鄭振秋，鞏長(zhǎng)芹，張 雪，孫 倩，官玉靜

（臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276000）

荊防顆粒由荊芥、防風(fēng)、獨(dú)活、羌活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草11 味中藥組成，源自《攝生眾妙方》 中的荊防敗毒散［1］，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕的功效，主要用于治療感冒風(fēng)寒、頭痛身痛、惡寒無(wú)汗、鼻塞流涕、咳嗽［2］。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第二冊(cè)）》，但只有性狀項(xiàng)、顆粒劑檢查項(xiàng)，缺乏對(duì)有效成分的控制。目前，已有文獻(xiàn)［3-7］對(duì)荊防顆粒中部分成分進(jìn)行定性、定量分析，但尚未涉及多成分。

HPLC-MS／MS 法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)［8］，已廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方制劑所含成分的分析［9-19］。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》 一部［20］要求，采用該方法同時(shí)測(cè)定荊防顆粒中胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Triple QuadTM4500 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、ESI 離子源、Analyst software 儀器操作軟件、SCIEX OS 數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB Sciex 公司）；XS205 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

胡薄荷酮 （ 批號(hào) 111706-201907，純度99.8%）、升麻素苷 （批號(hào)111522-201913，純度94.6%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)111523-201811，純度97.4%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號(hào)111583-202006，純度98.9%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，純度99.4%）、柴胡皂苷a （批號(hào)110777-201912，純度94.8%）、柴胡皂苷d （批號(hào)110778-201912，純度96.3%）、柚皮苷（批號(hào)110722-202116，純度93.5%）、甘草苷 （批號(hào)111610-201908，純度95.0%）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-202122，純度94.4%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（德國(guó)默克公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。荊防顆粒共4 批 （批號(hào) 2782103006、20210507、211108、0012002015），由不同廠家生產(chǎn)，均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇溶解，制成貯備液（胡薄荷酮、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯質(zhì)量濃度均約為1 μg／mL，柚皮苷質(zhì)量濃度約為100 μg／mL，其余對(duì)照品質(zhì)量濃度均約為10 μg／mL），分別精密量取1、5、10、100、500 μL 及1、2、5、10 mL，置于100 mL 量瓶中，20%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，精密量取上清液1 mL，置于10 mL 量瓶中，20%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相甲醇（A）-0.1%甲酸 （B），梯度洗脫 （0 ～2 min，95% B；2～13 min，95% ～5% B； 13 ～18 min，5% B；18～18.1 min，5% ～95%B； 18.1 ～25 min，95%B）；體積流量0.3 mL／min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負(fù)離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）模式； 離子化電壓（IS）5 500、-4 500 V； 離子源溫度450 ℃； 噴霧氣（GS1，N2）壓力50 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；輔助加熱氣 （GS2，N2）壓力55 psi； 氣簾氣（N2）壓力30 psi，其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.4 系統(tǒng)適用性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.2” “2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由此可知，雖然柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 離子對(duì)相同，但通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫程序可使兩者得到有效分離，并且其他成分對(duì)測(cè)定均無(wú)干擾。

圖1 荊防顆?？傠x子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Jingfang Granules

圖2 各成分提取離子流圖Fig.2 Extracted ion current chromatograms of various constituents

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” “2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并分別以信噪比3 ∶1、10 ∶1 計(jì)算檢測(cè)限、定量限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液100 μL，置于100 mL 量瓶中，20%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，分別精密吸取5 μL，在“2.2” “2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸峰面積RSD 分別為1.19%、1.79%、1.62%、1.53%、1.68%、1.84%、1.76%、1.43%、1.52%、1.14%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品6 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2”“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸含量RSD 分別為1.03%、0.98%、1.15%、1.67%、1.83%、0.78%、0.82%、1.47%、1.60%、1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、18、24 h 在“2.2” “2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸峰面積RSD 分別為1.32%、1.87%、1.06%、0.62%、1.11%、0.38%、1.51%、1.81%、0.69%、1.22%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品約5 g，精密加入對(duì)照品溶液（含胡薄荷酮2.52 μg／mL、升麻素苷153.1 μg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷122.1 μg／mL、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯6.02 μg／mL、柴胡皂苷a 30.24 μg／mL、柴胡皂苷d 20.02 μg／mL、阿魏酸50.11 μg／mL、柚皮苷2 655 μg／mL、甘草苷100.2 μg／mL、甘草酸400.5 μg／mL）800、1 000、1 200 μL，每個(gè)水平3 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”“2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸平均加樣回收率分別為98.8%、98.4%、96.8%、98.5%、97.5%、97.6%、98.6%、98.6%、96.7%、98.7%，RSD 分別為0.9%、1.4%、1.2%、1.5%、1.5%、1.5%、1.9%、1.0%、1.3%、1.7%。

2.6 樣品含量測(cè)定 取4 批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” “2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg／g，n＝4）Tab.3 Results of content determination of various constituents （μg／g，n＝4）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑乙腈、甲醇、50% 甲醇、10%甲醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時(shí)提取率較高，但對(duì)部分成分色譜峰的峰形、峰強(qiáng)度有一定影響，而加入適量水稀釋后兩者均有明顯改善，故確定提取方法為先用甲醇提取，再用20% 甲醇稀釋定容。然后，考察了流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1% 甲酸，發(fā)現(xiàn)后者洗脫時(shí)各成分色譜峰響應(yīng)值較高，峰形較好，故選擇其進(jìn)行梯度洗脫。

含量測(cè)定結(jié)果表明，部分批次荊防顆粒中胡薄荷酮含量較低，并且不同廠家批次樣品中其他成分含量也存在差異較大的情況，可能是投料或是樣品制備工藝某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定荊防顆粒中胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸的含量，該方法快速準(zhǔn)確，可為該制劑質(zhì)量控制提供可靠的分析手段。