鄭亞男，蔡 旭，鄧艾平*

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430014； 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，湖北 武漢 430065； 3.清華大學(xué)工程物理系，北京 100084）

荔枝來(lái)源于無(wú)患子科荔枝屬荔枝LitchichinensisSonn.的果實(shí)，其果肉、種子、果殼均具有較高的藥用、食用價(jià)值，為藥食兩用資源［1-2］。荔枝殼性味苦、寒，具有除濕止痢、止血的功效［3］。研究表明，荔枝殼含有豐富的多酚類(lèi)、酚酸、多糖類(lèi)等物質(zhì)［4］，具有抗氧化［5］、抗炎［6］、調(diào)節(jié)免疫［7］等作用。多酚類(lèi)成分是荔枝殼的主要活性成分，被開(kāi)發(fā)為奧力高樂(lè)、糕點(diǎn)、洗發(fā)水等功能食品、日用品。

雙水相體系由2 個(gè)互不相溶的體系組成，利用組分在雙水相體系內(nèi)的分配系數(shù)差異進(jìn)行高效的提取與純化［8］。雙水相提取條件溫和，可保留分子的生物活性，適用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子的提取分離，如聚乙二醇-檸檬酸鈉提取Bacillus subtilis D3d 木聚糖酶［9］、甲醇-麥芽糊精提取醋酸格拉替雷［10］、聚乙二醇-磷酸氫二鉀分離質(zhì)粒DNA［11］等。雙水相體系也常用于提取中藥多糖、活性小分子的研究，如湖北海棠多糖［12］、陳皮黃酮［13］、巴戟天游離蒽醌［14］等。相較于傳統(tǒng)的溶劑提取方法，雙水相提取效率高，活性成分含量高，避免了反復(fù)低效的提取和萃取操作［15］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助雙水相提取荔枝殼多酚，獲得最佳提取工藝，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用荔枝殼資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）； 多功能粉碎機(jī)（皇代電器有限公司）； KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子精密天平（萬(wàn)分之一、十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）； FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī)（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）； Gen Pure 超純水系統(tǒng)（德國(guó)TKA 公司）。

1.2 試劑與藥物 硫酸銨、磷酸二氫鉀、無(wú)水碳酸鈉（純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）； 沒(méi)食子酸、維生素C、水楊酸、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（純度≥98%，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）； 福林酚試劑、胃蛋白酶（純度≥60%，上海源葉生物科技有限公司）； 正丙醇、丙酮，無(wú)水乙醇、鹽酸（分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司）； H2O2（濟(jì)南嘉陽(yáng)化工有限公司）； 磷酸緩沖鹽水溶液、Tris-Hcl 緩沖溶液、蒸餾水為自制。荔枝于2022 年2月購(gòu)于武漢，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為正品，除去果肉及種子，得荔枝殼，經(jīng)清洗凍干、粉碎、過(guò)篩后備用，編號(hào)為L(zhǎng)ZK20220210，保存于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院藥學(xué)部。

2 方法

2.1 雙水相體系制備 稱(chēng)取同質(zhì)量的硫酸銨或磷酸二氫鉀，置于錐形瓶中，按比例加水溶解，逐漸滴加有機(jī)試劑，獲得澄清透明的雙水相體系，見(jiàn)表1。

表1 不同組分雙水相體系組成

2.2 荔枝殼多酚提取 稱(chēng)取荔枝殼粉末M1，置入錐形瓶中，加不同雙水相體系搖勻，超聲提?。üβ?00 W）。將液料比20 ∶1、超聲時(shí)間30 min、提取溫度40 ℃作為初始提取條件，70%乙醇作為對(duì)照組M7，提取完成后過(guò)濾，靜置分層，取上層溶液，凍干后獲得荔枝殼多酚提取物，稱(chēng)重M2。精確稱(chēng)取荔枝殼多酚提取物，置于量瓶中，加水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成樣品溶液，記錄體系體積V。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系、方法學(xué)考察

