曹?chē)?guó)瓊，劉 敏，劉 耀，徐 劍，陳有麗，吳靜瀾，張永萍*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025，4.遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司，貴州 遵義 563000）

化風(fēng)丹1951 年被列入國(guó)務(wù)院保護(hù)的四大名藥之一，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，主要用于治療中風(fēng)偏癱、癲癇等癥［1-2］?；L(fēng)丹藥母制作技藝入選國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，其將白附子、生半夏、生南星、生川烏、郁金、神曲粉碎成細(xì)粉，加入牛膽汁，自然條件下發(fā)酵。

發(fā)酵是中藥炮制方法之一，借助微生物的作用，可以改變中藥原有藥性，提高療效，降低毒副作用，擴(kuò)大適應(yīng)癥［3-5］。發(fā)酵的過(guò)程實(shí)際上是生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程，微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的各種酶，能夠產(chǎn)生多種反應(yīng)，分解轉(zhuǎn)化原料中特定的底物生成新的活性成分，同時(shí)產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物［6-7］。

化風(fēng)丹藥母制備采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵，受外界環(huán)境的影響較大，可控性低，使得藥母質(zhì)量及安全性不夠穩(wěn)定，對(duì)化風(fēng)丹臨床療效和現(xiàn)代化生產(chǎn)不利［8］。隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需求，純種發(fā)酵代替自然發(fā)酵，是質(zhì)量控制的有效手段。目前發(fā)酵類藥物如半夏曲、六神曲等均對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行篩選和鑒定［9-12］。但對(duì)化風(fēng)丹藥母研究主要集中在其發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分含量變化和發(fā)酵條件優(yōu)選［13-15］，在微生物發(fā)酵方面研究很少。本研究對(duì)化風(fēng)丹藥母發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的微生物的菌群種類和數(shù)量變化進(jìn)行初步研究，分離鑒定優(yōu)勢(shì)菌株，考察不同溫度和pH 值對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)的影響，以期為化風(fēng)丹發(fā)酵的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 FA1004 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）； HZQ-F160A 恒溫培養(yǎng)振蕩箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）； YXQ-LS-100Sll 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）； SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； TGL-16B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； Tissuelyser-48 多樣品組織研磨儀（上海凈信事業(yè)發(fā)展有限公司）； HY-2 漩渦混勻儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）； ProFlexTMPCR 儀（美國(guó)Life Technologies 公司）； 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； MultisKan Sky 酶標(biāo)儀 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試劑與藥物 川烏、天南星、半夏、白附子、郁金、神曲、牛膽汁購(gòu)自亳州康美中藥城，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)肖承鴻高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為正品。無(wú)水乙醇、可溶性淀粉、蔗糖、氯化鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid 公司； 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（不含抗生素）、瓊脂粉、革蘭氏染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司； Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒、DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)Marker、50X TAE Buffer、4S Green Plus 無(wú)毒核酸染料、瓊脂糖、Taq PCR Mix 預(yù)混液（2X，含藍(lán)染料）、PCR 引物均購(gòu)自生工生物科技（上海）有限責(zé)任公司； 異丙醇購(gòu)自天津市鑫鉑特化工有限公司； 氫氧化鈉、鹽酸購(gòu)自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司； 磷酸氫二甲、硫酸鎂、磷酸二氫鉀均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司； 尿素購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司； 麥芽糖購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 化風(fēng)丹藥母的制備 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道，精密稱取白附子28.20 g、生半夏28.20 g、生天南星28.20 g、生川烏28.20 g、郁金14.10 g、神曲0.14 g 混勻，加入牛膽汁126.70 g 攪拌均勻，置于密閉玻璃器皿中，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，在35 ℃、相對(duì)濕度60% 下發(fā)酵，發(fā)酵前取樣1 次，之后每1 周取樣1 次，共發(fā)酵6 周，樣品于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 微生物的培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和純化保存 取各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品0.5 g，在無(wú)菌條件下制備為細(xì)菌密度為1×10-1的菌懸液，依次稀釋成1×10-2、1×10-3、1×10-4的菌懸液，根據(jù)不同發(fā)酵時(shí)間段樣品菌落數(shù)選取合適的3 個(gè)稀釋梯度。吸取合適稀釋度的樣品100 μL 注入固體培養(yǎng)基平皿，用涂布棒將其涂布均勻，重復(fù)3 次。細(xì)菌培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d。霉菌和酵母菌培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取單一菌落劃線分離、培養(yǎng)，將菌落形態(tài)相似且出現(xiàn)頻率多的微生物作為優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行分離純化（盡可能多挑出形態(tài)不同的菌落），于4 ℃冰箱冷藏，并盡快對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 化風(fēng)丹藥母優(yōu)勢(shì)菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 直接觀察菌體在培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)，用顯微鏡觀察菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

