田明鑫，倪昌榮，周洪亮，余江毅*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029）

糖尿病腎病是糖尿病導(dǎo)致終末期腎臟病、心血管死亡的主要原因之一［1-2］，本病發(fā)病初期較隱匿，至中后期出現(xiàn)大量蛋白尿、腎功能衰竭等［3-4］。昆葵保腎方為江蘇省名中醫(yī)余江毅教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃蜀葵花、火把花根、黃芪、酒萸肉組成，具有減輕蛋白尿、保護(hù)腎功能、逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病等作用，但本方還停留在臨床應(yīng)用階段，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)，故將其開(kāi)發(fā)成醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑。

目前，中藥提取工藝研究以選擇指標(biāo)成分含量較高的工藝參數(shù)為主，并未與臨床湯劑進(jìn)行比較，后者經(jīng)多年臨床應(yīng)用證實(shí)了其安全性、有效性，但一味地追求某一含量較高的工藝參數(shù)則忽略了中藥多成分之間的協(xié)同作用，并且往往采用砂鍋、陶罐進(jìn)行煎煮，其工藝參數(shù)無(wú)法直接應(yīng)用于多功能提取罐等工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備，故實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代提取工藝與傳統(tǒng)制法的質(zhì)量一致性是中藥制劑開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵［5-8］。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化昆葵保腎顆粒提取工藝，以期為該制劑研發(fā)提供參考依據(jù)、技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； BP-211D 電子分析天平 （德國(guó)賽多利斯公司）；SK6200H 超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 所有對(duì)照品均購(gòu)于南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，純度均≥98%，其中金絲桃苷批號(hào)220522，異槲皮苷批號(hào)220317，棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷批號(hào)220421，表兒茶素批號(hào)220421，毛蕊異黃酮批號(hào)220405，毛蕊異黃酮葡萄糖苷批號(hào)220509，芒柄花苷批號(hào)220314，芒柄花黃素批號(hào)220314，莫諾苷批號(hào)220510，馬錢苷批號(hào)220412。黃蜀葵花 （批號(hào)220805，產(chǎn)地安徽）、酒萸肉（批號(hào)220801，產(chǎn)地河南）均購(gòu)于馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，火把花根（批號(hào)20220901-01，產(chǎn)地云南）、黃芪（批號(hào)20220801-01，產(chǎn)地甘肅）均購(gòu)于貴州同德藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院主任中藥師劉志輝鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 及地方標(biāo)準(zhǔn)要求。乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 臨床湯劑制備 依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》［9］及江蘇省中醫(yī)院草藥煎服須知，按處方比例稱取黃蜀葵花30 g、火把花根15 g、黃芪30 g、酒萸肉10 g，第一煎加水超過(guò)液面3～5 cm，浸泡30 min，煮沸后小火煎煮30 min； 第二煎加水至藥面，煮沸后小火煎煮20 min，紗布趁熱過(guò)濾，合并2 次煎液，混勻，即得。

2.2 指標(biāo)成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，7%A； 5 ～22 min，7% ～17%A； 22 ～40 min，17% A； 40 ～55 min，17% ～60% A； 55 ～60 min，60% ～80%A； 60～70 min，80%A）； 體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，得到金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花黃素、莫諾苷、馬錢苷對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.404、0.400、0.350、0.396、0.411、0.354、0.406、0.407、0.400、0.405 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得 （各成分質(zhì)量濃度分別為27.742、15.520、34.645、6.178、0.122、2.195、0.811、0.070、15.185、8.347 μg／mL）。

2.2.3 供試品溶液制備 取臨床湯劑、各試驗(yàn)號(hào)樣品各1 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品、對(duì)照品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，對(duì)照品、供試品溶液在同一保留時(shí)間內(nèi)有對(duì)應(yīng)成分色譜峰，并且與相鄰峰之間的分離度較好（均大于1.5），表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇依次稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3” 項(xiàng)下臨床湯劑適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為1.40%、0.37%、1.94%、0.96%、0.36%、0.37%、0.30%、1.16%、2.02%、2.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3” 項(xiàng)下臨床湯劑適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為

2.15%、1.06%、2.03%、0.67%、0.84%、1.65%、1.09%、1.02%、2.81%、2.52%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積RSD 分別為2.17%、1.13%、1.83%、1.33%、0.93%、1.77%、1.58%、1.29%、2.11%、2.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取臨床湯劑0.5 mL，共6 份，按100%水平加入對(duì)照品，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、表兒茶素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素平均加樣回收率分別為96.69%、96.18%、100.33%、99.63%、104.46%、100.79%、102.97%、100.23%、100.92%、100.10%，RSD 分別為2.42%、1.37%、2.18%、2.42%、1.49%、1.92%、2.02%、2.51%、2.29%、2.24%。