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取5.0 mg 沒(méi)食子酸對(duì)照品，置于量瓶中，加水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成1.0 mg／mL 原液，精密吸取適量，重復(fù)上述操作，配制成0.1～1.0 mg／mL，冷藏備用。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液分別取0.2 mL，置于24 孔板中，并滴加0.4 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置反應(yīng)6 min，隨后加入1.2 mL 7% Na2CO3溶液，搖勻，避光，靜置反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，測(cè)定溶液的吸光度，波長(zhǎng)760 nm。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度X、吸光度A分別為橫、縱坐標(biāo)，繪制方程A＝2.859 2X＋0.362 6 （R2＝0.992 8），在0.1 ～1.0 mg／mL 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1 份，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法平行測(cè)定6 次，測(cè)得吸光度RSD 為1.52%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液1 份，常溫放置0、2、4、6、8 h 后按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得吸光度RSD 為1.47%，表明在8 h 內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品溶液6 份，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得吸光度RSD 為1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取含量已知的樣品9 份各10 mg，分別加入不同劑量沒(méi)食子酸（0.5、0.75、1.0 mg），分為低、中、高劑量組，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法提取，測(cè)得總多酚加樣回收率、RSD 分別為101%、2.31%。

2.4 雙水相體系選擇 考察不同雙水相體系對(duì)荔枝殼多酚含量、得率的影響，并以荔枝殼多酚得率為主要指標(biāo)。

2.5 單因素試驗(yàn) 選擇ATPS1 作為提取溶劑，按“2.2”項(xiàng)下提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（10% ～50%）、硫酸銨質(zhì)量濃度（0.2 ～0.4 g／mL）、液料比（10 ∶1～30 ∶1）、超聲時(shí)間 （20 ～60 min）、提取溫度 （30 ～70 ℃）對(duì)荔枝殼多酚得率的影響。

2.6 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間作為影響因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3。

表3 因素水平

2.7 荔枝殼多酚含量測(cè)定 按“2.3.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定樣品溶液吸光度，計(jì)算多酚質(zhì)量濃度C、荔枝殼多酚得率Y2、荔枝殼多酚含量，其中M1、M2、V分別為荔枝殼粉末質(zhì)量、荔枝殼多酚提取物質(zhì)量、樣品溶液體積。

2.8 抗氧化活性測(cè)定

2.8.1 DPPH 自由基清除作用 精密稱(chēng)取“2.6” 項(xiàng)下荔枝殼多酚提取物（ATPS7 組）、荔枝殼多酚乙醇提取物（M7 組），制成樣品溶液（質(zhì)量濃度10～1 000 μg／mL），維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照組。采用DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)［16］，測(cè)定雙水相體系提取的荔枝殼多酚抗氧化活性，取上述樣品溶液1.0 mL，分別與2.0 mL DPPH 溶液（0.1 μmol／mL）混勻，避光反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)后的混合溶液置于515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度As，計(jì)算DPPH 清除率I1其中Ab、Ac分別是DPPH 溶液、樣品溶液吸光度。

2.8.2 羥自由基清除作用 取“2.8.1” 項(xiàng)下樣品溶液，測(cè)定雙水相體系提取的荔枝殼多酚抗氧化活性； 取9.0 μmol／mL 水楊酸乙醇溶液、9.0 μmol／mL 硫酸亞鐵溶液、樣品溶液各1.0 mL，混勻后加入1.0 mL H2O2溶液反應(yīng)15 min。將上述反應(yīng)后的混合溶液置于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度As，計(jì)算羥自由基清除率其中Ab、Ac分別空白溶液、樣品溶液吸光度［16］。

