雷 菲，唐 麗，張治軍，曾建華，陳庭勇，潘孝忠

（海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海南耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南省耕地保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571100）

魚(yú)廢棄物包括魚(yú)頭、魚(yú)尾、魚(yú)皮、鱗片、骨頭、內(nèi)臟、死亡和損壞的魚(yú)等固體廢棄物以及由血液和粘液等組成的液體廢物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年產(chǎn)生的魚(yú)廢棄物超過(guò)2 000 萬(wàn)t[2]，約20%被深加工成肽、魚(yú)油和膠原蛋白等物質(zhì)，其余大部分被傾倒、焚燒或作為廢棄物排入江海[3]，造成了大量的資源浪費(fèi)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。然而，魚(yú)廢棄物含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，可作為原料加工成肥料或飼料，不僅可避免資源的浪費(fèi)，而且可以大大提升魚(yú)廢棄物的利用價(jià)值[4]。

目前，魚(yú)廢棄物加工方式主要包括酶解和發(fā)酵。其中，酶解常用的酶有木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等[5-6]。孫靜[7]采用動(dòng)物蛋白酶和堿性蛋白酶酶解鰹魚(yú)加工廢棄物得到魚(yú)蛋白降解液，濃縮后添加耐鎘菌株粉末制成富集鎘的魚(yú)蛋白有機(jī)液肥；陳杰[8]在羅非魚(yú)下腳料中添加復(fù)合酶BJ 制成氨基酸液體肥。而目前常用的發(fā)酵技術(shù)有單菌發(fā)酵技術(shù)和混菌發(fā)酵技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，采用戊糖片球菌發(fā)酵魚(yú)糜，可抑制腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)，還能提高魚(yú)糜中的低分子肽、非蛋白氮和游離氨基酸的含量[9-10]；吳燕燕等[11]用戊糖片球菌、清酒乳桿菌以及肉葡萄球菌混合發(fā)酵鱖魚(yú)，可縮短發(fā)酵時(shí)間，改善鱖魚(yú)發(fā)酵的品質(zhì)；劉書來(lái)等[12]用植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵鯖魚(yú)加工廢棄物，進(jìn)一步提升了鯖魚(yú)加工廢棄物的游離氨基酸含量。隨著技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們提出了菌酶協(xié)同發(fā)酵的方式。該方式可將發(fā)酵與酶解有機(jī)結(jié)合，有效縮短發(fā)酵時(shí)間，提升發(fā)酵效率[13]。例如：柯玉原[14]用木瓜蛋白酶和產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵鯖魚(yú)加工廢棄物，發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基態(tài)氮含量較不加酶提升了19.51%。

為提高魚(yú)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量，研究以鯖魚(yú)廢棄物為原料，以團(tuán)隊(duì)前期研究篩選得到的最佳菌種（戊糖片球菌）為第一階段發(fā)酵菌種，將酵母菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別與木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合進(jìn)行第二階段發(fā)酵，通過(guò)比較分析發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的變化，篩選出最佳的發(fā)酵方式，為魚(yú)廢棄物發(fā)酵提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鯖魚(yú)廢棄物購(gòu)于海南省文昌市；戊糖片球菌購(gòu)于威明海思（山東）生物工程有限公司，菌活力≥1.0×1010CFU/g；產(chǎn)朊假絲酵母菌購(gòu)于陜西柏科生物科技有限公司，菌活力≥2.0×1010CFU/g；酵母菌購(gòu)于陜西柏科生物科技有限公司，菌活力≥2.0×1010CFU/g；木瓜蛋白酶購(gòu)于陜西柏科生物科技有限公司，酶活力1.0×106U/g；風(fēng)味蛋白酶購(gòu)于陜西柏科生物科技有限公司，酶活力1.0×106U/g。葡萄糖購(gòu)于廣東光華科技股份有限公司，分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)7 個(gè)發(fā)酵處理，分別為：CK，只添加戊糖片球菌進(jìn)行單菌發(fā)酵；FJ，添加戊糖片球菌、酵母菌進(jìn)行分段發(fā)酵；FJM：添加戊糖片球菌、酵母菌和木瓜蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FJF，添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FC，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌進(jìn)行分段發(fā)酵；FCM，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和木瓜蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵；FCF，添加戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵。每處理重復(fù)4 次。

