陳為峰，王春發(fā)，黃 佳，李 杜，張良波

（1.湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125；2.衡陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 衡陽 421100；3.衡南鴻祥種養(yǎng)專業(yè)合作社，湖南 衡陽 421125）

果實(shí)的甜酸風(fēng)味主要由糖和有機(jī)酸的含量及比例決定，是影響水果感官特性的重要因素[1-2]。黃酮醇類化合物是重要的次生代謝物質(zhì)，不僅能影響植物的生長發(fā)育，在植株抗菌防病方面也發(fā)揮了重要作用[3]。近年來，隨著分子生物技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用越來越廣泛，對(duì)果實(shí)品質(zhì)的研究也已進(jìn)入轉(zhuǎn)錄水平階段[4-5]。例如：李文彬[6]在‘紅陽’獼猴桃果實(shí)中發(fā)現(xiàn)與蔗糖相關(guān)的基因SPS、SPP以及與代謝相關(guān)的基因AI、NI、SuSy、FK和HK，這些基因的表達(dá)水平都隨著果實(shí)糖含量的增加而升高。Zhang 等[7]從桃果實(shí)中克隆出蔗糖代謝酶及碳水化合物變化相關(guān)基因CINV1、CWINV1、CINV2、SUS1、SUT1及SPS1。周蘭[8]的研究表明，CHI、F3H、PAL、FLS等基因在類黃酮化合物合成中起作用，但果實(shí)不同部位這些基因的表達(dá)量不同，在栽培型蘋果的果肉中，類黃酮物質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于果皮。這些與生物代謝相關(guān)的研究結(jié)果為探明果實(shí)生長發(fā)育過程有機(jī)物積累的機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

‘金湘玉’黃桃（Prunus persica'Jinxiangyu'）是湖南省林業(yè)科學(xué)院最新選育出的湖南省首個(gè)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的早熟黃桃新品種，為了探明該品種黃桃果實(shí)的糖成分及類黃酮物質(zhì)的積累代謝規(guī)律，筆者分析了相關(guān)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，以期挖掘出調(diào)控果實(shí)優(yōu)良品質(zhì)形成的關(guān)鍵基因，為實(shí)現(xiàn)黃桃分子育種，加快黃桃新品種更新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試‘金湘玉’黃桃取自湖南省沅陵縣太常安置區(qū)果園（110°21'8.09″E，28°28'7.15″N，海拔120 m）。采樣是從桃樹謝花后20 d 開始，每隔10 d 采摘1 次，果實(shí)開始成熟后5 d 采摘1 次，直到果實(shí)完全成熟。從樹勢(shì)健壯、栽培管理基本一致的3 棵‘金湘玉’果樹樹冠中部位置上分別采摘5 個(gè)大小均勻、無損傷、無蟲害的果實(shí)，去皮切碎后用液氮速凍，置于-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)可溶性糖含量的測(cè)定 可溶性固形物含量參照NY/T2637—2014 采用數(shù)顯手持折光儀進(jìn)行測(cè)定；可溶性總糖含量采用蒽酮硫酸法測(cè)定[9]；果實(shí)中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇含量采用索萊寶科技有限公司的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 果實(shí)黃酮類化合物含量的測(cè)定 稱取0.25 g 果實(shí)樣品，用1.5 mL 酚類提取液（水∶甲醇∶甲酸=25 ∶24 ∶1，體積比，下同）研磨混勻，10 400 r/min離心20 min；經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾上清液，然后用液相色譜檢測(cè)類黃酮含量。流動(dòng)相A（乙腈∶甲酸=9 ∶1）與流動(dòng)相B（水∶甲酸=9 ∶1）的梯度洗脫程序設(shè)置為：95%A 0 min、85%A 25 min、78%A 42 min、64%A 60 min、95%A 65 min，最后平衡5 min，共70 min；流速為1 mL/min；分析柱和保護(hù)柱為ODS-3 色譜柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫35℃；在365 nm 波長下檢測(cè)黃酮醇類化合物的含量。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 根據(jù)‘金湘玉’果實(shí)發(fā)育過程糖分的積累規(guī)律，選取花后30 d（A2）、花后60 d（A5）、花后90 d（A9）3 個(gè)不同發(fā)育期的果實(shí)，作為RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的材料。采用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度與純度，RNA 條帶完整性質(zhì)量結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)；RNA 質(zhì)檢合格后，用 Illumina Hiseq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，該步驟委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。參考基因組版本為Prunus_persica_genome_v2.0.a1（https://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v2.0.a1）。

1.2.4 qRT-PCR 驗(yàn)證 取1μL 質(zhì)檢合格的RNA 樣品按照M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer 3 Plus軟件對(duì)7 個(gè)基因的CDS（Coding sequence）序列設(shè)計(jì)特異性引物，選擇Pp RPL13作為內(nèi)參基因。引物序列見表1，所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：Template DNA 2 μL，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH） 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）or ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95℃ 30 s 預(yù)變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。按照2-ct 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件處理原始數(shù)據(jù)，SPSS19.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Primer3Plus 在線軟件設(shè)計(jì)引物，Origin 2021 軟件作圖或進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)糖積累動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