2.3.2.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取細(xì)菌DNA，利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），對(duì)藥物中分離菌落的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。使用酶為T(mén)aq PCR Master Mix，PCR 反應(yīng)體系為模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 25 μL，補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃10 min。取2 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠拍照系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物科技（上海）有限責(zé)任公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果復(fù)制于NCBI 網(wǎng)站上使用Blast 進(jìn)行同源性比較，下載同源性較高的序列采用MEGA-X 軟件的Neighbor-Joining 方法，1 000次Bootstrap 檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3.2.2 優(yōu)勢(shì)真菌分子生物學(xué)鑒定 采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒、Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒提取霉菌及酵母菌的基因組DNA。利用霉菌通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′），酵母菌通用引物NL-1 （5′-GCATATCAATAAGCG-GAGGAAAAG-3′）和NL-4（5′-GGTCCGT-GTTTCAAGACGG-3′）對(duì)藥物中分離菌落的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。使用酶為T(mén)aq PCR Master Mix，PCR 反應(yīng)體系為DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 25 μL，補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃5 min； 94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃5 min。其他同“2.3.2.1”。

2.4 溫度對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)的影響 參考文獻(xiàn)［7］報(bào)道，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的阿氏芽孢桿菌按5%的接種量接入于200 mL LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，分別于20、25、30、35、40 ℃在150 r／min 下培養(yǎng)40 h，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，每4 h 1次； 接種漢遜德巴利酵母菌于YEPD 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于上述溫度條件下培養(yǎng)，在660 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，重復(fù)3 次。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），OD 值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。以馬鈴薯葡萄糖瓊脂為介質(zhì)制成直徑為8 mm 米曲霉菌餅，接種于pH 值7.0 的固體培養(yǎng)基中央，置于上述溫度條件下培養(yǎng)192 h，用十字交叉法測(cè)菌落直徑，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），直徑為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。

2.5 pH 值對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)的影響 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道，用鹽酸和氫氧化鈉將LB 液體培養(yǎng)基、YEPD 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基pH 值分別調(diào)至5、6、7、8、9。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的阿氏芽孢桿菌按5%的接種量接入于200 mL LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)振蕩箱培養(yǎng)40 h，在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，每4 h 1 次； 接種漢遜德巴利酵母菌于不同pH 值的YEPD 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)振蕩箱150 r／min 下培養(yǎng)40 h，在660 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，每4 h 1 次，重復(fù)3 次，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），OD 值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。以馬鈴薯葡萄糖瓊脂為介質(zhì)制成直徑為8 mm 米曲霉菌餅，分別接種于不同pH 值的固體培養(yǎng)基中，最適溫度下培養(yǎng)192 h，用十字交叉法測(cè)菌落直徑，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），直徑為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。

3 結(jié)果

3.1 菌落數(shù) 由表1 可知，化風(fēng)丹藥母整個(gè)發(fā)酵炮制過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量先增加后減少，發(fā)酵0 周至3周呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，菌落數(shù)處于1.50×102～6.60×102cfu／mL； 發(fā)酵至第4 周，數(shù)量急劇增加，第5周和第6 周細(xì)菌數(shù)量趨于穩(wěn)定，約為1.40×103cfu／mL。酵母菌在發(fā)酵0 周至3 周時(shí)，數(shù)量急劇增加，從1.32×103cfu／mL 快速增長(zhǎng)至1.85×104cfu／mL； 發(fā)酵第4 周的酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，到第6 周僅有1.00×102cfu／mL。霉菌在0 周時(shí)沒(méi)有生長(zhǎng)，1 周至4 周數(shù)量平穩(wěn)增加，之后5 周和6 周數(shù)量又呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。

