廖一川，蘇劉艷，李家生，王應(yīng)仙，李 俊，張 祎，王睿睿*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

白念珠菌Candidaalbicans是一種分布廣泛的條件致病菌，好發(fā)于免疫低下及免疫缺陷人群，易引起黏膜感染和全身感染。據(jù)研究報(bào)道，全世界約70%的真菌感染由白念珠菌引起［1］，且死亡率達(dá)40%［2］。目前臨床治療藥物種類稀缺，一線藥物頻繁使用引起的耐藥性使單一藥物治療效果較差。研究表明，一些中藥復(fù)方、中藥提取物及中藥來(lái)源的天然化合物能有效抑制白念珠菌生長(zhǎng)，特別是與氟康唑聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗菌作用［3］。課題組長(zhǎng)期從事中藥及其活性成分抗真菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用僅對(duì)白念珠菌氟康唑耐藥株發(fā)揮抑菌作用，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌的作用機(jī)制，以期為燈臺(tái)葉總堿的抗真菌感染應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株及預(yù)處理 臨床耐藥株CA23、CA381、CA4508、CA3816、CA800、CA3511、CA550、CA602、CA187、CA808、CA4574，由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科李玉葉教授惠贈(zèng)； 白念珠菌SC5314 購(gòu)自云南登樓生物科技有限公司。菌株從-80 ℃冰箱中取出，解凍后用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋，取適量接種于沙氏瓊脂平板，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24～48 h，接種環(huán)取單克隆菌落，傳代備用。

1.2 藥物 氟康唑 （南昌弘益藥業(yè)有限公司，批號(hào)200117）； 燈臺(tái)葉總堿由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所羅曉東研究員惠贈(zèng)。

1.3 試劑 沙氏液體培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)1097061、1106401）； 二甲基亞砜（DMSO）（天津市化學(xué)試劑一廠，批號(hào)EZ6789B127）；K2HPO4（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)181024）； 氯仿（云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，批號(hào)20191015）； 營(yíng)養(yǎng)肉湯、羅丹明6G （R6G）、甘露醇（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào) 531F031、20200928、20181010）； 無(wú)氨基酸酵母氮源培養(yǎng)基（yeast nitrogen base，YNB）（北京酷來(lái)搏科技有限公司，批號(hào)PM291712100）；葡萄糖（廣州賽國(guó)生物科技有限公司，批號(hào)EZ2811F128）；TRIzol 試劑 （上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)252612）；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)0000499195、0000497768）； db-cAMP（美國(guó)MedChemExpress 公司，批號(hào)66069）。

1.4 儀器 恒溫恒濕真菌培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）； 恒溫?fù)u床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）； 生物安全柜（新加坡ESCO 公司）； 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）； 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）； 倒置生物顯微鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）； 多功能PCR 儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基配制 SD 液體培養(yǎng)基：精密稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯2 g至200 mL 純水混勻溶解，115 ℃濕熱滅菌30 min，冷卻至50～60 ℃，加入2 g 甘露醇、0.4 g K2HPO4混勻后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Spider 液體培養(yǎng)基：滅菌純水200 mL，YNB 1.34 g，葡萄糖4 g 分別單獨(dú)溶解，混合在一起后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

卵黃瓊脂培養(yǎng)基：2 g 葡萄糖、4 g 蛋白胨、2 g 瓊脂粉、4.64 g NaCl、0.006 9 g CaCl2至100 mL 純水，121 ℃濕熱滅菌15 min，冷卻至45～55 ℃，加入15 mL 新鮮蛋黃懸液（蛋黃與生理鹽水等體積混勻）輕輕混勻。

2.2 燈臺(tái)葉總堿體外抗真菌活性篩選 采用CLSI-M27-A3微量稀釋法［4］測(cè)定燈臺(tái)葉總堿對(duì)SC5314 和臨床分離株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。菌株在沙氏瓊脂培養(yǎng)基中傳至第二代，收集菌細(xì)胞用沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整終濃度為1×105CFU／mL。藥物質(zhì)量濃度梯度設(shè)為1 000、200、40、8、1.6、0.32 μg／mL。96 孔板中每孔加入100 μL 不同質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基，再加入100 μL菌細(xì)胞懸液混勻，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，測(cè)定625 nm 波長(zhǎng)處光密度（OD）值，以抑制率達(dá)到80%以上的藥物濃度作為最小抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照、正常生長(zhǎng)對(duì)照。

