張喜利，梁慧慧，劉文龍*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

新傷濕敷液由鉆骨風(fēng)、虎杖、紅花、白芍、黃芪、鐵箍散、千年健、尋骨風(fēng)、見風(fēng)消、小血藤等飲片組成，其療效顯著。本復(fù)方制劑是其乙醇浸提液制得的液體制劑，用濕藥液紗布敷于患處，可明顯減輕患者腫脹疼痛和縮短圍手術(shù)期。新傷濕敷液的傳統(tǒng)提取工藝為是采用75%乙醇浸漬20 d，此法效率低，且高醇度可能導(dǎo)致部分患者皮膚過敏。因此，提高產(chǎn)品生產(chǎn)效率、降低隱患十分重要。

采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念對(duì)制劑處方工藝進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，可管理最終產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，提高生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本［1-2］，它以目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量特性描述為起點(diǎn)，對(duì)藥物質(zhì)量特性、有效性深入研究分析［3］。結(jié)合熵權(quán)結(jié)合變異系數(shù)法權(quán)衡浸膏得率與6 種有效成分含量指標(biāo)，用以評(píng)價(jià)指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度和沖突性為基礎(chǔ)，確定各指標(biāo)的客觀權(quán)數(shù)［4-5］，同時(shí)采用魚骨圖分析法對(duì)影響新傷濕敷液醇提工藝的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的各類因素進(jìn)行分析，篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)，最后再擬合Box-Behnken 設(shè)計(jì)，篩選出最優(yōu)新傷濕敷液醇提工藝［6］，以期為其臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置Agilent 1260 型色譜分析工作站、UV 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；DZF-6020B 型真空干燥箱 （廣東宏展科技有限公司）；DZTW 電子調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有效公司）； RHP-400 型中藥粉碎機(jī)（永康市榮浩工貿(mào)有限公司）； 15B243 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； SHZ-DⅢ型真空式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑與藥物 鉆骨風(fēng)、虎杖、紅花等復(fù)方飲片均由湖南省常德市第一中醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院炮制教研室石繼連教授鑒定為正品。兒茶素、大黃素、原兒茶酸、羥基紅花黃色素、五味子醇甲對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào) P02A9F57645、T02S8F42983、H21J9Z64031、R03J10F77660、Y14F10H80840，上海源葉生物科技有限公司）； 馬兜鈴酸A 對(duì)照品（批號(hào)110746-201309，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純 （美國(guó)天地公司）； 無水乙醇為分析純（湖南匯虹試劑有限公司）； 水為純凈水［華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）； 流動(dòng)相0.1% 磷酸 （A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，1% ～10%B； 3～6 min，10%B；6～9 min，10% ～25% B； 9 ～12 min，25% B； 12 ～15 min，25% ～40%B； 15～18 min，40%B； 18 ～21 min，40% ～50%B； 21～24 min，50% ～60% B； 24 ～27 min，60% ～10% B；27～30 min，10%B）； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)210、254、300 nm； 進(jìn)樣量1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 供試品（A）、對(duì)照品（B）溶液HPLC 色譜圖

2.1.2 供試品溶液制備 取新傷濕敷液復(fù)方藥材30 g，研成較細(xì)粉末，用布袋包裝后，將藥物浸泡于75% 乙醇中（料液比1 ∶8），在干燥室溫環(huán)境條件下放置7 d，以上操作反復(fù)2 次，取2 次浸泡液合并混合，得新傷濕敷液浸提液樣品溶液。將樣品溶液濃縮揮近干后置入干燥箱中，60 ℃恒溫干燥至恒定質(zhì)量得干浸膏。取0.050 g 干浸膏，使用色譜甲醇溶解并稀釋至0.010 g／mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，備用。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 分別取6 種對(duì)照品各約2 mg，精密稱定后用甲醇定容至10.0 mL，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時(shí)間RSD 為0.552% ～1.296%，峰面積RSD 為3.118% ～7.908%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2” 項(xiàng)下同一供試品溶液適量，于1、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時(shí)間RSD 為0.079% ～0.327%，峰面積RSD 為0.177% ～9.974%，表明溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批新傷濕敷液復(fù)方6 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素色譜峰保留時(shí)間RSD 為0.684% ～1.506%，峰面積 RSD 為0.568% ～9.228%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取新傷濕敷液提取液1 mL，分別精密加入原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素對(duì)照品溶液適量，加乙醇定容至10 mL，平行制備9 份，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算回收率。結(jié)果，原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸A、大黃素平均加樣回收率分別為 99.88%、100.34%、99.53%、100.24%、99.75%、100.72%，RSD 分別為 1.43%、1.04%、1.42%、1.36%、1.82%、1.05%。