由圖1 可知，在花后20～90 d 期間，隨著黃桃果實(shí)的不斷發(fā)育，可溶性總糖含量總體呈上升趨勢(shì)，可溶性固形物含量總體呈先降后升的趨勢(shì)?；ê?0～50 d，黃桃果實(shí)的葡萄糖、蔗糖、果糖含量均呈先升后降的趨勢(shì)；花后50～90 d，蔗糖和果糖含量均迅速上升，果糖含量在花后85 d 達(dá)到峰值，含量為54.38 mg/g，蔗糖含量在花后90 d 達(dá)到峰值；山梨醇含量隨果實(shí)成熟整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在花后85 d 含量最低。

圖1 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)發(fā)育過程糖含量的變化

2.2 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)類黃酮物質(zhì)的積累動(dòng)態(tài)變化

由圖2 可知，‘金湘玉’黃桃果實(shí)中，槲皮素苷含量在花后20～50 d 含量較高，隨著果實(shí)逐漸成熟其含量有所下降；山奈素苷含量總體上呈先升后降的變化趨勢(shì)，但波動(dòng)較為平穩(wěn)，在花后80 d 達(dá)到最大值。

圖2 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)發(fā)育過程類黃酮物質(zhì)含量的變化

2.3 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

對(duì)處于發(fā)育關(guān)鍵期（花后30、60、90 d）的‘金湘玉’果實(shí)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果如表2 所示，共獲得3 612 萬～ 4 489 萬條Raw reads，單個(gè)樣品平均獲得40 173 908 條Raw reads，經(jīng)質(zhì)量過濾后平均得到39 969 440 個(gè)Clean reads，且堿基Q20 百分比在96.59%～97.97%之間，均超過了95%，Q30 的百分比在91.09%～93.97%之間，均超過了90%，核苷酸GC 含量在45.81%～47.56%之間，且數(shù)據(jù)整體測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.03%，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好，測(cè)序結(jié)果可進(jìn)行后面的數(shù)據(jù)組裝。

表2 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4 ‘金湘玉’黃桃果實(shí)糖代謝關(guān)鍵基因的篩選

對(duì)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖3 所示，共發(fā)現(xiàn)181 個(gè)基因參與果實(shí)果糖和甘露糖代謝（ko00051）、糖酵解/糖異生代謝（ko00010）、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化（ko00040）、半乳糖代謝（ko00052）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）。其中，有26 個(gè)差異基因參與果實(shí)果糖和甘露糖代謝，有34 個(gè)差異基因參與果實(shí)糖酵解/糖異生代謝，有30 個(gè)差異基因參與戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化，有22、69 個(gè)差異基因分別參與半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝。由此可知，在‘金湘玉’黃桃果實(shí)中參與淀粉和蔗糖代謝的差異基因數(shù)量最多，參與半乳糖代謝的差異基因數(shù)量最少。

圖3 糖代謝途徑差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.5 糖代謝關(guān)鍵基因在‘金湘玉’果實(shí)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)分析

進(jìn)一步對(duì)‘金湘玉’果實(shí)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩對(duì)比，以3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的基因表達(dá)量求平均值，篩選滿足|log2(fc)|＞1、P＜0.05、FDR＜0.05 的顯著表達(dá)的差異基因，結(jié)果如圖4 所示，在淀粉與蔗糖代謝過程中INVA、INV*DC4和SUS3在果實(shí)發(fā)育的過程中表現(xiàn)為顯著下調(diào)，SUS3、INVA基因在花后30 d 的表達(dá)量較高，隨果實(shí)的成熟在花后90 d 幾乎不表達(dá)；SS、SS1、SPS1基因在果實(shí)發(fā)育的過程中表現(xiàn)為顯著上調(diào)，花后90 d 表達(dá)量較高，這與果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖逐漸積累的結(jié)果一致。在果糖和甘露糖代謝過程中，PMI1在果實(shí)發(fā)育的過程中表現(xiàn)為顯著下調(diào)；SDH、PFK3基因在果實(shí)發(fā)育的過程中表現(xiàn)為顯著上調(diào)，其中SDH（Prupe.2G288800_v2.0.a1）基因在3 個(gè)時(shí)期的表達(dá)量都很高，F(xiàn)PKM 值分別為697.63、1 140.78、1 853.14。

圖4 ‘金湘玉’果實(shí)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期糖代謝基因的差異表達(dá)分析

2.6 類黃酮代謝關(guān)鍵基因在‘金湘玉’果實(shí)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)分析

由圖5 可知，在類黃酮生物合成過程中，ANS、DFR、F3H及FLS基因的表達(dá)量在花后30～60 d 呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，花后60～90 d 呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，基因表達(dá)量的FPKM 值在花后90 d 很低；CHI基因的表達(dá)量在花后30～90 d 表現(xiàn)為顯著下調(diào)。苯丙烷類物質(zhì)生物合成中，4CL3基因的表達(dá)量在花后30～90 d 呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，4CL1、PAL1基因的表達(dá)量在花后30～60 d 呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，在花后60～90 d 呈顯著下調(diào)趨勢(shì)。

