劉 剛，安蘭蘭，周環(huán)娟，付 艷，王瑞鑫，劉育辰，孫慶文，張永萍

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

中藥質(zhì)量是中藥有效性和安全性的反映和表征［1］，目前中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多是通過使用對(duì)照品測(cè)定一種或多種成分的含量評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，而部分對(duì)照品不易獲得，檢測(cè)成本高，且與傳統(tǒng)功效的關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，難以反映中藥質(zhì)量與療效的關(guān)系［2-4］。鑒于此，國(guó)內(nèi)學(xué)者相繼提出了“對(duì)照提取物”［5］、“ 中藥質(zhì)量標(biāo)志物 （ quality markers，Qmarkers）”［6］中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為中藥質(zhì)量控制研究帶來了新思路，已被應(yīng)用于多種中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)［7-9］。對(duì)照提取物法可同時(shí)測(cè)定樣品（包括藥材、中成藥和提取物等）中的多個(gè)指標(biāo)性成分，且可大大降低檢驗(yàn)成本，但其指標(biāo)與功效關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，因此，在確認(rèn)其Q-Marker 的基礎(chǔ)上，以Q-Marker 作為指標(biāo)性成分更為科學(xué)，這種對(duì)照提取物稱為“有效對(duì)照提取物”。

黑骨藤為蘿藦科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥全株［10］，其乙醇提取物乙酸乙酯部位為其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的有效部位［11］，本研究采用藥理學(xué)與化學(xué)相結(jié)合的方法，以黑骨藤為研究對(duì)象，制備其抗RA 的有效對(duì)照提取物，明確其Q-Marker，建立基于有效對(duì)照提取物-中藥質(zhì)量標(biāo)志物模式的黑骨藤質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，嘗試構(gòu)建能體現(xiàn)中醫(yī)藥特色且與臨床療效相關(guān)聯(lián)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式，為進(jìn)一步完善中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀，配置二元梯度泵、高能自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD 檢測(cè)器和色譜工作站（美國(guó)Agilent 公司）； FA2204B 型電子天平（萬分之一，上海天美天平儀器有限公司）； MS205DU 型電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司］； DZ-2BCIV 型真空干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）；TD5A-WS 型離心機(jī) （湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；JE1002 型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）； MNT-150 型數(shù)顯卡尺 （浙江德清信泰電子科技有限公司）；Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）； CX22 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）； RM2235 石蠟切片機(jī)、DM1000 徠卡顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)Leica 公司）。

1.2 試劑與藥物 黑骨藤經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉育辰教授鑒定為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.，具體見表1。雷公藤多苷片（批號(hào)1450003，貴州漢方藥業(yè)有限公司）。新綠原酸（批號(hào)CHB190217）、綠原酸 （批號(hào) BD33230、CHB190121）、隱綠原酸 （批號(hào)CHB180905）、綠原酸甲酯（批號(hào)CHB190117）、異綠原酸B （批號(hào)CHB180923）、異綠原酸A （批號(hào)CHB180921）、異綠原酸C （批號(hào)CHB180925）均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%。PRP-512B 型樹脂（北京聚福樹脂廠）； 牛Ⅱ型膠原溶液（批號(hào)200297）、弗氏完全佐劑（批號(hào)200200）、弗氏不完全佐劑（批號(hào)200336）均購(gòu)于美國(guó)Chondrex 公司。EDTA 脫鈣液（型號(hào)B0317-11，四川楊克斯特科技有限公司）； 7122 蘇木素、伊紅（美國(guó)Thenrmo Fisher Scientific 公司）。乙腈 （色譜純，美國(guó)TEDIA 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20 g），購(gòu)于湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （湘）2019-0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （黔）2021-0005，于室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)20210161）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照提取物制備 取黑骨藤粗粉適量置于圓底燒瓶中，加入25 倍量70%乙醇，加熱回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水混懸，依次用等量石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，各3 次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，真空干燥，即得乙酸乙酯萃取部位。

