覃瑩菲，張 鑫，陳 岳，李成剛，譚新球

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業(yè)科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

白蠟樹（Fraxinus chinensisRoxb）為木犀科梣屬大型落葉喬木[1]，在我國共有27 種。白蠟樹高15～20 m，樹皮呈灰褐色，頂生的小葉與側生的小葉等大或稍大，羽狀復葉長15～25 cm，葉柄長4～6 cm。白蠟樹耐旱，萌發(fā)能力強，生長迅速，樹形優(yōu)美，材理通直，還有較強的耐鹽性，常種植于鹽堿地以改良環(huán)境，具有較好的綠化及生態(tài)價值[2]。白蠟樹在我國種植歷史悠久、分布甚廣，其植株生長迅速，枝條柔韌可供編制各種用具，樹皮還具有較高的藥用價值[3]，相關產業(yè)具有一定規(guī)模。

近年來，白蠟樹病蟲害問題日益嚴重，在樹苗期和成熟期對白蠟樹造成嚴重危害，阻礙白蠟樹生長發(fā)育及相關產業(yè)發(fā)展。研究報道，由立枯絲核菌引起的立枯病是白蠟樹苗期的主要病害，主要危害地下根部和莖基部，導致白蠟樹出現(xiàn)不規(guī)則褐色凹陷的病斑，嚴重時會導致幼苗死亡[4]。白蠟褐斑病主要危害葉片，病斑為灰褐色，表面分布深褐色霉點，會造成葉片脫落或變形，嚴重時會使植株死亡[5]。流膠病也會影響白蠟樹的生長，其發(fā)生與氣候、栽培管理水平、土壤土質等有相關性，真菌侵染或者病蟲侵入都會導致流膠病，具體癥狀為白蠟枝干流出黃色膠狀物質，最終導致樹體衰弱、枯竭[6]。白蠟枯梢病由白蠟鞘孢菌所致，病部出現(xiàn)潰瘍或壞死，且木質部褪綠明顯，當病斑擴展環(huán)繞枝條，就會產生枯梢[7]。按昆蟲類別劃分，為害白蠟樹的常見害蟲有蟬蛾目瘦蛾科害蟲，鱗翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲。白蠟樹從春天長葉到秋冬落葉，均受害蟲侵擾[8]。白蠟窄吉丁初孵幼蟲會從白蠟樹韌皮部啃食至木質部，導致樹皮開裂、脫落[9]。白蠟梢距甲成蟲啃食樹苗葉柄，使得葉片萎縮，幼苗不能正常生長[10]?？傊?，多種病蟲害導致白蠟樹生長發(fā)育緩慢，外觀受損嚴重甚至死亡，不利于環(huán)境美化和經濟效益提高。因此，鑒定白蠟樹病蟲害的對白蠟樹的生長及相關產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

鏈格孢屬（Alternariaspp.）真菌寄主廣泛，可為害糧食作物、蔬菜、花卉、數(shù)木等多種經濟作物，導致嚴重的經濟損失，鏈格孢菌（Alternaria alternata）廣泛分布在糧食、飼料、土壤和腐爛有機物質中，部分致病的鏈格孢菌對其寄主植物具有致病毒素，從而侵染寄主植物[11]。如柑橘鏈格孢褐斑病主要危害橘、柚、橙等，引起落葉落果和枯梢，帶病斑果實難以銷售[12]。鏈格孢侵染枸杞后，會產生典型黑霉病癥狀，病斑周圍呈水漬狀，中部產生白色菌絲，果實漸漸軟化、變黑，失去經濟價值[13]。羅光明等[14]通過轉錄組技術研究了梔子接種鏈格孢菌后在基因轉錄上的差異，分析了關鍵通路和關鍵基因，有助于探明鏈格孢菌與植物的互作機制。文中探明對白蠟樹葉片的致病菌進行了形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，以期為白蠟樹病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 供菌種鑒定的白蠟樹病葉實體于2022 年7 月28 日采摘于懷化市芷江縣楊家坪鎮(zhèn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯切成小塊，沸水煮30～40 min，取紗布過濾，冷卻至室溫，加入葡萄糖20 g，加ddH2O 定容至1 L，分裝至200 mL 錐形瓶（配置固體培養(yǎng)基每瓶加入瓊脂3 g），121℃，滅菌20 min，冷卻后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 T5 Direct PCR Kit 購買自Tsingke Biotechnology 生物有限公司。引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由Tsingke Biotechnology 生物有限公司合成，引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離 內生菌的分離參考袁珊珊等[15]方法進行了細微的調整。將采集的病葉在超凈臺內用1% NaClO 浸泡1 min，隨后轉入75% 乙醇中浸泡1 min，用手術刀片輕輕切割病斑，用接種針小心取出中間病葉，最終獲得2 mm×2 mm 含有病菌的病葉，小心接種在PDA 平板培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種一個菌塊，重復5 次，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察菌株生長情況2 次。該菌株編號Z3727-10。

