康朝霞,孫 娥*,姜夢(mèng)華,楊 擋,汪 晶,黃一平*,李 超,朱法根,邵建國(guó),封 亮,賈曉斌
(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)藥研究院,國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室,江蘇 南京 210028; 2.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司,江蘇省兒科中藥與特色制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 泰興 225400; 3.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院,江蘇 南京 211198)
中藥口服液體制劑(如合劑、口服液、糖漿劑等)具有吸收快、生物利用度高、服用方便等特點(diǎn),但其制劑工藝面臨有效成分損失的瓶頸問(wèn)題。蒲地藍(lán)消炎口服液作為中成藥大品種之一,廣泛用于治療呼吸系統(tǒng)疾?。?-2],但其前處理階段和制劑工藝也會(huì)損失成分,在生產(chǎn)過(guò)程中黃芩苷、菊苣酸從飲片到制劑的轉(zhuǎn)移率分別僅為34%、11%[3-4]。因此,本實(shí)驗(yàn)以蒲地藍(lán)消炎口服液為例,考察有效成分含量在工藝過(guò)程中的變化,探尋其傳遞規(guī)律、損失的關(guān)鍵環(huán)節(jié),并提出相應(yīng)的增溶技術(shù)和優(yōu)化策略,以期為提升其他中藥口服液體制劑的有效性、內(nèi)在質(zhì)量奠定基礎(chǔ)[5]。
Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司); MT5 型電子分析天平(百萬(wàn)分之一,瑞士Mettler-Toledo 公司); BT125D 型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]; DFT-50型粉碎機(jī)(上海新諾儀器集團(tuán)有限公司); KH-300TDB 型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); TD10002A 型電子分析天平(天津天馬衡基儀器有限公司); DTL-21B 型電陶爐(合肥榮事達(dá)電子電器集團(tuán)有限公司); pH-10 型手持式PH計(jì)(上海力辰邦西儀器科技有限公司); RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 80-2 型電動(dòng)離心機(jī)(金壇醫(yī)療儀器有限公司); HH-S4 型恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司); TD5.5型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。
腺苷(批號(hào)110879-201703)、菊苣酸(批號(hào)111752-201703)、紫堇靈(批號(hào)111734-201602)、黃芩苷(批號(hào)110715-201821)、漢黃芩素(批號(hào)111514-201706)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。蒲公英、苦地丁、板藍(lán)根、黃芩(批號(hào)190112、190118、190201、190201)均由濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供,經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)王龍副教授鑒定為正品。甜菊糖苷(批號(hào)ASL613,上海源葉生物科技有限公司); 氫氧化鈉(批號(hào)20180601,西隴科學(xué)股份有限公司); 藥用乙醇 ( 批號(hào)200525130B,南京化學(xué)試劑股份有限公司)。甲醇為色譜純(美國(guó)Tedia 公司); 水為娃哈哈純凈水。
2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取腺苷、菊苣酸、紫堇靈、黃芩苷、漢黃芩素對(duì)照品適量,50%甲醇溶解,制成貯備液(每1 mL 分別含腺苷0.94 mg、菊苣酸2.04 mg、紫堇靈0.50 mg、黃芩苷2.02 mg、漢黃芩素0.40 mg),分別精密吸取適量,置于5 mL 量瓶中,50%甲醇定容,制成每1 mL 分別含腺苷37.68 μg、菊苣酸407.80 μg、紫堇靈19.88 μg、黃芩苷1.21 mg、漢黃芩素7.90 μg 的溶液,即得。
2.2 色譜條件 參考文獻(xiàn) [6]報(bào)道,Agilent XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm); 流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸,梯度洗脫(0~15 min,5% ~15%甲醇; 15 ~30 min,15% 甲醇; 30 ~35 min,15% ~25% 甲醇; 35 ~70 min,25% ~50% 甲醇;70~90 min,50% ~80%甲醇,90 ~100 min,80% ~5%甲醇); 體積流量1 mL/min; 柱溫30 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm; 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.3 供試品溶液制備