精密稱取黑骨藤乙酸乙酯萃取部位10 g，加等量PRP-512B 型樹脂拌樣，裝柱。依次用20%、30%、50% 甲醇梯度洗脫，每個(gè)梯度4 000 mL。其中，20% 甲醇洗脫段前1 000 mL 合并為第1 段（a1），中間2 500 mL 合并為第2 段（a2），后500 mL 為第3 段（a3），30%、50% 甲醇洗脫段各自合并，分別為a4、a5。精密稱取a5 段2 g，用等量PRP-512B 型樹脂拌樣，裝柱，依次用20%、30%、50% 甲醇梯度洗脫，各自合并為b1 段、b2 段、b3 段。將以上a2段和b3 段按一定比例合并，即得黑骨藤對(duì)照提取物。

2.2 對(duì)照提取物抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效性驗(yàn)證

2.2.1 造模、分組和給藥 56 只大鼠隨機(jī)選取8 只作為空白對(duì)照組，其余48 只參考文獻(xiàn)［12］方法建立CIA 藥理模型，并隨機(jī)分成6 組，分別為雷公藤多苷（TG）對(duì)照組（10 mg／kg）、模型組、對(duì)照提取物給藥低劑量組（36 mg／kg）、對(duì)照提取物給藥高劑量組（144 mg／kg）、對(duì)照品（按對(duì)照提取物中各成分所占比例混合配制）給藥低劑量組、對(duì)照品給藥高劑量組，每組8 只。各藥物用生理鹽水溶液分散，空白對(duì)照組和模型組給予生理鹽水溶液，給藥體積均為10 mL／kg，灌胃28 d，每天1 次。

2.2.2 一般指標(biāo)檢測(cè) 從造模前1 d 及造模成功后第7 天開始，每7 d 測(cè)量各組大鼠右足趾、左足趾厚度，兩者厚度差值作為腫脹度，并記錄體質(zhì)量變化。

2.2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分 從造模成功后的第7 天開始，每天觀察并詳細(xì)記錄各組大鼠全身的關(guān)節(jié)病變程度，按照5 級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)［13］，將4 個(gè)關(guān)節(jié)的積分進(jìn)行累計(jì)，即為每只大鼠的AI。

2.2.4 血清因子測(cè)定、滑膜病理變化觀察 大鼠給藥第28天后禁食12 h 以上，不禁水，用麻醉劑麻醉，腹主動(dòng)脈取血，迅速將血液于冰浴上靜置30 min，置于離心機(jī)中離心20 min （轉(zhuǎn)速4 000 r／min），取上清液，置于-80 ℃冰箱中備用。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作，大鼠取血后麻醉脫頸處死，去除左后足踝關(guān)節(jié)皮毛，用動(dòng)物骨剪取下踝關(guān)節(jié)，置于4%多聚甲醛中性固定液中固定，常規(guī)脫鈣后包埋組織塊于石蠟中，切成5 μm 薄片，脫蠟后伊紅染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0、Graphpad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行分析及作圖，數(shù)據(jù)以（±s）表示，再進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間兩兩比較采用Tamhance’s T2 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.6 藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6.1 黑骨藤對(duì)照提取物對(duì)CIA 大鼠的影響 （1）對(duì)CIA 大鼠后足足趾厚度的影響。給藥前，與模型組比較，各給藥組對(duì)后足足趾厚度的影響無顯著性差異（P＞0.05），空白對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01），給藥第28 天后仍有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功，模型相對(duì)穩(wěn)定；給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對(duì)照提取物給藥低劑量組、對(duì)照提取物給藥高劑量組對(duì)右后足足趾厚度的影響均有極顯著性差異（P＜0.01）； 同樣給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對(duì)照提取物給藥低劑量組、對(duì)照提取物給藥高劑量組對(duì)左后足足趾厚度的影響也均有極顯著性差異（P＜0.01）。

（2）對(duì)CIA 大鼠AI 值的影響。給藥前，與模型組比較，各給藥組無顯著性差異（P＞0.05）； 給藥第28 天后，與模型組比較，對(duì)照提取物給藥低劑量組、高劑量組和TG組均有極顯著性差異（P＜0.01）； 模型組第0～28 天無顯著性差異（P＞0.05）； 對(duì)照提取物給藥高劑量組在給藥第13天之后有極顯著差異（P＜0.01），TG 組與對(duì)照提取物給藥低劑量組在給藥第20 天后有極顯著性差異（P＜0.01）。

