李健玲，秦 波，黃 欣，蔣日紅，孫 苗，梁圣華，黃耀恒，韋廣綏

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530002；2.北京林業(yè)大學(xué)，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.廣西國(guó)有高峰林場(chǎng)，廣西 南寧 530025）

海菜花（Ottelia acuminata）屬水鱉科水車前屬多年生沉水植物，為中國(guó)特有種，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。該植物對(duì)水質(zhì)要求較高，是一種環(huán)境指示性植物，主要分布區(qū)域?yàn)閺V東、海南、廣西、四川、貴州、云南等地[1]。海菜花是一種典型的高鉀低鈉型蔬菜，含有鈣、鐵、蛋白質(zhì)、抗壞血酸、酚類等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的食用價(jià)值；其中酚類物質(zhì)是天然的抗氧化劑，對(duì)DNA 損傷有良好的修復(fù)作用。另一方面，海菜花還能富集重金屬元素鉛，具有一定的生態(tài)修復(fù)價(jià)值[2-3]。目前，關(guān)于海菜花的研究多集中在栽培[4-5]、進(jìn)化和遺傳學(xué)分析[6-7]、化學(xué)成分分析[3]等方面，其分子水平的研究?jī)H有葉綠體基因組的報(bào)道[8]。

分子生物學(xué)技術(shù)在植物領(lǐng)域尤其是農(nóng)作物方面應(yīng)用的較早且深入，但是在水生植物及藥用植物上的研究報(bào)道仍然有限。高通量轉(zhuǎn)錄組作為初步掌握代謝通路和生物合成基因信息的一個(gè)手段，在許多物種中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。為了彌補(bǔ)海菜花轉(zhuǎn)錄組上的空白，研究對(duì)海菜花葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘其重要基因和調(diào)控信息，以期為海菜花功能基因和遺傳多樣性分析及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集新鮮的海菜花葉片，并立即投入液氮中保存。

1.2 海菜花cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

使用Trizol 法對(duì)海菜花的RNA 進(jìn)行提取。利用Illumina TruSeqTM RNA sample prep Kit（Illumina，美國(guó)）方法構(gòu)建海菜花的RNA 文庫(kù)，首先使用帶有Oligo（dT）的磁珠對(duì)帶有polyA 尾巴的mRNA 進(jìn)行富集，并用超聲波將mRNA 進(jìn)行片段化打斷。加入隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系下反轉(zhuǎn)合成第一條鏈的cDNA，之后用RNaseH 清除反應(yīng)中的RNA，在DNA polymerase I 體系下，以dNTPs 為原料進(jìn)行cDNA 第二條鏈的合成。對(duì)合成后的雙鏈cDNA 進(jìn)行純化、末端修復(fù)、加A 尾以及連接測(cè)序接頭，利用AMPure XP beads 對(duì)處理過(guò)的雙鏈cDNA 進(jìn)行篩選，挑出200 bp 左右的片段進(jìn)行擴(kuò)增，之后對(duì)得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，最終產(chǎn)物即為文庫(kù)。

利用瓊脂糖凝膠電泳、NanoPhotometer spectrophotometer、Qubit2.0 Fluorometer、Agilent 2100 bioanalyzer 對(duì)RNA 的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品合格后進(jìn)行測(cè)序。在測(cè)序的flow cell 中加入不同標(biāo)記的4 種dNTP 以及DNA 聚合酶和接頭引物，當(dāng)測(cè)序鏈在延伸互補(bǔ)的時(shí)候，每個(gè)dNTP 會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光，從而被測(cè)序儀捕捉獲得序列信息。

海菜花的RNA 提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序均由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組組裝及分析

使用Trimmomatic 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，Trinity 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組拼接，并使用Salmon 進(jìn)行拼接數(shù)據(jù)的比對(duì)，之后使用Diamond 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行NR數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Port 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，利用eggNOG-mapper 進(jìn)行eggNOG 數(shù)據(jù)庫(kù)和GO 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 海菜花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

對(duì)海菜花的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共檢測(cè)到26 658 026 條reads，共計(jì)3 998 703 900 個(gè)堿基。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控進(jìn)一步去除reads 中的接頭序列、質(zhì)量較低的堿基以及短序列后，得到clean data 的reads 有 26 497 174 條，共計(jì)3 961 376 102 個(gè)堿基，其中Q20%高達(dá)98.90%，Q30%高達(dá)96.19%，GC含量占比為50.57%，表明海菜花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以開展后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