2.3.1 飲片 蒲公英、苦地丁、板藍(lán)根、黃芩粉碎后過(guò)4 號(hào)篩,分別稱取1.0 g,置于錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲提取30 min,靜置至室溫,50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,過(guò)0.45 μm 微孔濾膜,即得(編號(hào)S0)。
2.3.2 3 味藥合提 取蒲公英500 g、板藍(lán)根188 g、苦地丁125 g,加水煎煮2 次,每次1 h,濾過(guò),合并濾液,濃縮至相對(duì)密度為1.13 ~1.15(60~70 ℃)的清膏,加乙醇使含醇量為75%,靜置48 h,濾過(guò),濾液回收乙醇,加水至500 mL,放置48 h,濾過(guò),濾液用10%NaOH 溶液調(diào)pH 值至6.5,得到流浸膏。按照相關(guān)制備工藝,收集3味藥提取液(S1)、3 味藥濃縮液(S2)、3 味藥醇沉上清液(S3)、3 味藥回收乙醇后流浸膏(S4),分別精密量取0.5 mL,置于10 mL 量瓶中,50%甲醇定容至刻度,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。
2.3.3 黃芩單提 取黃芩188 g,投入沸水中煎煮2 次,每次先煎煮10 min,用10% NaOH 溶液調(diào)pH 值至6.5,再煎煮1 h,濾過(guò),合并濾液,濃縮至相對(duì)密度為1.08 ~1.11 (60 ~70 ℃),調(diào)pH 值至6.5,加乙醇使含醇量達(dá)50%,靜置24 h,濾過(guò),濾液回收乙醇,加1 倍量水混勻,濾過(guò),濾液在80 ℃下保溫,鹽酸調(diào)pH 值至1.5,保溫0.5 h,放置24 h,濾過(guò),沉淀物用70% 乙醇洗至中性,得粗品,加500 mL 水,在80 ℃下保溫溶解,10%NaOH 溶液調(diào)pH 值至6.5,得到流浸膏。按照相關(guān)制備過(guò)程,收集黃芩提取液(S5)、黃芩濃縮液(S6)、黃芩醇沉并回收乙醇后流浸膏(S7)、黃芩加水稀釋后濾液(S8)、黃芩苷加水溶解(S9)、黃芩苷調(diào)pH 后濾液(S10),分別精密量取0.5 mL,置于10 mL 量瓶中,50% 甲醇定容至刻度,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。
2.3.4 制劑階段 將“2.3.2” “2.3.3” 項(xiàng)下藥液合并,在2 ~8 ℃下冷藏靜置,濾過(guò),離心,濾過(guò),加入0.5% 甜菊糖苷,濾過(guò),定容至1 000 mL,分裝、滅菌得到成品。按照相關(guān)制備過(guò)程,收集兩部分合并藥液 (S11)、冷藏靜置后濾液(S12)、離心后濾液(S13)、加甜菊糖苷后濾液(S14)、滅菌后成品 (S15),分別精密量取0.5 mL,置于10 mL 量瓶中,50% 甲醇定容至刻度,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。
3.1 質(zhì)量標(biāo)志物含量測(cè)定
3.1.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于1.0 mL 量瓶中,50%甲醇定容,濾過(guò),在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表1,可知各質(zhì)量標(biāo)志物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表1 各質(zhì)量標(biāo)志物線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various quality markers
3.1.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液10 μL,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得腺苷、菊苣酸、紫堇靈、黃芩苷、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.89%、0.98%、0.78%、0.93%、0.96%,表明儀器精密度良好。
3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S14)適量,室溫下于0、4、8、12、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得腺苷、菊苣酸、紫堇靈、黃芩苷、漢黃芩素峰面積RSD 分別為1.5%、2.1%、0.82%、0.97%、2.6%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(S14)1.0 mL,共6 份,置于10 mL 量瓶中,50%甲醇定容,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得腺苷、菊苣酸、紫堇靈、黃芩苷、漢黃芩素含量RSD 分別為2.1%、1.7%、0.54%、0.43%、1.9%,表明該方法重復(fù)性良好。
3.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(S14)0.5 mL,共6 份,置于10 mL 量瓶中,精密加入對(duì)照品溶液適量,50%甲醇定容至刻度,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,腺苷、菊苣酸、紫堇靈、黃芩苷、漢黃芩素平均加樣回收率分別 為 103.9%、102.4%、96.07%、99.81%、101.6%,RSD 分別為 2.1%、0.93%、1.1%、1.6%、2.6%。
3.2 質(zhì)量標(biāo)志物傳遞規(guī)律研究