2.2 含量測(cè)定 精密稱取已干燥至恒定質(zhì)量的干浸膏0.050 g，甲醇溶解并稀釋定容至5.0 mL，即得浸膏含量為0.010 g／mL 的供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到各供試品溶液的HPLC 色譜圖。結(jié)合6 種混合對(duì)照品的HPLC 色譜圖，分析其相對(duì)保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積，即可計(jì)算出樣品中有效成分的含量。

2.3 浸膏得率測(cè)定 精密稱取新傷濕敷液復(fù)方藥粉適量，使用乙醇回流提取法進(jìn)行提取，得到相應(yīng)的醇提液，將此醇提液使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去溶劑至濃稠液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿（已干燥至恒定質(zhì)量）中，將此蒸發(fā)皿置入真空干燥箱，60 ℃恒溫干燥至恒定質(zhì)量，將其冷卻至室溫后迅速精密稱定，得干浸膏質(zhì)量，然后計(jì)算浸膏得率，公式為浸膏得率＝ （干浸膏質(zhì)量／新傷濕敷液復(fù)方藥粉質(zhì)量）×100%。

2.4 熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重系數(shù) 熵權(quán)法是一種客觀賦權(quán)方法，在具體使用過程中，根據(jù)各指標(biāo)數(shù)據(jù)的分散程度，利用信息熵計(jì)算出各指標(biāo)的熵權(quán)，再對(duì)熵權(quán)進(jìn)行一定的修正，從而得到較為客觀的指標(biāo)權(quán)重。根據(jù)公式（1）進(jìn)行無量綱處理，其中Xab是在第a次實(shí)驗(yàn)中b指標(biāo)試驗(yàn)值，mb為該組指標(biāo)中的最小值，Mb為該組指標(biāo)中的最大值。再根據(jù)公式（2）建立偏離度矩陣P，其中n為成分?jǐn)?shù)量； 根據(jù)公式（3）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)信息熵e； 根據(jù)公式（4）計(jì)算信息效用值；最后根據(jù)公式（5）將信息效用值歸一化，即可獲得各指標(biāo)的熵權(quán)W1，W1b為第b項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，m為試驗(yàn)指標(biāo)個(gè)數(shù)。

2.5 變異系數(shù)法計(jì)算權(quán)重系數(shù) 根據(jù)公式（6）（7）計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重W2，其中Sb是第b個(gè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，xab為第b個(gè)指標(biāo)中的每1 個(gè)，是第b個(gè)指標(biāo)的平均值。

2.6 熵權(quán)變異系數(shù)法耦合權(quán)重系數(shù) 根據(jù)最小信息熵原理，將通過傳統(tǒng)熵權(quán)法、變異系數(shù)法分別計(jì)算得到的權(quán)重進(jìn)行耦合，根據(jù)拉格朗日乘子法［7］，按照公式（8）計(jì)算組合權(quán)重W。

2.7 QTPP 分析 以QbD 理念中的產(chǎn)品研發(fā)思路為指導(dǎo)，確定一些影響力較大的質(zhì)量屬性為關(guān)鍵質(zhì)量屬性。用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估魚骨圖法探究可能影響新傷敷濕液的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)因素，主要包括設(shè)備、環(huán)境和人員等不可控風(fēng)險(xiǎn)因素以及物料、處方配比和制備工藝等可控因素，初步對(duì)各因素潛在風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行定性評(píng)估和標(biāo)記，見圖2。

圖2 新傷敷濕液工藝質(zhì)量關(guān)鍵因素魚骨圖

2.8 頭腦風(fēng)暴法試驗(yàn)篩選關(guān)鍵影響因素 通過對(duì)新傷敷濕液混懸液處方及制備工藝的分析，以料液比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、藥材粒度（X3）、藥材成分（X4）、堆積密度（X5）、提取次數(shù)（X6），提取時(shí)間（X7）、提取溫度（X8）為考察對(duì)象，以6 種有效成分含量與浸膏量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用頭腦風(fēng)暴法篩選出對(duì)新傷敷濕液性質(zhì)影響較顯著因素考察，本實(shí)驗(yàn)以提取時(shí)間，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以6 種有效成分含量及浸膏得率為因變量，篩選最優(yōu)乙醇提取的工藝參數(shù)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行無量綱標(biāo)準(zhǔn)化處理，公式為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)＝ ［（實(shí)測(cè)值-最低值）／ （最高值-最低值）］×100； 然后采用熵權(quán)變異系數(shù)法耦合權(quán)重系數(shù)計(jì)算6 種有效成分和浸膏得率的權(quán)重系數(shù)，以此評(píng)價(jià)新傷濕敷液醇提各工藝的優(yōu)劣。