由于海菜花沒(méi)有參考基因組，因此利用Trinity（2.8.6）對(duì)clean data 進(jìn)行從頭組裝，得到組裝后的unigene 有27 040 條，長(zhǎng)度為27 761 688 bp，最長(zhǎng)的unigene 有12 094 bp，N50 為1 340 bp，平均unigene 為1 026.69 bp，其中N50 高于平均長(zhǎng)度說(shuō)明組裝效果較好。同時(shí)，將測(cè)序獲得的高質(zhì)量序列與拼接序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)率達(dá)到86.89%，也表明拼接效果較好。在得到的unigene 中，401～600 bp 的序列長(zhǎng)度占比最大，達(dá)到7 134 條（26.38%），序列長(zhǎng)度分布見圖1。

圖1 海菜花unigene 長(zhǎng)度分布

2.2 海菜花轉(zhuǎn)錄組注釋

將獲得的27 040 條unigene 分別與不同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖2 所示。有18 910 條unigene分別被NR、GO、COG、KEGG、SWISS 這5 大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到，占unigene 總數(shù)的69.93%。其中，NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)到的unigene 最多，有18 874 條，占總數(shù)的69.80%；其次是SWISS 數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)到14 020條unigene，占總數(shù)的51.85%；第三是COG 數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)到13 531 條unigene，占總數(shù)的50.04%；KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)到的unigene 數(shù)量最少，為7 552條，占總數(shù)的27.93%；在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中均比對(duì)到的unigene 有4 819 條，占總數(shù)的17.82%，推測(cè)為新基因。

圖2 海菜花unigene 在各數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果

2.3 NR 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

NR數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋能夠了解海菜花轉(zhuǎn)錄組中序列與哪些物種有同源分布。由圖3 可知，海菜花與搖蚊（Clunio marinus）比對(duì)到的同源序列最多，為2 622 條，占所有比對(duì)到序列的13.89%；其次是油棕（Elaeis guineensis），達(dá)到2 062 條，占10.93%；海棗（Phoenix dactylifera）中比對(duì)到1 646條，占8.72%；另外，芋（Colocasia esculenta）、大葉藻（Zostera marina）、蓮（Nelumbo nucifera）、鳳梨（Ananas comosus）、小果野蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）、沉水樟變型（Cinnamomum micranthumf.kanehirae）、石刁柏（Asparagus officinalis）中 分 別 比 對(duì) 到1 435、947、750、637、570、570、544 條，分別占比7.60%、5.02%、3.97%、3.38%、3.02%、3.02%、2.88%；而其他物種中比對(duì)到的序列數(shù)均低于500 條，總數(shù)達(dá)7 091 條，占比為37.57%。

圖3 海菜花unigene 在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到的同源序列排名前10 的物種

2.4 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

由圖4 可知，海菜花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中共比對(duì)到unigene 13 531 條，但功能未知的基因占多數(shù)，排在KOG 預(yù)測(cè)的第1 位，表明海菜花中有許多序列還未得到有效的驗(yàn)證和研究；其中，轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白（O：Posttranscriptional modification，protein turnover，chaperones），信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（T：Signal transduction mechanisms），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生（J：Translation，ribosome structure and biogenesis），RNA轉(zhuǎn)錄和修飾（A：RNA processing and modification）分別排在KOG 預(yù)測(cè)的第2～5 位，代表了海菜花生長(zhǎng)發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中基本過(guò)程活動(dòng)比較活躍。

圖4 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組COG 功能注釋

2.5 GO 注釋

在GO 注釋中，海菜花共注釋到10 505 條unigene，分為生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3 個(gè)大類和43 個(gè)功能亞類（圖5）。生物過(guò)程注釋到的unigene 最多，亞類中細(xì)胞進(jìn)程和代謝過(guò)程中unigene 數(shù)量最多，而碳利用和生物礦化所占比例最少。在分子功能中，催化活性和結(jié)合比對(duì)到的unigene 數(shù)量最多，蛋白標(biāo)簽、運(yùn)貨受體活性、養(yǎng)分庫(kù)活性和小分子傳感器活性比對(duì)到的數(shù)量較少。在細(xì)胞組分中包括了4 個(gè)亞類，最高的為細(xì)胞解刨學(xué)實(shí)體，最少的為其他器官部分。