2.3 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用劑量設(shè)置 采用棋盤法測(cè)定燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)CA23 的MIC。96 孔板分別加入不同質(zhì)量濃度的燈臺(tái)葉總堿與氟康唑，藥物按2 倍倍比稀釋，氟康唑質(zhì)量濃度梯度0 ～128 μg／mL，燈臺(tái)葉總堿質(zhì)量濃度梯度0～1 024 μg／mL。每孔分別加入對(duì)應(yīng)的各50 μL不同質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基，操作步驟同“2.2” 項(xiàng)。

2.4 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌時(shí)間-殺菌曲線的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組、氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組，每組分別加入相應(yīng)藥物及菌液，菌液終濃度為1×105CFU／mL，無(wú)菌過(guò)濾透氣封口膜封口培養(yǎng)。各組分別在0、2、4、8、12、24、36、48、72 h 取樣100 μL 于96 孔板中（每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔），在625 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），所測(cè)OD 值為縱坐標(biāo)（Y）繪制時(shí)間-殺菌曲線。

2.5 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌外排泵的影響 使用新鮮沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整CA23 終濃度為1×107CFU／mL，除對(duì)照組外，氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組分別加入相應(yīng)藥物，與菌液共同搖床孵育5 h，無(wú)菌PBS 清洗3 次，10 mL PBS 重懸，搖床孵育1 h，充分消耗葡萄糖； 分別加入R6G（終濃度10 μmol／L），搖床孵育1 h，冰水浴10 min 終止吸收，PBS 清洗3 次，將上述分組再分2 個(gè)組系，一組系加入含5%葡萄糖的PBS，另一組系加入無(wú)菌PBS 繼續(xù)孵育，并于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 取1 mL，離心取上清100 μL，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 處檢測(cè)熒光強(qiáng)度，各組每1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

2.6 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌耐藥相關(guān)基因的影響

2.6.1 菌液準(zhǔn)備 將培養(yǎng)16～24 h 的菌株用新鮮沙氏液體培養(yǎng)基重懸調(diào)整濃度為1×105CFU／mL，設(shè)立對(duì)照組、氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組。每組總體積40 mL，分別加入菌液和對(duì)應(yīng)藥物混勻，無(wú)菌過(guò)濾透氣封口膜封口，于恒溫?fù)u床37 ℃，150 r／min 培養(yǎng)16 h 后，離心棄上清并用無(wú)菌PBS 洗3 次備用。

2.6.2 總RNA 提取 采用液氮研磨法提取各組總RNA。用接種環(huán)取適量菌細(xì)胞至預(yù)冷的研缽中，把菌細(xì)胞調(diào)整為便于研磨的立體狀，加入液氮快速研磨至白色粉末出現(xiàn)，加入TRIzol 裂解液混勻，將其轉(zhuǎn)移至無(wú)菌無(wú)酶EP 管中，室溫放置5 min，加入氯仿劇烈混勻，室溫放置3 min，4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，待樣品分層后取上清200 μL，加入等體積異丙醇輕搖混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r／ min 離心10 min，棄上清，加入75% 乙醇洗滌沉淀2 次，棄上清，加入無(wú)酶水使RNA 沉淀完全溶解。

2.6.3 cDNA 制備 按Promega Go Script 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，20 μL 總體系，冰上進(jìn)行cDNA 逆轉(zhuǎn)。加樣結(jié)束后，低速離心機(jī)使之沉降混勻，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42 ℃15 min，70 ℃15 min，4 ℃10 min。

2.6.4 引物設(shè)計(jì)及合成 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列（Ⅰ）

2.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng) 按照試劑盒制備反應(yīng)體系，總體系20 μL。加樣結(jié)束后，低速離心機(jī)使之沉降混勻，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃120 s； 擴(kuò)增定量程序40 個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性120 s，95 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

2.7 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響 菌絲誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基Spider／SD 調(diào)整菌株終濃度為1×105CFU／mL，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組。每組總體積4 mL，分別加入菌液和相應(yīng)藥物混勻，每孔1 mL，接種于24 孔板，37 ℃下恒溫恒濕孵育，分別在2、4、6 h 于顯微鏡下觀察白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化情況并拍照。