（3）對(duì)CIA 大鼠血清促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響。與模型組比較，對(duì)照提取物給藥低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.01），對(duì)照提取物給藥高劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05），TG 組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05）； 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.01），TG 組TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

2.2.6.2 對(duì)照品對(duì)CIA 大鼠的影響

（1）對(duì)照品對(duì)CIA 大鼠后足足趾厚度的影響。給藥前，與模型組比較，各藥物組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），空白對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01），給藥28 d 后仍有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功，模型相對(duì)穩(wěn)定； 給藥28 d 后，與模型組比較，對(duì)照品低、高劑量組和TG 組對(duì)右后足足趾厚度的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）； 同樣給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對(duì)照品低劑量組、高劑量組對(duì)左后足足趾厚度的影響也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

（2）對(duì)照品對(duì)CIA 大鼠AI 值的影響。給藥前，與模型組比較，各藥物組無明顯差異（P＞0.05）； 給藥第28 天后，與模型組比較，對(duì)照品低劑量組、高劑量組和TG 組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

（3）對(duì)照品對(duì)CIA 大鼠血清促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響。與模型組比較，對(duì)照品低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05），對(duì)照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）； 與TG 組比較，對(duì)照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）；與對(duì)照品低劑量比較，對(duì)照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）； 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.01），TG 組和對(duì)照品低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

2.3 對(duì)照提取物成分含量測(cè)定 采用UPLC 法。

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫 （0 ～3.4 min，7% ～9% B； 3.4 ～5.4 min，9% ～11% B； 5.4 ～7 min，11% ～13% B； 7 ～8.3 min，13% ～13.5% B； 8.3 ～10 min，13.5% ～15% B； 10 ～14.5 min，15% ～15.1% B； 14.5～15 min，15.1% ～16% B；15～17 min，16% ～18% B； 17～21 min，18% ～21% B； 21～23 min，21% ～26% B； 23 ～25 min，26% ～100% B）； 體積流量0.2 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm； 進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品（A）、黑骨藤對(duì)照提取物（B）UPLC 色譜圖

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品新綠原酸5.06 mg、綠原酸25.05 mg、隱綠原酸8.04 mg、綠原酸甲酯5.05 mg，異綠原酸B 5.02 mg，異綠原酸A 5.00 mg，異綠原酸C 7.05 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液①，搖勻，精密吸取1 mL，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液②。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取黑骨藤對(duì)照提取物14 mg，置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇2 mL，超聲處理1 min，冷卻至室溫，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積對(duì)照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系（Ⅰ）

2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 對(duì)照品溶液①在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.07%、0.10%、0.08%、0.09%、0.11%、0.15%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取對(duì)照提取物6 份，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量RSD分別為1.09%、0.34%、0.51%、1.22%、1.10%、1.21%、2.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份，于0、2、4、8、12、20、24 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.35%、0.14%、0.39%、0.28%、2.26%、0.34%、0.20%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定各成分含量已知的對(duì)照提取物6 份，每份7 mg，按100%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 平均加樣回收率 （RSD）分別為102.51%（0.68%）、100.85% （1.27%）、99.05% （1.45%）、97.84%（ 2.37%）、100.33% （ 1.55%）、99.49%（ 1.53%）、97.70% （1.32%）。

2.3.5 樣品含量測(cè)定 取3 批對(duì)照提取物，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量總和分別為51.81%、53.30%、52.46%，表明該方法重復(fù)性良好，可用于制備對(duì)照提取物。

2.4 對(duì)照提取物在黑骨藤質(zhì)量控制中的應(yīng)用

2.4.1 對(duì)照提取物溶液制備 精密稱取黑骨藤對(duì)照提取物40.03 mg，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇2 mL，超聲處理1 min，放冷至室溫，50% 甲醇定容至刻度，搖勻，溶解，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質(zhì)量濃度分別為0.205 0、2.958 8、0.763 3、0.455 2、0.016 8、0.031 3、0.059 2 mg／mL 的溶液A，再分別稀釋10、100、250 倍，作為溶液B、C、D。