圖5 ‘金湘玉’果實(shí)3 個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期類黃酮代謝基因的差異表達(dá)分析

2.7 qRT-PCR 驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證‘金湘玉’果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從RNA-Seq 測(cè)序數(shù)據(jù)中挑取與糖代謝相關(guān)的7 個(gè)差異表達(dá)基因（SUS3、SS、SDH、PFK3、SS1、AMY3、SPS1），通過qRT-PCR 對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示，這7 個(gè)基因的qRT-PCR 相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的FPKM 值相對(duì)表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致。這表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)譜結(jié)果是可靠的。

表3 不同方法對(duì)‘金湘玉’黃桃果實(shí)各發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

果實(shí)的內(nèi)外在品質(zhì)是水果質(zhì)量評(píng)估的重要指標(biāo)，是影響果農(nóng)收益和商品市場(chǎng)競爭力的重要因素[10-11]。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同植物果實(shí)中的糖組分及含量不同，甚至同一種果實(shí)不同品種間的糖組分及含量也存在較大差異。張穎[12]的研究發(fā)現(xiàn)，4 種不同桃品種間果糖含量和蔗糖含量存在差異，花后90 d，‘菁香’桃果實(shí)蔗糖含量較高，‘錦繡’黃桃果糖含量最高。前人研究還發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)栽培種的糖類型大多以蔗糖為主。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，‘金湘玉’黃桃幼果發(fā)育期的蔗糖含量極低，該時(shí)期糖分主要以果糖和山梨醇為主，山梨醇含量在整個(gè)果實(shí)生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，說明山梨醇進(jìn)入果實(shí)后不是一直以山梨醇的形式存在，而是會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖；成熟的‘金湘玉’黃桃果實(shí)中果糖的含量最高，使其具有較高的口感甜度。大多數(shù)桃品種的果實(shí)生長期為110～140 d，而‘金湘玉’的果實(shí)生長期較短，為85 d 左右，為早熟品種，由于‘金湘玉’果實(shí)發(fā)育時(shí)間短，因此成熟果實(shí)中蔗糖積累較少。

糖代謝是在相關(guān)酶基因的調(diào)節(jié)下完成的，果實(shí)生長發(fā)育不同階段相關(guān)代謝基因表達(dá)的差異可能導(dǎo)致不同階段糖積累出現(xiàn)差異[13-14]。該研究對(duì)‘金湘玉’果實(shí)發(fā)育3 個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析發(fā)現(xiàn)，具有顯著表達(dá)差異的基因中SS與SS1基因的表達(dá)量水平相差較大，SS基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SS1，這2 個(gè)基因都可以調(diào)控果實(shí)糖分的積累，其中SS基因的調(diào)控作用更明顯；在果實(shí)發(fā)育過程中，SPS1與SPS4的表達(dá)量變化趨勢(shì)不同，其中SPS1基因在花后30 和60 d 幾乎不表達(dá)，在花后90 d 表達(dá)量升高，SPS4花后30 和90 d 表達(dá)量較低，在花后60 d 表達(dá)量稍有升高；INV*DC4和INVA均只在花后30 d 表達(dá)量很高，在花后90 d 幾乎不表達(dá)，且INVA基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于INV*DC4。前人研究表明，幼果中的SUS1更接近典型的SUS。在植物中，SUS1在蔗糖的分解中發(fā)揮主要作用，為細(xì)胞壁構(gòu)建或糖酵解提供底物，隨著果實(shí)的成熟，SUS2活性增加，并在蔗糖的快速積累中發(fā)揮作用[15]。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，SUS2在整個(gè)發(fā)育過程表達(dá)量極低（3個(gè)時(shí)期FPKM 值分別為0.30、25.78、0.01），SUS3基因在幼果期表達(dá)量較高（FPKM 值達(dá)439.96），但隨著果實(shí)的成熟呈下調(diào)趨勢(shì)，因而推測(cè)INVA、SUS3基因在花后30 d 是使蔗糖分解為果糖和葡萄糖的關(guān)鍵基因；2 個(gè)SDH基因的表達(dá)量在花后30～90 d均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，其中SDH（Prupe.2G288800_v2.0.a1）表達(dá)水平較高且持續(xù)上調(diào)，推測(cè)該基因?qū)麑?shí)發(fā)育后期果糖含量的積累調(diào)控作用較強(qiáng)。綜上所述，隨著果實(shí)的成熟，蔗糖合成方向基因SPS1、SS與SS1的表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，對(duì)果實(shí)中蔗糖含量起著關(guān)鍵作用；SUS3、INVA基因在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)水平較高促進(jìn)蔗糖的降解，這些基因的調(diào)控影響著‘金湘玉’果實(shí)糖類含量的變化。

該研究還發(fā)現(xiàn)，參與類黃酮物質(zhì)代謝的相關(guān)基因如ANS、DFR、F3H、FLS、4CL1和PAL1等基因在‘金湘玉’果肉中的表達(dá)量較低，這與果肉中測(cè)出槲皮素苷及山奈素苷含量較低的結(jié)果一致，而這些結(jié)構(gòu)基因相互作用共同影響了類黃酮物質(zhì)的合成。