2.9 體外模擬消化實(shí)驗(yàn) 采用體外模擬消化方法［17］，取“2.8” 項(xiàng)下10.0 μg／mL 樣品溶液1.0 mL，加入氯化鈉溶液（質(zhì)量濃度10.0 mg／mL）稀釋?zhuān)渭欲}酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5，隨后加入4.0 mL 胃液（0.4 g 胃蛋白酶溶于0.01 mol／L鹽酸溶液中），混勻，在37 ℃、120 r／min 下避光反應(yīng)2 h，12 000 r／min 離心15 min，取上清液，凍干，用于多酚含量、抗氧化活性測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 雙水相體系的選擇 雙水相體系通過(guò)有機(jī)體系和鹽對(duì)水分子的激烈競(jìng)爭(zhēng)，形成雙水相。利用體系與溶質(zhì)的表面性質(zhì)、電荷、離子鍵等作用，破壞了溶劑效應(yīng)，使得活性成分可在兩相體系中進(jìn)行高效的溶出與分配，達(dá)到快速提取分離的效果［18-19］。因此，不同類(lèi)型有機(jī)相和無(wú)機(jī)鹽組成的雙水相體系具有不同的物理化學(xué)特性，可選擇性提取，提高活性成分得率及其含量。如圖1 所示，不同類(lèi)型ATPS對(duì)荔枝殼多酚的得率不同，其得率和含量均高于70%乙醇。乙醇-硫酸銨體系提取荔枝殼多酚得率最高為6.43%，多酚含量為88.1%； 70%乙醇提取荔枝殼多酚得率僅為4.31%，多酚含量為19.1%。荔枝殼多酚水溶性較強(qiáng)，丙酮對(duì)其提取能力有限。丙酮-磷酸二氫鉀體系荔枝殼多酚得率為4.72%，多酚含量為46.5%。因此，選擇乙醇-硫酸銨體系作為提取荔枝殼多酚的提取體系。

圖1 不同雙水相體系對(duì)荔枝殼多酚得率、含量的影響

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荔枝殼多酚得率的影響 乙醇作為有機(jī)相，是乙醇-硫酸銨雙水相體系重要的組成部分。乙醇分子含有的親水基團(tuán)，可與水無(wú)限互溶。然而，乙醇分子與無(wú)機(jī)鹽離子間的排斥作用，可競(jìng)爭(zhēng)性均衡鹽離子和水分子之間的靜電作用，促使體系分層［20］。因此，適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)是乙醇-硫酸銨雙水相體系形成分相的必要條件。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，乙醇分子與鹽離子間的斥力無(wú)法平衡乙醇分子與水分子的親和力，電勢(shì)差較小，使得體系體系無(wú)法分相。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，上相脂溶性增加，極性減小，會(huì)降低對(duì)水溶性成分多酚的提取率［21］。如圖2 所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10% 時(shí)，體系無(wú)法分相；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加枝殼多酚得率呈先增加后迅速降低的趨勢(shì)，最高為7.2%，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荔枝殼多酚得率的影響

3.2.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)荔枝殼多酚得率的影響 硫酸銨易溶于水，主要以離子形式，存在于乙醇-硫酸銨雙水相體系的下相。硫酸根離子、銨離子與乙醇分子對(duì)水分子存在激烈競(jìng)的關(guān)系，并與乙醇分子產(chǎn)生靜電作用，易使體系體系分層［20］。然而，當(dāng)鹽離子濃度過(guò)高時(shí)，無(wú)機(jī)鹽飽和析出，無(wú)法發(fā)揮促進(jìn)分相的作用，浪費(fèi)資源； 同時(shí)，高濃度鹽離子使得下相極性增加，使水溶性荔枝殼多酚更多的溶解于下相［22］。因此，合適的硫酸銨質(zhì)量濃度有利于乙醇-硫酸銨雙水相體系提取、富集荔枝殼多酚。如圖3 所示，隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加荔枝殼多酚得率呈先增加后略微降低的趨勢(shì)，最高為7.7%，故選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為0.3 g／mL。