3.2.1 3 味藥合提 如表2、圖2 所示,提取液到流浸膏過(guò)程中腺苷轉(zhuǎn)移率分別為 66.11%、58.68%、44.56%、41.16%,損失率分別為7.42%、14.12%、3.40%; 紫堇靈轉(zhuǎn)移率分別為72.06%、47.97%、30.15%、27.81%,損失率分別為24.09%、17.82%、2.34%; 菊苣酸轉(zhuǎn)移率分別為79.01%、64.39%、47.18%、45.26%,損失率分別為14.62%、17.22%、1.91%,可知各成分主要在濃縮、醇沉環(huán)節(jié)損失,其中菊苣酸、腺苷損失率在醇沉環(huán)節(jié)較高,而紫堇靈損失率在熱處理濃縮環(huán)節(jié)較高。
表2 各質(zhì)量標(biāo)志物含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various quality markers
3.2.2 黃芩單提 如表2、圖2 所示,黃芩從提取到黃芩苷調(diào)pH 后濾液環(huán)節(jié)黃芩苷轉(zhuǎn)移率分別為95.89%、79.65%、63.65%、60.13%、39.06%、36.38%,損失率分別為 16.23%、16.00%、3.53%、21.07%、2.68%; 漢黃芩素轉(zhuǎn)移率分別為83.11%、67.39%、53.86%、50.99%、37.16%、36.44%,損失率分別為15.72%、13.52%、2.88%、13.83%、0.72%,可知黃芩苷、漢黃芩素在濃縮熱處理環(huán)節(jié)、醇沉精制除雜環(huán)節(jié),以及黃芩單提獨(dú)有的酸沉得到黃芩苷環(huán)節(jié)損失較大,并且黃芩苷在酸沉環(huán)節(jié)損失嚴(yán)重,損失率達(dá)21.07%。
3.2.3 制劑階段 如表2、圖2 所示,腺苷、紫堇靈、菊苣酸、黃芩苷、漢黃芩素轉(zhuǎn)移率分別從40.80% 下降到34.52%,27.57% 下降到24.03%,44.99% 下降到39.08%,36.32% 下降到31.01%,36.11%下降到33.83%,其中冷藏靜置環(huán)節(jié)損失較大,損失率分別為3.40%、1.86%、2.21%、2.22%、1.34%。
本實(shí)驗(yàn)以蒲地藍(lán)消炎口服液為例,系統(tǒng)分析其生產(chǎn)工藝過(guò)程中有效成分轉(zhuǎn)移、損失規(guī)律,發(fā)現(xiàn)其損失主要集中在濃縮、醇沉環(huán)節(jié),同時(shí)黃芩在酸沉環(huán)節(jié)也有較大損失,由于冷藏靜置是制劑階段損失相對(duì)較多的共性環(huán)節(jié),故考慮通過(guò)篩選濃縮方式、優(yōu)化精制除雜方法、pH 調(diào)節(jié)、包合技術(shù)等手段(圖3)來(lái)提高質(zhì)量標(biāo)志物轉(zhuǎn)移率,最終提升制劑有效性。
濃縮是持續(xù)加熱的過(guò)程,菊苣酸等熱不穩(wěn)定成分可能會(huì)分解,故改變濃縮方式,優(yōu)化濃縮過(guò)程中溫度、壓力等參數(shù)有助于保留上述成分。生產(chǎn)中常用的濃縮方式是常壓濃縮、減壓濃縮,前者適用于熱穩(wěn)定成分,而后者適用于熱敏性或揮發(fā)性成分[7-8]。另外,反滲透濃縮、冷凍濃縮是新興濃縮方法,前者優(yōu)化膜種類和結(jié)構(gòu),可促進(jìn)中藥溶質(zhì)與溶劑分離,而后者可通過(guò)調(diào)節(jié)冷凍溫度、時(shí)間來(lái)促進(jìn)不同溶質(zhì)冰晶析出,從而實(shí)現(xiàn)濃縮分離[9-11]。
醇沉是當(dāng)前中藥口服液體制劑生產(chǎn)過(guò)程中主要的精制除雜方法,但部分活性成分會(huì)被除去而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移率下降。醇沉效率受到醇沉物質(zhì)濃縮液密度、溫度、溶液pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間、靜置溫度、加醇速度,攪拌速度、攪拌時(shí)間等因素影響,故優(yōu)化醇沉工藝有助于減少成分損失[12]。
黃芩苷、漢黃芩素是黃芩主要成分,兩者損失集中在濃縮、醇沉、酸沉環(huán)節(jié),其中酸沉是黃芩純化的重點(diǎn),藥液濃度、酸沉pH、靜置溫度等參數(shù)均對(duì)其保留率有影響[13-17]。另外,黃芩經(jīng)堿提、醇沉后再經(jīng)酸沉得黃芩苷粗品,工藝復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,而由堿提改為直接水提時(shí)可減少酸沉工序靜置步驟,節(jié)約時(shí)間,提高生產(chǎn)效率。
冷藏靜置是去除雜質(zhì)、保證澄明度而進(jìn)一步提高中藥口服液體制劑穩(wěn)定性的過(guò)程,冷藏靜置環(huán)節(jié)由于溫度降低,可能會(huì)影響有效成分溶解度,故需識(shí)別因低溫而導(dǎo)致溶解度降低的成分,并對(duì)其進(jìn)行增溶,從而保證制劑的貨架期。另外,中藥口服液體制劑主要通過(guò)調(diào)節(jié)pH、原生多糖增溶技術(shù)(黃芩多糖)、增溶劑、表面活性劑、包合等技術(shù)增溶[18-19]。
中藥口服液體制劑成分復(fù)雜,同時(shí)存在多種極性化合物,不論是藥液精制除雜還是配液所用增溶方法,均需根據(jù)處方中成分理化性質(zhì)和臨床需求來(lái)選擇合適的純化手段,以期提升中藥口服液體制劑轉(zhuǎn)移率。本實(shí)驗(yàn)以蒲地藍(lán)消炎口服液為例,立足中藥口服液體制劑范疇,提出制劑工藝中共性環(huán)節(jié)有效性改善的研究策略,有助于其內(nèi)在質(zhì)量的提升。