1.2.2 菌絲DNA 提取及檢測 當菌絲生長至直徑為3 cm 時，取邊緣菌絲，在超凈臺切割成1 mm×1 mm菌絲塊接種至PDA 液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長情況，待菌絲長至合適大小，用濾膜過濾培養(yǎng)基，保留菌絲球，利用CTAB 法進行基因組DNA 提取，將提取的DNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫? μL 提取的DNA 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Syngene G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.3 PCR 擴增及其序列鑒定 以提取的基因組DNA 為模板，應用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR 擴增，PCR 擴增體系為2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 樣品0.5μL，加ddH2O 定容至25 μL；PCR 擴增程序為98℃預變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共計30 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min， 4℃保持。PCR 結束后取10 μL PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將產物送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。測序結果登錄NCBI 進行Blast 比對鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌種形態(tài)特征

采集的葉片病斑如圖1 所示，病斑呈黑色，圓形，表面光滑，病斑中心扁平。菌種分離生長形態(tài)如圖2 所示，分離的菌絲在生長速度上并無明顯差異，菌絲長勢和菌絲濃密程度差異不大，菌絲光滑，有光澤，正面呈白色向四周蔓延生長，背面有前期黃色物質析出，后期呈現(xiàn)黑色，菌絲分布茂密，菌落呈半透明狀，無水滴析出。

圖1 白蠟樹病葉

圖2 白蠟樹病葉分離的病菌菌絲形態(tài)

2.2 菌絲DNA 提取及PCR 擴增

利用CTAB 法提取Z3727-10 菌絲總DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，DNA 條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象，檢測結果表明DNA 提取效果良好，基因組DNA 完整，可以用作后續(xù)PCR 試驗。以DNA 為模板，利用真菌鑒定通用引物進行PCR擴增并對結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖3）顯示目的產物條帶大小與預期結果相同。

圖3 ITS-PCR 凝膠電泳檢測

2.3 序列比對

對PCR 產物進行測序，結果顯示，PCR 產物長度為585 bp，且為單峰，表明菌種分離純化成功，無其他雜菌污染，獲得單一菌種。將目的基因序列在NCBI 中進行比對，結果（圖4）表明，與待鑒定菌種相似性最高的菌株為Alternaria alternata，query cover 為100%，per.ident 為100%，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。并對菌種鑒定結果進行系統(tǒng)進化分析，結果如圖5 所示，從圖5中可以看出，Z3727-10 屬于鏈格孢屬（Alternala）。

圖4 序列比對結果

圖5 菌種系統(tǒng)進化發(fā)育樹

3 討 論

鑒定白蠟樹病害的病源菌有助于采取有效措施防治白蠟樹病害，對白蠟樹的生長發(fā)育及相關產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。將病原菌進行分離后培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，測定生長速率難以準確判定病原菌種類，目前多采用ITS等分子鑒定手段對菌種進行鑒定，國際核酸庫信息資源不斷豐富，將ITS序列與GenBank 數(shù)據庫進行Blast 比對，序列相似性≥99%，即可以鑒定為相同種[16]，通過對白蠟樹病害菌種的形態(tài)觀察及基因庫比對，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。

黑斑病菌對多種植物如棗樹、蘋果梨、金刺梨等均可造成危害。研究報道，黑斑病入侵棗樹后，一般在果實白熟期開始顯現(xiàn)癥狀，且病斑多在果實頂端或果實臍部，對果實口感造成影響，嚴重時造成果實腐爛，減產40%[17]。黑斑病菌經果皮入侵，但在果實采摘時無性狀，貯藏時發(fā)病率可高達37%[18]。研究表明，80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑可在室內有效抑制黑斑病菌[19]。因此，鑒定白蠟樹病菌，并及時采取有效防治措施，對保護白蠟樹與減少經濟損失具有重要意義。