1.2.2 發(fā)酵工藝 將魚(yú)廢棄物洗凈切碎后用打漿機(jī)碎成魚(yú)糜狀，將30 g 魚(yú)糜和10 mL 去離子水加入三角瓶中，75℃巴氏滅菌20 min，制成發(fā)酵基質(zhì)。發(fā)酵分為2 個(gè)階段，第一階段為無(wú)氧發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入戊糖片球菌0.4 g 和高溫滅菌的200 g/L葡萄糖溶液10 mL，在恒溫?fù)u床30℃無(wú)氧發(fā)酵36 h；第二個(gè)階段為有氧發(fā)酵，加入酵母菌0.4 g 或者產(chǎn)朊假絲酵母0.4 g，木瓜蛋白酶0.03 g 或者風(fēng)味蛋白酶0.03 g，在恒溫?fù)u床30℃有氧發(fā)酵66 h。發(fā)酵結(jié)束后取出樣品，置于-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法 試驗(yàn)中游離型氨基酸種類和含量采用超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜法測(cè)定。（1）樣品檢測(cè)前處理。將10 mL 樣本稀釋80 倍，吸取100 mL 到離心管中，加入2 倍體積乙腈，渦旋混勻，-20℃靜置30 min；12 000 r/min 離心10 min，取上清；加入等體積的0.2 mol/L 鹽酸，渦旋混勻，室溫條件下提取1 h；12 000 r/min 離心10 min，取上清；取10 μL 樣品到瓶中，加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate 緩沖液和20 μL AccQ·Tag 試劑，再將反應(yīng)混合物在55℃加熱10 min，冷卻后上機(jī)檢測(cè)。（2）色譜條件。色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為超純水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈（含0.1%甲酸），進(jìn)行梯度洗脫（0 min 乙腈5%，5.5 min 乙腈10%，7.5 min 乙腈25%，8 min 乙腈60%，8.5 min 乙腈5%，13 min 乙腈5%）；流速0.5 mL/min；柱溫55℃；進(jìn)樣量1 μL。（3）質(zhì)譜分析。色譜分離后采用美國(guó)Thermo 公司的Q Exactive 高分辨質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)采集，利用Trace Finder 軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以外標(biāo)法定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel 2007 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計(jì)算，采用SPSS 27.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2021 和Microsoft office Excel 2007 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式對(duì)魚(yú)廢棄物中游離氨基酸種類及含量的影響

由表1 可知，從各處理發(fā)酵產(chǎn)物中均檢測(cè)出21 種游離氨基酸， 其中谷氨酸族6 種，天冬氨酸族6 種，丙酮酸族3 種，絲氨酸族2 種，組氨酸族1 種，芳香族3 種。魚(yú)廢棄物經(jīng)過(guò)不同酶、菌劑發(fā)酵后，各組的游離氨基酸含量存在一定的差異。與CK 相比，F(xiàn)C 的組氨酸、4-羥基-L-脯氨酸和天冬氨酸含量顯著上升，分別增加了14.60%、50.81%和237.21%；FJ 的天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和丙氨酸含量均顯著上升，分別增加了8 051.65%、2 016.39%、2 196.82%、38.86%、280.71%、99.36%、2 391.08%和52.90%；FCF 的甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸也顯著上升，分別增加了32.45%、321.94%和53.18%；FCM 有8 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為19.66%～407.70%，其中天冬氨酸的上升幅度最大；FJF 有15 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為19.77%～9 843.60%，其中天冬酰胺的上升幅度最大；FJM 有16 種氨基酸較CK 顯著上升，增加范圍為18.79%～8 950.21%，天冬酰胺的上升幅度最大。

表1 不同發(fā)酵方式魚(yú)廢棄物中游離氨基酸的種類及含量 （μg/mL）

2.2 不同發(fā)酵方式對(duì)魚(yú)廢棄物中游離氨基酸總量和相對(duì)含量的影響

由圖1 可知，與CK 相比，其他處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量均顯著增加，幅度為12.84%～62.50%，其中FJM 的游離氨基酸總量最高，為23 451.59 μg/mL；其次為FJF，游離氨基酸總量為20 673.52 μg/mL；第三為FCM，游離氨基酸總量為18 990.34 μg/mL。不同發(fā)酵方式對(duì)魚(yú)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的相對(duì)含量也有一定影響，由圖2可知，CK、FC、FJ 和FCF 中游離氨基酸相對(duì)含量最高為組氨酸，F(xiàn)CM、FJF 和FJM 中游離氨基酸相對(duì)含量最高為賴氨酸，組氨酸和賴氨酸占各組總氨基酸的比例為24.37%～32.62%。與CK 相比，F(xiàn)C 和FCF 的丙氨酸相對(duì)含量增加幅度最大，分別為1.52%和2.67%；FJ、FJF 和FJM 的谷氨酰胺相對(duì)含量增加幅度最大，分別為4.57%、4.73%和3.51%；FCM的賴氨酸相對(duì)含量增加幅度最高，為3.97%。

圖1 不同發(fā)酵方式的魚(yú)廢棄物游離氨基酸總量

圖2 不同發(fā)酵方式的魚(yú)廢棄物游離氨基酸相對(duì)含量

2.3 樣品游離氨基酸的主成分分析

利用SPSS 27.0 軟件先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再進(jìn)行主成分分析，得到表2 和表3。由表2 和表3可知，前4 個(gè)主成分的初始特征值均大于1，累積貢獻(xiàn)率為94.05%，因此選擇前4 個(gè)主成分進(jìn)行后續(xù)分析。第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為51.81%，主要影響因子為甘氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和異亮氨酸（載荷系數(shù)≥0.92）；第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為23.18%，主要影響因子為組氨酸、 -氨基丁酸和脯氨酸（載荷系數(shù)≥0.72）；第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為13.39%，主要影響因子為苯丙氨酸和色氨酸（載荷系數(shù)≥0.83）；第四主成分的方差貢獻(xiàn)率為5.66%，主要影響因子為組氨酸和4-羥基-L-脯氨酸（載荷系數(shù)≥0.48）。