2.3 干膏率測(cè)定 取適量提取液至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱中干燥3 h 至恒重，再放到干燥器中冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率，公式為干膏率＝ ［（浸膏質(zhì)量×樣品總體積）／ （飲片質(zhì)量×取樣量）］×100%。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn) 影響提取效果的主要因素包括加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)［10］，其中提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不宜作為Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化的考察因素，故根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況固定為2 次［11］。本實(shí)驗(yàn)以加水量（6、8、10、12 倍）、浸泡時(shí)間（0、20、40、60 min）、提取時(shí)間（30、45、60、75 min）為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定各指標(biāo)成分含量、干膏率，計(jì)算其綜合評(píng)分，其中為第n（n＝1，2，3，…，17）個(gè)試驗(yàn)樣品的i指標(biāo)（指標(biāo)成分含量、干膏率）與X實(shí)驗(yàn)組i指標(biāo)的比值，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，隨著加水量增加綜合評(píng)分呈升高趨勢(shì)，10 倍后趨于平緩，故以10 倍量水為中心點(diǎn)； 隨著浸泡、提取時(shí)間延長(zhǎng)綜合評(píng)分呈升高-平緩-降低的趨勢(shì)，從實(shí)際生產(chǎn)中的節(jié)能省時(shí)角度出發(fā)，以20 min 為浸泡時(shí)間中心點(diǎn)，45 min 為提取時(shí)間中心點(diǎn)。

圖2 加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C）單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)2 次，以加水量（A）、提取時(shí)間（B）、浸泡時(shí)間（C）為影響因素，綜合評(píng)分（M）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 13.0 軟件建立三因素三水平試驗(yàn)［12］，因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

將表3 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Design-Expert 12.0 軟件進(jìn)行多元二次回歸擬合，得方程為M＝1.430 0-0.049 9A-0.139 3B-0.008 4C-0.103 7AB-0.054 0AC＋0.255 7BC-0.598 7A2-0.323 9B2-0.563 2C2（R2＝0.985 6），方差分析見(jiàn)表4。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度較高，誤差較小，可用于預(yù)測(cè)分析； 因素B、BC、A2、B2、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3。由此可知，沿B 軸的坡度與沿A軸的相比較陡，表明提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響比加水量大； 沿A 軸的坡度略陡于沿C 軸的，表明與浸泡時(shí)間相比加水量對(duì)綜合評(píng)分的影響稍大； 沿B 軸的坡度大于沿C 軸的，表明提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響大于浸泡時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致。采用Design-Expert 12.0 軟件，得到最優(yōu)工藝為加水量9.96 倍，煎煮時(shí)間41.46 min，浸泡時(shí)間18.80 min，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需求，將其修正為加水量10 倍，煎煮時(shí)間40 min，浸泡時(shí)間20 min，綜合評(píng)分為1.447 分。

圖3 各因素響應(yīng)面圖

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.4” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備3 批樣品，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，平均綜合評(píng)分為1.452 分，與預(yù)測(cè)值（1.447 分）接近（相對(duì)誤差＜1.0%），表明該工藝穩(wěn)定可靠，模型預(yù)測(cè)性良好。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)前期文獻(xiàn)調(diào)研及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，明確了昆葵保腎顆粒中10 種與糖尿病腎病密切相關(guān)的指標(biāo)成分，其中黃蜀葵花中棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金絲桃苷、異槲皮苷可通過(guò)抑制NADPH／ROS／ERK 信號(hào)通路來(lái)改善大鼠腎小管間質(zhì)纖維化［13-14］； 王麗娟等［15］研究表明，火把花根片可升高HGF 水平，下調(diào)TGF-β1 水平； 黃芪中毛蕊異黃酮可顯著下調(diào)DKD 小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β 表達(dá)；芒柄花黃素可增加T2DM 大鼠腎組織SIRT1 表達(dá)，減輕腎臟損害［16-17］； 沈紅勝等［18-19］發(fā)現(xiàn)，馬錢苷、莫諾苷可降低RAGE 蛋白表達(dá)，抑制NF-κB 表達(dá)。然后，采用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行200～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，考察各成分色譜峰數(shù)目、峰形、分離度等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)?40 nm 左右均有較好吸收，并且峰形較好，故選擇240 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

Box-Behnken 響應(yīng)面法將體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù)，通過(guò)圖形技術(shù)顯示函數(shù)關(guān)系，可直觀選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最佳條件［20-21］。目前，采用響應(yīng)面法考察中藥復(fù)方提取工藝時(shí)選取的指標(biāo)較少，難以反映中藥多成分內(nèi)在本質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)將各成分含量及干膏率共同納入綜合評(píng)分，更能反映中藥多成分相互協(xié)同發(fā)揮藥效的內(nèi)在本質(zhì)。

4 結(jié)論

目前，對(duì)中藥提取工藝的研究大多采用均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)等方法，對(duì)浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行多因素、多水平分析，從而優(yōu)化指標(biāo)成分較多的工藝，雖然能增加提取效率，但難以保證臨床湯劑與制劑質(zhì)量的一致性及臨床使用的安全性、有效性。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化昆葵保腎顆粒提取工藝，可最大程度地與臨床湯劑昆葵保腎方保持一致，并且所用的Box-Behnken 響應(yīng)面法穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好，可為該制劑進(jìn)一步研發(fā)提供參考依據(jù)、技術(shù)支持，也能為后續(xù)其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑提取工藝優(yōu)化提供思路。