2.8 掃描電鏡觀察耐藥白念珠菌菌絲形態(tài) 菌絲誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基Spider／SD 調(diào)整菌株終濃度為1×105CFU／mL，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組。每組總體積4 mL，分別加入菌液和相應(yīng)藥物混勻，每孔1 mL，接種于24 孔板，37 ℃下恒溫恒濕孵育6 h，離心收集菌細(xì)胞，用預(yù)冷無(wú)菌PBS 洗滌并重懸，調(diào)整適量濃度。各組取10 μL 垂直滴在細(xì)胞爬片上，37 ℃室溫放置30 min，加入20 μL 5%戊二醛，避光固定過(guò)夜。無(wú)菌PBS 清洗固定好的細(xì)胞爬片，乙醇梯度脫水，干燥后將樣品貼在帶雙面膠紙帶的樣品臺(tái)上，經(jīng)真空蒸鍍儀噴金20 min，于掃描電鏡下觀察并拍照。

2.9 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌菌絲相關(guān)基因的影響

2.9.1 引物設(shè)計(jì)及合成 引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列（Ⅱ）

2.9.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照試劑盒制備反應(yīng)體系，總體系20 μL。加樣結(jié)束后，低速離心機(jī)使之沉降混勻，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性600 s； 擴(kuò)增定量程序45 個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。每組樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

2.10 外源性cAMP 添加實(shí)驗(yàn) 使用菌絲誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基Spider／SD 調(diào)整菌株濃度為1×105CFU／mL，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組、添加db-cAMP 的對(duì)照組和添加db-cAMP 的氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組。每組總體積4 mL，分別加入菌液、相應(yīng)藥物和db-cAMP 混勻，每孔1 mL，接種于24 孔板，37 ℃恒溫恒濕孵育，于顯微鏡下觀察白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化情況并拍照。

2.11 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌胞外磷脂酶活性的影響 使用新鮮沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整CA23 終濃度為1×105CFU／mL，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、氟康唑組、燈臺(tái)葉總堿組、聯(lián)用Ⅰ組（1／4MIC）、聯(lián)用Ⅱ組（1／2MIC）、聯(lián)用Ⅲ組（1MIC）、聯(lián)用Ⅳ組（2MIC）、聯(lián)用Ⅴ組（4MIC）。每組體積10 mL，加入菌液和相應(yīng)藥物，37 ℃恒溫?fù)u床150 r／min培養(yǎng)16～24 h 后，離心棄上清并用無(wú)菌PBS 清洗3 次，PBS 重懸調(diào)整濃度為1×107CFU／mL，每組取10 μL滴加于卵黃瓊脂培養(yǎng)皿上，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量沉淀圈及菌落直徑，計(jì)算Pz 值，公式為Pz＝菌落直徑／沉淀圈直徑，以Pz 值的大小表示磷脂酶的活性。每組平行3 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間正態(tài)分布資料采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 燈臺(tái)葉總堿體外抗真菌活性 如表3 所示，除SC5314、CA4574 外，其余菌株均為氟康唑耐藥株。燈臺(tái)葉總堿單用對(duì)氟康唑耐藥株及敏感株均無(wú)抑菌作用； 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用時(shí)，對(duì)敏感株有抑制作用，但無(wú)協(xié)同增效作用，但對(duì)所有氟康唑耐藥株均表現(xiàn)為顯著協(xié)同抑菌作用，其聯(lián)合指數(shù)FICI 在0.006～0.11 范圍。

表3 氟康唑與燈臺(tái)葉總堿對(duì)白念珠菌的抑菌活性（x±s，n＝3）

3.2 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑最佳聯(lián)用濃度測(cè)定 棋盤法測(cè)定燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)εR床白念珠菌CA23 聯(lián)用時(shí)的藥物質(zhì)量濃度，以兩藥聯(lián)用能達(dá)到的最小抑菌濃度為標(biāo)準(zhǔn)，主要對(duì)應(yīng)抑制率達(dá)80%以上的藥物質(zhì)量濃度，具體對(duì)應(yīng)燈臺(tái)葉總堿質(zhì)量濃度32 μg／mL，氟康唑質(zhì)量濃度16 μg／mL，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑不同聯(lián)用劑量的抑菌情況（n＝3）

3.3 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫鷷r(shí)間-殺菌曲線的影響 如圖1 所示，單用氟康唑（16 μg／mL）對(duì)CA23有輕微抑制作用，單用燈臺(tái)葉總堿（32 μg／mL）則無(wú)明顯抑制作用； 燈臺(tái)葉總堿聯(lián)合氟康唑作用4 h 后，表現(xiàn)出抑制作用，尤其是藥物處理12 h 時(shí)（P＜0.01）。

