(jí)C57BL／6J 雌性小鼠，6 ～8 周齡，體質(zhì)量16 ～18 g，購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬）2017-0012］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室恒溫20～22 ℃，相對(duì)濕度45% ～70%，光照周期12 h，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定 （倫理號(hào)PZSHUTCM210528005）。

1.2 藥物 苡附子敗醬散由薏苡仁30 g （批號(hào)210608）、附子6 g （批號(hào)210414）、敗醬草15 g （批號(hào)210201）組成，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥房。藥材先用清水浸泡30 min，大火煮沸后小火煎煮40 min，過(guò)濾，藥渣再加水2 次煎煮40 min，過(guò)濾，合并2 次藥液，蒸發(fā)濃縮至約150 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.386、0.774、1.547 g／mL的藥液（按每只小鼠20 g 計(jì)算給藥量，每天每只小鼠給藥0.2 mL），用50 mL 離心管分裝后于-20 ℃冰箱保存，使用前4 h 于4 ℃冰箱中解凍，每2 周配制1 次新鮮藥液。阿司匹林腸溶片（批號(hào)J20171021）購(gòu)自德國(guó)拜耳公司，取600 mg 阿司匹林腸溶片搗碎成粉末狀，加入100 mL 純水和100 mL 1%CMC-Na，使用渦旋振蕩儀振蕩混勻，配制成3 mg／mL 的阿司匹林溶液（根據(jù)阿司匹林人臨床用量每天200 mg 和人鼠劑量系數(shù)9.1 換算得到），于-4 ℃下保存。

1.3 試劑 氧化偶氮甲烷 （azomethane，Aom，貨號(hào)A5486，美國(guó) Sigma 公司）； 2.5% 葡聚糖硫酸鈉（dextransulfatesodium，DSS，貨號(hào) 9011-18-1，美國(guó) MP Biomedicals 公司）； 0.9% 氯化鈉（批號(hào)H20023146，華仁藥業(yè)股份有限公司）； IKB、p-IKBα、NF-κB p65 一抗（貨號(hào)4814S、2859S、3033S，美國(guó)CST 公司）； IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-2、γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（貨號(hào)MEI020S、MEI021、MEI025、MEI029、MEI016、MEI004，上海博谷生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、阿司匹林組和薏苡附子敗醬散低、中、高劑量組，每組12 只，除空白組外，其余各組小鼠一次性腹腔注射誘變劑Aom （10 mg／kg）。正常飲水1 周后，給予2.5% DSS 連續(xù)飲用7 d （每2 d 更換1 次新鮮的DSS），繼續(xù)恢復(fù)正常飲水2 周，以此為1 個(gè)DSS 周期，共進(jìn)行3 個(gè)DSS 周期循環(huán)［14-15］。從給予DSS 飲用的第1 天開始藥物干預(yù)，薏苡附子敗醬散低、中、高劑量組灌胃給予3.87、7.74、15.47 g／kg 藥液0.2 mL （根據(jù)薏苡附子敗醬散臨床成人的有效劑量每天0.85 g／kg 和人鼠劑量系數(shù)9.1 換算得到劑量為7.74 g／kg，設(shè)為中劑量，以中劑量的0.5、2 倍為低、高劑量，即3.87、15.47 g／kg）； 阿司匹林組給予30 mg／kg 阿司匹林溶液0.4 mL； 模型組給予0.2 mL 等體積純水，每天1 次，連續(xù)12 周。

2.2 小鼠一般情況和DAI 評(píng)分 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隔天觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)、毛發(fā)光澤、活動(dòng)情況、大便性狀等，每2 d 稱量1 次體質(zhì)量，通過(guò)體質(zhì)量下降百分率、大便性狀分?jǐn)?shù)、便血分?jǐn)?shù)3 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)行DAI 評(píng)分［16］，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 樣本采集和脾臟指數(shù)計(jì)算 給藥結(jié)束后，采集小鼠血液樣本并制備血清，用于血清炎性因子檢測(cè)； 采集結(jié)腸組織樣本，觀察記錄結(jié)腸組織大體形態(tài)，拍照并記錄大腸內(nèi)腫瘤數(shù)目、大小、結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟狀態(tài)； 結(jié)腸組織一部分于-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot 實(shí)驗(yàn)； 另一部分于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色； 采集脾臟樣本，計(jì)算脾臟指數(shù)，公式為脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量／體質(zhì)量×10。