圖5 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組GO 注釋結(jié)果

2.6 KEGG 通路分析

為了研究基因具體的功能，對(duì)海菜花轉(zhuǎn)錄組中的unigene 進(jìn)行KEGG 通路分析，共分為5 大類和20 個(gè)亞類（圖6）。第1 大類代謝過(guò)程中比對(duì)到的unigene 數(shù)量最多，包括11 個(gè)亞類，全局和概述圖譜比對(duì)到的數(shù)量最多，達(dá)4 678 條unigene，其次是碳水化合物代謝，比對(duì)上1 047 條unigene，氨基酸代謝、能量代謝、酯類代謝分別比對(duì)到587、498、486 條，表明在細(xì)胞過(guò)程中關(guān)于代謝的基因較多。第2 大類是遺傳信息處理，包括5 個(gè)亞類，翻譯過(guò)程中比對(duì)到的unigene 最多，達(dá)到784 條，其次是折疊、分類和降解，比對(duì)到662 條，病毒信息中比對(duì)到的數(shù)量最少，為46 條。第3 大類為環(huán)境信息處理，包括2 個(gè)亞類，分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（比對(duì)到309條）和膜轉(zhuǎn)運(yùn)（比對(duì)到25 條）。第4 大類為細(xì)胞過(guò)程，包括2 個(gè)亞類，為運(yùn)輸和分解代謝（比對(duì)到427 條）和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（比對(duì)到84 條）。最后1 類為有機(jī)系統(tǒng)，僅包含1 個(gè)亞類，為環(huán)境適應(yīng)，比對(duì)到200 條unigene。

圖6 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組KEGG 注釋分類統(tǒng)計(jì)

2.7 SSR 分析

在海菜花轉(zhuǎn)錄組中共檢索到4 217 個(gè)SSR 位點(diǎn)，包含了6 種核苷酸重復(fù)類型，具體情況如圖7 所示。單核苷酸重復(fù)數(shù)量最多，為1 518 個(gè)，占比為36.00%，A/T 重復(fù)比例最高；其次為三核苷酸重復(fù)，有1 437 個(gè)，占比為34.08%，且類型較多；雙核苷酸重復(fù)為1 214 個(gè)，占比為28.79%，以AG/CT 類型比例最高；四核苷酸位點(diǎn)重復(fù)有34 個(gè)，占比為0.81%；六核苷酸位點(diǎn)重復(fù)有9 個(gè)，占比為0.21%；五核苷酸位點(diǎn)重復(fù)數(shù)最少，僅5 個(gè)，占比0.11%。

圖7 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組SSR 分布情況

3 討 論

海菜花在景觀營(yíng)造、食用和藥用方面有很高的開發(fā)利用價(jià)值。目前，對(duì)水生植物轉(zhuǎn)錄組的研究種類較少，包括圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）[9]、蓮（Nelumbo nucifera）[10-11]、齒葉睡蓮（Nymphaea lotus）[12]、東方澤瀉（Alisma orientale）[13]、芡實(shí)（Euryale feroxSalisb.ex Konig et Sims）[14]等，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其次生代謝物的合成、花開放規(guī)律、脅迫響應(yīng)和遺傳標(biāo)記等進(jìn)行了深入研究。海菜花在生態(tài)適應(yīng)性上對(duì)環(huán)境的要求較高，且有不同的生態(tài)適應(yīng)類群，次生代謝物豐富，對(duì)其進(jìn)行分子層面的深入研究具有重要意義。

該研究在高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的支持下，對(duì)海菜花葉片的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行解讀，共檢測(cè)到unigene 27 040 條，其中有18 910 條unigene 在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)上了，獲得了海菜花中大量的基因信息。在NR 數(shù)據(jù)庫(kù)得到了最多的基因注釋，共18 874 個(gè)，與植物同源基因比對(duì)最多的是油棕，另外包括芋、大葉藻、蓮和鳳梨等，這些植物類型均屬于濕生環(huán)境，表明海菜花可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生態(tài)適應(yīng)方面與濕生植物有相似的基因調(diào)控類型。在KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中，海菜花與已知基因比對(duì)上最多的基因涉及轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白等方面。對(duì)基因通路進(jìn)行KEGG 分析，共比對(duì)到7 552 個(gè)unigene，以細(xì)胞過(guò)程比對(duì)到的unigene 最多，且與代謝途徑密切相關(guān)；另外，在GO注釋中，生物過(guò)程注釋到的unigene最多，表明在海菜花葉片中新陳代謝活動(dòng)較為旺盛。SSR分析中單核苷酸、雙核苷酸和三核苷酸重復(fù)是主要類型，占比達(dá)98.87%，這些位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)海菜花的分子標(biāo)記開發(fā)和利用具有重要價(jià)值，能為植物鑒定、遺傳育種和藥理研究提供直接的證據(jù)。

通過(guò)對(duì)海菜花葉片進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了大量的基因序列信息和注釋信息，為海菜花的功能基因和遺傳多樣性分析及分子育種奠定了基礎(chǔ)，也為海菜花的生態(tài)適應(yīng)性、食用和藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。