圖3 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)荔枝殼多酚得率的影響

3.2.3 液料比對(duì)荔枝殼多酚得率的影響 植物細(xì)胞壁含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、果膠等，具有較好的韌性和延展性。當(dāng)提取溶劑過(guò)少，原料偏多，組織細(xì)胞無(wú)法充分吸收體系產(chǎn)生溶脹、破裂，使活性成分溶出、得率降低。當(dāng)提取體系較多時(shí)，體系的提取能力未能充分挖掘，浪費(fèi)溶劑，又易促使多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)的溶出［23］。因此，溶劑的提取能力是有限的。通過(guò)優(yōu)化液料比提升中藥活性成分得率，是充分利用中藥資源的重要手段。如圖4 所示，隨著液料比增加荔枝殼多酚得率呈先快速增加后降低的趨勢(shì)，最高為7.2%，故選擇液料比為20 ∶1。

圖4 液料比對(duì)荔枝殼多酚得率的影響

3.2.4 超聲時(shí)間對(duì)荔枝殼多酚得率的影響 超聲是一項(xiàng)可破壞細(xì)胞壁的技術(shù)，將其與雙水相提取技術(shù)有機(jī)結(jié)合，有利于中藥成分的提取與富集，如陳皮黃酮［13］、橘紅花總黃酮［21］、吊石苣苔黃酮［23］。但是，花青素、沒(méi)食子酸、兒茶素作為荔枝殼多酚的活性成分，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，受熱易分解［24］。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)消耗大量的能量，促使荔枝殼多酚成分分解，降低多酚得率［4］。如圖5 所示，隨著超聲時(shí)間增加荔枝殼多酚得率呈先大幅增加后緩慢降低的趨勢(shì)，最高為7.5%，故選擇超聲時(shí)間為40 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)荔枝殼多酚得率的影響

3.2.5 提取溫度對(duì)荔枝殼多酚得率的影響 提取溫度可加劇分子熱運(yùn)動(dòng)，有利于活性成分充分溶出。然而，乙醇作為是乙醇-硫酸銨雙水相體系的有機(jī)相，易揮發(fā)，過(guò)高的提取溫度不利于其提取。同時(shí)，過(guò)高的提取溫度也加快了花青素、沒(méi)食子酸、兒茶素等不穩(wěn)定荔枝殼多酚的分解［24］。另外，在雙水相成相點(diǎn)附近，溫度對(duì)雙水相體系的相圖、提取能力的影響較顯著。因此，選擇合適的提取溫度是必要的考慮因素。如圖6 所示，隨著提取溫度增加荔枝殼多酚得率呈先快后慢的增加趨勢(shì)，但超過(guò)60 ℃時(shí)快速下降，最高為7.8%，故選擇提取溫度為50 ℃。

圖6 提取溫度對(duì)荔枝殼多酚得率的影響

3.3 響應(yīng)面法 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）作為影響因素，荔枝殼多酚得率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共17 組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析

利用Design-expert 12.0 軟件對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，得方程為Y＝35.3＋0.85A＋0.74B＋0.76C-0.025AB＋0.17AC＋0.7BC-2.03A2-2.35B2-2.25C2，其中A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2影響顯著（P＜0.05），AC影響不顯著（P＞0.05）。由表5 可知，模型P＜0.01，失擬項(xiàng)P失擬項(xiàng)＞0.05，F(xiàn)失擬項(xiàng)＞0.5，表明模型具有高度顯著性，擬合度較好； 回歸系數(shù)R2＝0.985 1，Radj2＝0.965 9，表明模型可用于預(yù)測(cè)分析； 各因素影響程度依次為液料比（B）＞超聲時(shí)間（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖7。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）響應(yīng)面圖