3.2 菌落形態(tài)及顯微觀察 7 個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品共挑選出41 株優(yōu)勢(shì)菌，其中細(xì)菌12 株，酵母22 菌株，霉菌7 株。對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及革蘭氏染色，其形態(tài)呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形等，大部分顯微觀察為直桿狀，且為革蘭氏陽(yáng)性菌； 對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，其形態(tài)呈圓形、類圓形、橢圓形等，可觀察到明顯的出芽，具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，含有液泡； 對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌外觀進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，其形態(tài)孢子及菌絲顏色，同樣可觀察到菌絲和孢子。

從不同發(fā)酵炮制時(shí)間的樣品中分離出了細(xì)菌、霉菌、酵母菌，將挑選的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行匯總，其中，細(xì)菌出現(xiàn)次數(shù)最多的為X1； 酵母菌由于性狀大小均相似，無(wú)法從外觀性狀觀察是否一樣，必須通過(guò)物種鑒定才能得出； 霉菌出現(xiàn)次數(shù)最多為M4、M8。

3.3 優(yōu)勢(shì)菌種的分子生物學(xué)鑒定及篩選 采用16S rDNA、26S rDNA 序列分析、相似性比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分別對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、真菌進(jìn)行鑒定。X1、X11 ～ X12 為阿氏芽孢桿菌 （Bacillus aryabhattai），X2 為沙福芽孢桿菌 （Bacillus safensis），X3 為漳洲芽孢桿菌 （Bacillus zhangzhouensis），X4 為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），X5、X8 為地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis），X6 ～ X7、X9 為Paraclostridiumbifermentans，X10 為Paraclostridium benzoelyticum。J1、J3 ～J22 為漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii），J2 為白色念珠菌（Candidaalbicans），由于該菌細(xì)胞呈卵圓形，很像酵母菌，導(dǎo)致與酵母菌一起分離純化鑒定，其數(shù)量很少。M1 為煙曲霉（Aspergillusfumigatus），M2 為傘狀毛霉菌（Lichtheimiacorymbifera），M4、M8 為米曲霉 （Aspergillusoryzae），M7 為聚多曲霉（Aspergillussydowii），M5、M9 為皺瓣曲霉（Aspergillusrugulosus）。結(jié)合菌落計(jì)數(shù)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，即挑選各樣品培養(yǎng)皿中出現(xiàn)頻率多的微生物作為研究對(duì)象，最終確定細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種為阿氏芽孢桿菌，酵母菌優(yōu)勢(shì)菌種為漢遜德巴氏酵母菌，霉菌優(yōu)勢(shì)菌種為米曲霉。圖1 ～3 分別為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、酵母菌、霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of dominant bacteria

圖2 優(yōu)勢(shì)酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of dominant yeasts

圖3 優(yōu)勢(shì)霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of dominant molds

3.4 不同溫度下優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)情況 由圖4 可知，在35 ℃時(shí)，阿氏芽孢桿菌無(wú)論是菌體生長(zhǎng)速率還是菌體最大產(chǎn)量均較高，表明阿氏芽孢桿菌的最適溫度為35 ℃； 在25 ～30 ℃時(shí)，漢遜德巴利酵母菌無(wú)論是菌體生長(zhǎng)速率還是菌體最大產(chǎn)量均較高，且在32 h 時(shí)生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，表明漢遜德巴利酵母菌最適生長(zhǎng)于25 ～30 ℃下且32 h 即能達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)周期； 在35 ℃時(shí)，米曲霉從生長(zhǎng)第1 天至第5 天保持快速增長(zhǎng)，于第5 天后便停止生長(zhǎng)，保持平穩(wěn)狀態(tài)； 20 ～30 ℃依然每天勻速增長(zhǎng)，均至第8 天后停止生長(zhǎng)； 在40 ℃時(shí)，米曲霉的生長(zhǎng)明顯處于抑制狀態(tài)； 表明米曲霉最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃。