圖1 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 時(shí)間-殺菌曲線的影響（n＝3）

3.4 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫馀潘降挠绊?與對(duì)照組比較，未加葡萄糖組，在燈臺(tái)葉總堿和氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿分別處理3 h 內(nèi)，均對(duì)菌株的外排無(wú)抑制，見(jiàn)圖2A。與對(duì)照組比較，加葡萄糖組，氟康唑和氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿分別處理3 h 內(nèi)，均于第0.5 小時(shí)后開(kāi)始抑制菌株的外排，并持續(xù)至第3 小時(shí)（P＜0.05，P＜0.01）； 但與氟康唑組比較，氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組并無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2B。

圖2 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 外排水平的影響（±s，n＝3）

3.5 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫退幭嚓P(guān)基因表達(dá)的影響 如圖3 所示，與對(duì)照組比較，氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組僅下調(diào)MDR1 mRNA 表達(dá)（P＜0.01），但與氟康唑組比較并無(wú)明顯變化。

圖3 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.6 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫螒B(tài)轉(zhuǎn)化的影響 如圖4 所示，CA23 在SD 和Spider 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h均能形成錯(cuò)綜復(fù)雜、細(xì)長(zhǎng)盤繞的菌絲。給藥處理后，燈臺(tái)葉總堿組對(duì)菌絲并無(wú)抑制作用，氟康唑組在2、4 h 均有抑制作用，6 h 略有輕微抑制作用； 而燈臺(tái)葉總堿和氟康唑聯(lián)合組在2、4、6 h 均能抑制菌絲的生長(zhǎng)，且與氟康唑組比較，抑制作用持續(xù)，菌絲長(zhǎng)度較短，菌絲數(shù)量也減少。

圖4 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響（×20）

3.7 掃描電鏡下觀察燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫z形態(tài)的影響 如圖5 所示，掃描電鏡下，氟康唑與燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用能夠抑制CA23 菌株在2 種菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的菌絲生長(zhǎng)，而氟康唑與燈臺(tái)葉總堿分別單用處理下依然存在菌絲交錯(cuò)。

圖5 掃描電鏡下燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響（×3 000）

3.8 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫z相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，燈臺(tái)葉總堿組和氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組菌絲相關(guān)基因RAS1、CYR1、BCR1、EFG1、ALS2、ALS3、TPK2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），氟康唑組RAS1、BCR1、EFG1、ALS2、ALS3、TPK2 mRNA 表達(dá)降低 （P＜0.01）； 與氟康唑組比較，氟康唑＋燈臺(tái)葉總堿組RAS1、CYR1、BCR1、ALS2、ALS3、TPK2 mRNA 表達(dá)降低 （P＜0.01），而EFG1 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 菌絲相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.9 添加外源性cAMP 對(duì)燈臺(tái)葉總堿與氟康唑作用于CA23 的影響 如圖7 所示，cAMP 類似物的加入可以減輕部分氟康唑與燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用引起的菌株形態(tài)變化，尤其是在SD 液體培養(yǎng)基中，可以看出添加外源性cAMP 后，氟康唑與燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用組菌菌絲更密集。

圖7 外源性cAMP 對(duì)燈臺(tái)葉總堿與氟康唑作用于CA23 的影響（×20）

3.10 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫饬字富钚缘挠绊?磷脂酶活性分為陰性（Pz ＝1）、極低（Pz ＝0.90 ～0.99）、低 （Pz ＝0.80 ～0.89）、高 （Pz ＝0.70 ～0.79）、極高（Pz ＝0.60 ～0.69）。如表5 所示，CA23 有極高的磷脂酶活性，燈臺(tái)葉總堿處理后并無(wú)明顯變化（P＞0.05），氟康唑處理對(duì)磷脂酶活性有略微抑制作用，但磷脂酶活性依然高（P＜0.05），氟康唑與燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用能降低磷脂酶活性（P＜0.01），且對(duì)燈臺(tái)葉總堿呈現(xiàn)劑量依賴性。