2.4 HE 染色觀察結(jié)腸組織病理變化并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分取固定于4%多聚甲醛中的結(jié)腸組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（4 μm），二甲苯透明，乙醇梯度脫水后，按照HE 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行HE 染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織形態(tài)，并根據(jù)炎癥、肉芽腫、潰瘍、纖維化、病變深度、上皮內(nèi)瘤變情況進(jìn)行評(píng)分［17-19］，無(wú)潰瘍、無(wú)炎癥、無(wú)肉芽腫、無(wú)纖維化、無(wú)病變，為0 分；小潰瘍＜3 mm、輕度炎癥、有肉芽腫、病變局限于黏膜下層，為1 分； 大潰瘍≥3 mm、重度炎癥、病變深度達(dá)肌層、重度纖維化，為2 分。

2.5 炎性因子水平檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書，采用ELISA法檢測(cè)血清炎性因子IL-5、IL-6、IL-17、IL-10、IL-2、IFNγ 水平。

2.6 Western blot 法檢測(cè)NF-κB p65、IKB-α 蛋白表達(dá) 取結(jié)腸部位腫瘤組織，提取總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×loading buffer，100 ℃煮沸10 min 使蛋白變性。采用SDS-PAGE 凝膠電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉2 h，加稀釋后的一抗NF-κB p65、IKBα、p-IKB-α 及GAPDH，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后，加稀釋后的HRP-山羊抗兔IgG 孵育2 h，TBST 洗滌后，使用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白印跡進(jìn)行顯影，通過(guò)Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值／GAPDH 條帶灰度值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠一般情況的影響 模型組小鼠在飲用DSS 期間均出現(xiàn)不同程度的消瘦、蜷縮、動(dòng)作遲緩、腹瀉、便血、脫肛等癥狀，更換正常飲用水后逐漸緩解，但總體癥狀隨造模時(shí)間逐漸加重； 薏苡附子敗醬散組小鼠在飲用DSS 期間一般狀態(tài)優(yōu)于模型組，且停飲后精神狀態(tài)、體質(zhì)量、腹瀉等情況恢復(fù)更快。

3.2 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠DAI 評(píng)分、體質(zhì)量和生存率的影響 空白組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng)，其余各組小鼠體質(zhì)量均隨著DSS 的攝入持續(xù)下降，在停藥后1 周左右逐漸恢復(fù)正常水平，與模型組比較，薏苡附子敗醬散組小鼠體質(zhì)量下降較少，且恢復(fù)較快，見圖1A。第13 周末對(duì)各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)進(jìn)行評(píng)分，模型組小鼠DAI 評(píng)分高于空白組，而薏苡附子敗醬散各劑量組DAI 評(píng)分低于模型組，其中高劑量組最低（P＜0.01），見圖1B。模型組生存率較空白組降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)12 只小鼠只存活5 只； 薏苡附子敗醬散干預(yù)后小鼠生存率高于模型組，其中高劑量組（存活9 只）生存率最高且高于阿司匹林組（存活7 只），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，薏苡附子敗醬散中、低劑量組分別存活8 只和6 只，見圖1C。

圖1 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠DAI 評(píng)分、體質(zhì)量和生存率的影響（±s，n＝5）

3.3 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠成瘤率、結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)瘤體； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散中、高劑量組和阿司匹林組結(jié)腸組織中腫瘤數(shù)量減少（P＜0.01），其中高劑量組效果最好（P＜0.01），見圖2A～2B。與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組脾臟指數(shù)均升高（P＜0.01），見圖2C。與空白組比較，模型組結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.05）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組結(jié)腸長(zhǎng)度均增長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01），見圖2D。以上結(jié)果表明，薏苡附子敗醬散可以預(yù)防結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生。

圖2 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠成瘤率、結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟指數(shù)的影響（±s，n＝5）

3.4 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 如圖3 所示，空白組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列規(guī)整，可見隱窩與杯狀細(xì)胞，黏膜下層無(wú)充血與水腫，未見病變及炎癥現(xiàn)象； 與空白組比較，模型組結(jié)腸組織可見黏膜上皮部分缺損，腺體結(jié)構(gòu)紊亂或消失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肌層纖維化明顯，隱窩分支不規(guī)則，腫瘤惡性程度高； 與模型組比較，阿司匹林組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，部分腺體遭到破壞，可見少量炎性細(xì)胞，病理組織學(xué)評(píng)分降低（P＜0.01）； 薏苡附子敗醬散各劑量組結(jié)腸肌層稍見增厚，隱窩腔較為完整，杯狀細(xì)胞明顯，炎性程度和腫瘤惡性程度減輕，病理組織學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量組改善效果最好。