3.5 不同pH 值對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖5可知，在pH 值為5～9 的LB 液體培養(yǎng)基下培養(yǎng)的阿氏芽孢桿菌均能得到較好生長(zhǎng)，在pH 值為8時(shí)，阿氏芽孢桿菌無(wú)論是菌體生長(zhǎng)速率還是菌體最大產(chǎn)量均較高，并于24 h 后生長(zhǎng)趨勢(shì)不變，表明阿氏芽孢桿菌最適生長(zhǎng)pH 值為8； 在pH 值為6時(shí)，漢遜德巴利酵母菌在0～12 h 生長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，于16 h 快速生長(zhǎng)，并于32 h 停止生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速度最快且產(chǎn)量最大，表明漢遜德巴利酵母菌最適生長(zhǎng)pH 值為6； 在pH 值為7 時(shí)，米曲霉的直徑在第6 天達(dá)最大，且生長(zhǎng)速度較其他pH 條件下的速度要更快，表明米曲霉最適pH 值為7。

4 討論

化風(fēng)丹是貴州省傳統(tǒng)名藥，能息風(fēng)鎮(zhèn)痙、豁痰開(kāi)竅，臨床治療中風(fēng)效果顯著。藥母是化風(fēng)丹的君藥，需要在自然條件下發(fā)酵后方可入藥。化風(fēng)丹藥母發(fā)酵過(guò)程中存在細(xì)菌、霉菌、酵母，發(fā)酵是三者共同作用的結(jié)果。研究化風(fēng)丹藥母發(fā)酵過(guò)程中的微生物，可以為進(jìn)一步揭示化風(fēng)丹藥母發(fā)酵機(jī)制及藥母發(fā)酵工藝和質(zhì)量控制提供參考。

本研究通過(guò)菌落計(jì)數(shù)的方法篩選優(yōu)勢(shì)菌株，鑒定優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為阿氏芽孢桿菌，優(yōu)勢(shì)酵母菌為漢遜德巴利酵母菌，優(yōu)勢(shì)霉菌為米曲霉。文獻(xiàn)報(bào)道研究，阿氏芽孢桿菌具有很強(qiáng)耐受性［16］、抗逆性［17］，對(duì)人體安全，可以分泌左旋天冬氨酰酶。漢遜德巴利酵母菌是一種重要的非傳染性酵母，在自然環(huán)境下生存能力強(qiáng)，在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生香氣物質(zhì)以改善產(chǎn)品風(fēng)味、生產(chǎn)燃料酒精所必需的嗜熱β-葡萄糖苷酶［18］，并能產(chǎn)生一種殺傷毒素抑制白色念珠菌和熱帶念珠菌的生長(zhǎng)［19］。米曲霉是一種能產(chǎn)蛋白酶的菌株，可以提高發(fā)酵物質(zhì)的全氮利用率和蛋白質(zhì)利用率，從而改善最終產(chǎn)品的質(zhì)量［20］。

經(jīng)發(fā)酵炮制后，中藥品質(zhì)的高低不僅與發(fā)酵的菌種有關(guān)，還與發(fā)酵條件如溫度、相對(duì)濕度、pH值等都有密切關(guān)系［21］?；L(fēng)丹藥母的炮制是微生物發(fā)酵的過(guò)程，微生物的發(fā)酵依賴其中優(yōu)勢(shì)菌株的性能，發(fā)酵條件和發(fā)酵工藝對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的生長(zhǎng)有影響。溫度是調(diào)控微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一，酶促反應(yīng)與溫度有密切關(guān)系，溫度升高，細(xì)胞繁殖加快，酶失活的速度也加快，發(fā)酵周期縮短，這可能是為何在不同季節(jié)發(fā)酵炮制的周期和藥材成分有差異的原因。通過(guò)本研究明確了3 種菌的最適宜生長(zhǎng)溫度、pH 值，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。