2.9 單因素試驗(yàn)

2.9.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，分別加入60%、70%、80%、90%乙醇，料液比1 ∶10，提取時(shí)間1 h，按“2.8” 項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果得70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的綜合評(píng)分最高，故將乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

2.9.2 提取時(shí)間 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，加入70%乙醇，料液比1 ∶10，提取時(shí)間分別為1、2、3、4 h，按“2.8” 項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果得提取時(shí)間2 h 的綜合評(píng)分最高，故將提取時(shí)間1、2、3 h 作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

2.9.3 料液比 按新傷濕敷液處方配比稱取擬醇提的藥物30 g，加入70% 乙醇，料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20，提取時(shí)間1 h，按“2.8” 項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果得料液比1 ∶20 的綜合評(píng)分最高，故將料液比1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

2.10 Box-Behnken 響應(yīng)面法 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為影響因素，原兒茶酸、兒茶素、羥基紅花黃色素、五味子醇甲、馬兜鈴酸、大黃素含量及浸膏得率的綜合評(píng)分（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert 8.0 軟件［9］對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得方程為Y＝89.53-6.23A＋5.68B＋3.81C＋2.11AB-1.74AC＋2.51BC- 10.15A2- 3.63B2- 2.89C2，方差分析［10-11］見表3。由此可知，模型F＝7.28，P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型穩(wěn)定；R2＝0.903 5，＝0.779 4，表明該模型能解釋77.94%響應(yīng)值變化，擬合程度較好，可用于分析預(yù)測(cè)； 各因素影響程度依次為A＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間。響應(yīng)面分析［11］見圖3～5。

表3 方差分析

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（C）對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖5 提取時(shí)間（B）、料液比（C）對(duì)綜合評(píng)分的影響

最終確定，最優(yōu)工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)67%，提取時(shí)間3 h，料液比1 ∶26，綜合評(píng)分為95.94 分。取3 批樣品，按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行醇提，測(cè)得平均綜合評(píng)分為94.81 分，RSD 為2.51%，與理論值95.94 分接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于新傷濕敷液的臨床制備［12-14］。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì) （QbD）理念結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法，通過考察新傷濕敷液復(fù)方的浸膏得率及有效成分的含量，優(yōu)化了新傷濕敷液的工藝［15］。由于評(píng)價(jià)指標(biāo)多，選擇熵權(quán)-變異系數(shù)法，使評(píng)價(jià)結(jié)果更具協(xié)調(diào)性、兼容性和科學(xué)性［16-17］。在對(duì)浸膏得率及有效成分含量影響較大的3 個(gè)因素中，乙醇體積分?jǐn)?shù)是主要的影響因素，其次是料液比，在考察乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)的單因素實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，提取得新傷濕敷液較為濃稠，猜測(cè)多為揮發(fā)油和酯類等成分，因新傷濕敷液使用時(shí)為紗布濕敷，而人體的皮膚角質(zhì)層是類脂質(zhì)分子形成的多層脂質(zhì)雙分子層［18-19］，結(jié)構(gòu)致密，無血管和淋巴管，故能有效透皮吸收的藥物成分主要為揮發(fā)油和酯類［20］，但90%乙醇提取效率較低，其浸膏得率和有效成分含量較低，而70%乙醇提取的藥液雖較為稀薄，但其浸膏得率和有效成分的含量較高，而且其與揮發(fā)油協(xié)同在一起發(fā)揮較強(qiáng)的透皮吸收的功效，故權(quán)衡多種因素，選用70%乙醇提取作為醇濃度單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

在考察料液比的單因素實(shí)驗(yàn)中，相同的提取液濃度和提取時(shí)間下，料液比越高，所提取得浸膏及有效成分越高。但料液比越高，對(duì)生產(chǎn)工藝的要求及生產(chǎn)所耗費(fèi)的成本越高，故綜合多因素考慮，僅選用1 ∶20 料液比作為單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件。而經(jīng)過Design-Expert 8.0 軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得到的最優(yōu)工藝中料液比為1 ∶26。在生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本允許的情況下，可考慮通過增加料液比，獲得更好的提取效率。