圖3 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響（x±s，n＝5）

3.5 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠血清炎性因子水平的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組血清促炎因子IL-17 水平升高（P＜0.05），促炎因子IL-5、IL-6 水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），抑炎因子IL-2 水平降低（P＜0.05），IL-10、IFN-γ 水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與模型組比較，薏苡附子敗醬散低劑量組血清IL-5水平降低（P＜0.05），薏苡附子敗醬散中劑量組血清IL-5、IL-6、IL-17 水平降低 （P＜0.05），IL-10 水平升高 （P＜0.05），薏苡附子敗醬散高劑量組血清IL-5、IL-6、IL-17 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-2、IL-10、IFN-γ 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），阿司匹林組血清IL-5、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3.6 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠結(jié)腸腫瘤組織NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與模型組比較，薏苡附子敗醬散各劑量組和阿司匹林組大鼠結(jié)腸腫瘤組織NFκB p65、IKBα 和p-IKBα 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 薏苡附子敗醬散對(duì)小鼠結(jié)腸腫瘤組織NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)各劑量薏苡附子敗醬散均能不同程度地改善小鼠的一般狀態(tài)，降低DAI 評(píng)分，減輕結(jié)腸黏膜水腫、充血、炎癥、潰瘍等損傷，降低結(jié)腸長(zhǎng)度縮短程度，升高脾臟指數(shù)，在數(shù)量和大小上減少結(jié)直腸腺瘤發(fā)生，在組織病理學(xué)層面，薏苡附子敗醬散組小鼠結(jié)腸組織隱窩腔較為完整，杯狀細(xì)胞明顯，炎性程度和腫瘤惡性程度低于模型組，其中高劑量組改善效果最好，表明薏苡附子敗醬散對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生具有抑制作用。

由于炎性腸癌與炎癥反應(yīng)有著密切的相關(guān)性［20-21］，本研究對(duì)小鼠血清多種炎性相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。IL-6 是炎癥性腸病發(fā)展過(guò)程中的一種核心促炎細(xì)胞因子，也是炎性疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后指標(biāo)的生物標(biāo)記物［22-25］。IL-17 是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，通過(guò)促進(jìn)T 細(xì)胞的激活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8 等多種炎性細(xì)胞因子來(lái)放大炎性反應(yīng)，促進(jìn)炎癌轉(zhuǎn)化［26-28］。IL-10 是一種抗炎與免疫抑制性細(xì)胞，可以抑制多種炎性介質(zhì)釋放及促炎細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［29］。IL-2 是一種抑炎因子，具有活化T 細(xì)胞，刺激NK細(xì)胞增殖，促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和分泌抗體等作用［30］。IFN-γ具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗腫瘤活性功能［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，薏苡附子敗醬散能降低血清促炎細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-17 水平，升高抑炎因子IL-10、IL-2、IFN-γ 水平，表明薏苡附子敗醬散可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌小鼠體內(nèi)炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)。

NF-κB 作為炎性介質(zhì)激活致癌轉(zhuǎn)錄因子，在促進(jìn)炎癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前研究發(fā)現(xiàn)，在IBD 和CRC患者的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中均可以檢測(cè)到活化的NF-κB，NF-κB 的活化可以促進(jìn)炎癥因子釋放，而釋放的炎癥因子又可反過(guò)來(lái)促進(jìn)NF-κB 活化，形成正反饋過(guò)程，導(dǎo)致炎癥不斷放大加深，進(jìn)而惡化為腫瘤。IKB 作為NF-κB 家族的抑制因子，通過(guò)從NF-κB 復(fù)合體中解離并降解，暴露NFκB 的核定位序列，使NF-κB 發(fā)生核易位，并與特異的KB序列結(jié)合來(lái)促進(jìn)NF-κB 的激活［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，薏苡附子敗醬散可以降低NF-κB p65、IKBα 和p-IKBα 蛋白表達(dá)，其中高劑量組降低最為明顯，表明薏苡附子敗醬散可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，對(duì)結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化模型小鼠結(jié)腸組織炎癥起到抑制作用。

綜上所述，薏苡附子敗醬散具有預(yù)防Aom／DSS 致結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)炎性細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)，降低NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而降低NF-κB 信號(hào)過(guò)度激活引起的炎癥反應(yīng)，減緩炎癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程，預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生。