最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)30.91%，料液比21.01 ∶ 1，超聲時(shí)間41.69 min，荔枝殼多酚得率為8.72%，考慮實(shí)驗(yàn)可操作性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)31%，料液比22 ∶1，超聲時(shí)間42 min，即ATPS7 組。在上述最優(yōu)工藝下，ATPS7 組荔枝殼多酚得率為8.54%，近似于預(yù)測(cè)值8.72%，遠(yuǎn)高于M7 組乙醇提取的荔枝殼多酚得率4.31%。多酚含量測(cè)定顯示，ATPS7 組荔枝殼多酚含量為88.2%，遠(yuǎn)高于M7 組多酚含量16.8%，表明該模型適用于荔枝殼多酚提取，乙醇-硫酸銨雙水相體系是提取荔枝殼多酚的有效溶劑體系。

3.4 抗氧化活性測(cè)定 荔枝殼多酚是荔枝殼提取物主要活性成分，具有良好的抗氧化［5］、抗炎［6］、調(diào)節(jié)免疫［7］等生物活性，常用于護(hù)膚、美白、抗衰老等。體外抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖8 所示，ATPS7 組、M7 組清除DPPH 自由基半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為33.8、236.2 μg／mL，清除羥自由基IC50分別為23.4、65.2 μg／mL，表明ATPS7 組荔枝殼多酚抗氧化活性更強(qiáng)。

圖8 ATPS 組、M7 組體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 體外消化試驗(yàn) 荔枝殼多酚的成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性較差，易受溫度、氧氣、酸堿等因素破壞，從而失去活性。經(jīng)體外消化后，ATPS7 組、M7 組多酚含量分別為51.9%、12.6%，降低了41.5%、25.0%。體外抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖9 所示，ATPS7 組、M7 組清除DPPH 自由基IC50分別為51.8、139.5 μg／mL，清除羥自由基IC50分別為30.4、48.7 μg／mL，表明相對(duì)于M7 組荔枝殼多酚，經(jīng)體外消化后ATPS7 組荔枝殼多酚的含量與活性顯著降低，即其不穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖9 體外模擬消化后ATPS 組、M7 組抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

雙水相體系是一種新型提取方法，條件溫和，操作簡(jiǎn)單，提取效率高，避免了反復(fù)低效的萃取過(guò)程。然而，中藥活性成分的提取易受多種因素影響，如溶劑類(lèi)型、液料比、提取溫度、時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)制備了6 種不同的雙水相體系用于提取荔枝殼多酚，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取效果最佳，故將其作為荔枝殼多酚的提取溶劑。Box-Behnken響應(yīng)面法是一種多因素非線(xiàn)性試驗(yàn)條件優(yōu)選方法，可評(píng)估多因素的非線(xiàn)性影響，有效地篩選多因素間的最優(yōu)組合，預(yù)測(cè)能力優(yōu)越。結(jié)果顯示，最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)31%，料液比22 ∶1，超聲時(shí)間42 min，荔枝殼多酚得率為8.54%，多酚含量達(dá)88.2%。與常規(guī)的乙醇提取方法比較，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取荔枝殼多酚操作簡(jiǎn)單，效率高，且多酚含量高，不需繁瑣的純化富集過(guò)程［25］。

荔枝殼多酚含有花青素、沒(méi)食子酸、兒茶素等成分，活性強(qiáng)，但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易分解從而失去活性［4，24］。荔枝殼多酚的應(yīng)用前景與多酚的穩(wěn)定性、消化前后的抗氧化活性密切相關(guān)?？寡趸钚越Y(jié)果顯示，乙醇-硫酸銨雙水相體系提取的荔枝殼多酚DPPH、羥自由基IC50分別為33.8、23.4 μg／mL； 經(jīng)體外消化后，其DPPH、羥自由基IC50分別為51.8、35.4 μg／mL，多酚含量為51.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然乙醇-硫酸銨雙水相提取的荔枝殼多酚結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定更顯著，但多酚含量高，抗氧化活性更佳，優(yōu)于乙醇提取的荔枝殼多酚。綜上所述，采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取荔枝殼多酚是一種高效快速的提取方法，有利于荔枝殼多酚的提取純化，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用荔枝資源。