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末16.0 g，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備醇提物乙酸乙酯萃取部位（HGT-C），精密稱取25 mg，置于10 mL 量瓶中，2 mL 甲醇溶解并定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 同“2.3.1” 項(xiàng)，色譜圖見圖2。

圖2 對(duì)照提取物（A）、黑骨藤（B）UPLC 色譜圖

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.1” 項(xiàng)下對(duì)照提取物溶液適量，在“2.4.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系（Ⅱ）

2.4.4.2 方法學(xué)考察 表4 顯示，該方法儀器精密度、方法重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均良好，可用于含量測(cè)定。

表4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.5 樣品含量測(cè)定 取12 批藥材，按“2.4.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用對(duì)照提取物法、單體對(duì)照品法計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 藥理實(shí)驗(yàn)研究 通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)黑骨藤對(duì)照提取物和含有7 種咖啡?；鼘幩犷惓煞值膶?duì)照品可有效緩解足趾腫脹，減小關(guān)節(jié)炎評(píng)分，并且有效減少了CIA大鼠血清中的促炎細(xì)胞因子水平，尤其是TNF-α，表明黑骨藤乙酸乙酯部位所含的咖啡?；鼘幩犷惓煞志哂辛己玫目筊A 活性。

3.2 黑骨藤抗RA 質(zhì)量標(biāo)志物辨識(shí) RA 是一種自身免疫性疾病，它導(dǎo)致滑膜組織和關(guān)節(jié)慢性炎癥，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，最終導(dǎo)致殘疾［14］。CIA 模型與人RA 具有共同的免疫學(xué)和病理學(xué)特征，因此常用于新藥或其他治療藥物的初步藥理學(xué)研究［15］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示［16-21］，黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷惓煞志哂休^好的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。本研究通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)照提取物組和咖啡?；鼘幩犷惓煞謱?duì)照品，都具有一定的抗RA 作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了黑骨藤中的7 個(gè)咖啡?；鼘幩犷惓煞质瞧淇筊A 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。黑骨藤有效對(duì)照提取物中7 種咖啡?；鼘幩犷惓煞质呛诠翘僦泄逃械幕瘜W(xué)成分，具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其與黑骨藤抗RA 功效密切相關(guān)，同時(shí)可進(jìn)行定量測(cè)定，均滿足Q-marker 的基本條件。因此，上述7 種咖啡酰基奎寧酸類成分可作為黑骨藤抗RA 的Qmarker。

3.3 含量測(cè)定色譜條件篩選 通過DAD 檢測(cè)器對(duì)7 種成分的單一對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以327 nm 為最大吸收波長(zhǎng)。并對(duì)流動(dòng)相、柱溫、進(jìn)樣量及體積流量進(jìn)行考察。結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸時(shí)色譜峰峰形最好，分離效果最佳； 柱溫為30 ℃時(shí)色譜峰分離度最好； 進(jìn)樣量為1、3 μL 時(shí)色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，2 μL 時(shí)色譜峰峰形最佳；體積流量為0.2 mL／min 時(shí)分離效果好，并且可節(jié)約試劑。3.4 有效對(duì)照提取物法驗(yàn)證 本研究分別采用了對(duì)照提取物法和對(duì)照品法對(duì)黑骨藤中綠原酸等7 種咖啡?；鼘幩犷惓煞诌M(jìn)行了含量測(cè)定分析，結(jié)果顯示2 種方法所得結(jié)果基本一致，說明對(duì)照提取物法可以用于黑骨藤的質(zhì)量控制，檢測(cè)成本更低，方法更簡(jiǎn)單，更符合中藥多成分的特色［22］，同時(shí)也解決了此類成分不穩(wěn)定、難以制備的難題。上述結(jié)果為明確黑骨藤抗RA 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和建立全面科學(xué)的相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了理論基礎(chǔ)。