表5 燈臺(tái)葉總堿與氟康唑?qū)A23 胞外磷脂酶活性的影響（x±s，n＝3）

4 討論

燈臺(tái)葉是夾竹桃科雞骨常山屬糖膠樹(shù)的干燥葉［5］，具有鎮(zhèn)痛止咳、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理活性［6］。研究顯示，燈臺(tái)葉提取物對(duì)部分細(xì)菌和真菌均具有良好的抑菌活性［7-8］，還具有一定的抗病毒作用［9］，但對(duì)白念珠菌相關(guān)研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用僅對(duì)白念珠菌氟康唑耐藥株表現(xiàn)出協(xié)同作用，其FICI 在0.006～0.11。

白念珠菌對(duì)唑類耐藥的原因是多方面的［10］，一方面是外排泵活力增強(qiáng)，主要表現(xiàn)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加，如CDR1p、CDR2p、MDR1p［11］； 另一方面是ERG11 基因的過(guò)表達(dá)或突變［12］。本課題組就此進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)燈臺(tái)葉總堿的增敏作用與耐藥基因表達(dá)無(wú)關(guān)，而與毒力因子相關(guān)。

白念珠菌從共生菌轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡w的過(guò)程中伴隨毒力因子的釋放，如粘附素的表達(dá)、生物膜的形成、水解酶的分泌、形態(tài)的改變以及其代謝適應(yīng)性等［13］。白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變是其主要毒力因子之一。白念珠菌能夠在宿主體內(nèi)以酵母、假菌絲和菌絲生長(zhǎng)形式間進(jìn)行可逆轉(zhuǎn)換［14］。通過(guò)菌絲的形成、伸長(zhǎng)、拉伸能最終殺死巨噬細(xì)胞［15］，抵抗免疫系統(tǒng)，增加致病風(fēng)險(xiǎn)。在2 種誘導(dǎo)菌絲生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中均觀察到臨床耐藥株CA23 形成密集、盤繞的菌絲，加入氟康唑和燈臺(tái)葉總堿后，菌絲長(zhǎng)度較短且數(shù)量減少，從而抑制菌絲生長(zhǎng)。

白念珠菌依賴Ras1／cAMP／PKA 信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)形態(tài)轉(zhuǎn)換和毒力特性。缺失RAS1 基因會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)缺陷，同時(shí)降低系統(tǒng)性感染模型小鼠的毒力［16］。而TPK2 基因的缺失，使PKA 活性降低為野生型的10%，伴隨菌絲生長(zhǎng)受阻［17］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子EFG1 及BCR1，在調(diào)節(jié)菌絲方面發(fā)揮重要作用［18］。凝集素樣序列基因家族 （agglutinin-like sequence，ALS）是白念珠菌粘附的主要成員，ALS3 高表達(dá)白念珠菌更易導(dǎo)致對(duì)唑類藥物的耐藥性增加［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟康唑和燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用降低了RAS1、CYR1、TPK2、BCR1、ALS2 和ALS3 mRNA 表達(dá)，但對(duì)EFG1 mRNA表達(dá)的影響與氟康唑單用并無(wú)明顯變化，說(shuō)明兩藥聯(lián)用對(duì)Ras1／cAMP／PKA 通路可能是通過(guò)中央調(diào)控因子BCR1 來(lái)調(diào)節(jié)的。加入db-cAMP，再次驗(yàn)證兩藥聯(lián)用對(duì)菌絲的抑制是通過(guò)Ras1／cAMP／PKA 途徑實(shí)現(xiàn)的。

磷脂酶作為白念珠菌中另一重要的毒力因子，主要通過(guò)分解宿主細(xì)胞膜，增加膜通透性，提高入侵宿主的能力［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，氟康唑和燈臺(tái)葉總堿聯(lián)用對(duì)白念珠菌的抑制作用可能與抑制胞外磷脂酶活性有關(guān)，且抑制效果與燈臺(tái)葉總堿劑量呈正相關(guān)。

綜上所述，燈臺(tái)葉總堿與氟康唑聯(lián)用對(duì)白念珠菌臨床耐藥株表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，其可能是通過(guò)抑制菌絲和磷脂酶活性，調(diào)節(jié)Ras1／cAMP／PKA 途徑影響白念珠菌毒力因子而引起的。這表明燈臺(tái)葉總堿有成為氟康唑增敏劑的潛力，但燈臺(tái)葉總堿對(duì)臨床耐藥株深入的作用機(jī)制及其在體內(nèi)抗真菌的作用機(jī)制還有待研究。