表2 主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表3 主成分特征向量及載荷分析

以每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率與4 個(gè)成分累計(jì)貢獻(xiàn)率的比值為權(quán)重系數(shù)，建立魚(yú)廢棄物發(fā)酵液游離氨基酸分類評(píng)價(jià)模型F= 0.55F1+0.25F2+0.14F3+0.06F4，計(jì)算各處理魚(yú)廢棄物發(fā)酵液的綜合得分，以反應(yīng)各樣本經(jīng)不同酶和菌發(fā)酵對(duì)樣品產(chǎn)生游離氨基酸的貢獻(xiàn)。由表4 所示，CK 的綜合得分為-4.57，F(xiàn)C、FJ、FCF、FCM、FJF 和FJM 的綜合得分均高于CK，說(shuō)明經(jīng)過(guò)不同酶和菌發(fā)酵處理后，魚(yú)廢棄物的游離氨基酸含量均得到了提升。FJM 的綜合得分最高，為5.36，說(shuō)明添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵對(duì)魚(yú)廢棄物中游離氨基酸的形成最有利。

表4 不同發(fā)酵方式樣品綜合得分及排序

2.4 聚類分析

為了進(jìn)一步分析不同發(fā)酵方式對(duì)魚(yú)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量的影響，利用SPSS 27.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)歐式距離大于5、小于10 時(shí)，所有樣品可聚為4 類，第一類為CK、FC 和FCF；第二類為FCM；第三類為FJ、FJF；第四類為FJM，說(shuō)明同一類樣品中的氨基酸含量最為相似。當(dāng)歐式距離大于15、小于20 時(shí)，所有樣品可聚為2 大類，其中CK、FC、FCF 和FCM歸為第一大類，F(xiàn)J、FJF 和FJM 歸為第二大類，說(shuō)明同一大類樣品中的氨基酸含量具有一定的相似性。當(dāng)歐式距離為25 左右時(shí)，所有樣品才歸為一類，說(shuō)明第一大類和第二大類樣品的氨基酸含量相似度較低。由此可知，與CK（戊糖片球菌單菌發(fā)酵）相比，分段發(fā)酵以及在分段發(fā)酵基礎(chǔ)上增加酶進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)魚(yú)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量都產(chǎn)生了一定的影響，其中2 次發(fā)酵菌種的選擇對(duì)氨基酸含量影響較大，這與主成分分析的結(jié)果基本一致。

圖3 不同發(fā)酵方式的魚(yú)廢棄物聚類分析樹(shù)狀圖

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用分段發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵均能顯著提高魚(yú)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸含量， 與CK 比，F(xiàn)C、FJ、FCF、FCM、FJF 和FJM處理的發(fā)酵產(chǎn)物中有3～16 種氨基酸含量顯著上升，總氨基酸含量增加了12.84%～62.50%，其中FJM 的總氨基酸含量最高。通過(guò)主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)，添加戊糖片球菌、酵母菌和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行菌酶協(xié)同分段發(fā)酵對(duì)魚(yú)廢棄物中游離氨基酸的形成最為有利。

采用微生物分段發(fā)酵能提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化及次生代謝產(chǎn)物積累量[12,15-16]。劉書來(lái)等[12]用植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行分段發(fā)酵，第二階段發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量較第一階段提高了43.33%。試驗(yàn)結(jié)果表明，與戊糖片球菌單菌發(fā)酵相比，戊糖片球菌與產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸總量增加了12.84%，戊糖片球菌與酵母菌分段發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸總量增加了30.05%。不同酵母產(chǎn)蛋白酶的能力不同，對(duì)蛋白分解的能力也不同，有研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對(duì)氨基酸廢液的同化效果高于產(chǎn)朊假絲酵母[17-18]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，戊糖片球菌與酵母菌分段發(fā)酵產(chǎn)物中的天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、谷氨酸和蘇氨酸含量均較戊糖片球菌與產(chǎn)朊假絲酵母分段發(fā)酵顯著上升，游離氨基酸總量增加了15.25%。

菌酶協(xié)同可以共同促進(jìn)底物酵解，提高蛋白消化率[17]。史路路等[19]用淀粉酶、糖化酶和酵母菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉，發(fā)酵后總氨基酸含量增加了18.88%。筆者在分段發(fā)酵的基礎(chǔ)上，分別添加了風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸總量均進(jìn)一步得到了提升。魚(yú)廢棄物中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下可酶解成氨基酸、小分子肽等物質(zhì)，但不同蛋白酶的酶解效果不同。關(guān)平彥等[20]發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶酶解金槍魚(yú)下腳料的效果優(yōu)于胰蛋白酶和中性蛋白酶。該試驗(yàn)中，與FC 處理相比，F(xiàn)CF 和FCM 處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量分別增加了2.23%和16.61%；與FJ 處理相比，F(xiàn)JF 和FJM 處理發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸總量分別增加了10.15%和24.95%，說(shuō)明此試驗(yàn)中木瓜蛋白酶的酶解效果優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶。