丁志榮 曾海文 林天來 陳偉文

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,泉州 362000)

從定植到侵襲性感染,曲霉與許多下呼吸道疾病有關(guān)。大多數(shù)這類疾病要么免疫反應(yīng)過度(如過敏),要么免疫反應(yīng)不足[如侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)]。IPA是最嚴重的曲霉相關(guān)感染類型,預(yù)后最差[1-2],死亡率高達50%[3]。已知的IPA危險因素包括以下幾種免疫抑制狀態(tài):長時間中性粒細胞減少癥、T細胞缺陷、血液系統(tǒng)惡性腫瘤伴或不伴干細胞移植、獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)、慢性肉芽腫病、實體器官移植和長時間大劑量類固醇治療[4-6]等。IPA的發(fā)病率正在增加,且在非免疫功能低下患者中也有越來越多的報道,特別是在危重癥患者中[7-8],一項對尸檢結(jié)果的研究顯示,盡管診斷技術(shù)的改進,75%的侵襲性真菌疾病不能在死前診斷出來[9]。研究顯示接受伏立康唑預(yù)防和未接受伏立康唑預(yù)防的血液病合并IPA患者90 d死亡率分別為46%和59.3%[10],延遲診斷和治療是IPA高死亡率的重要原因[11]。

本研究通過外周血宏基因組二代測序(mNGS)識別IPA,證明其在IPA臨床診斷中具有重要作用?，F(xiàn)報道3例患者的臨床癥狀、診斷、治療及預(yù)后。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科在2020年9月9日至2022年9月15日3例外周血mNGS檢測曲霉陽性的患者,并記錄人口學(xué)資料、臨床癥狀、影像學(xué)檢查結(jié)果、實驗室檢查結(jié)果、治療和預(yù)后。根據(jù)2019年歐洲癌癥研究和治療組織和真菌病研究小組(EORTC/MSG)標準,我們將IPA分為確診、臨床診斷和擬診。同時各病例檢測血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)1,3-β- D -葡聚糖(G)試驗、半乳甘露聚糖(GM)試驗,G試驗陽性閾值為70 pg/mL,GM試驗陽性閾值為1.0 μg/L[12]。所有數(shù)據(jù)在分析前均為匿名數(shù)據(jù)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 mNGS[操作步驟[13-14]

①臨床樣本按照嚴格的無菌處理標準采集。使用HostZEROTM Microbial DNA Kit試劑盒提取DNA。②文庫構(gòu)建和測序:使用KAPA HyperPlus Library Preparation Kit試劑盒,按照操作說明構(gòu)建文庫;使用Agilent 2100 Bioanalyzar 對文庫插入片段的長度進行質(zhì)控分析,應(yīng)用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)質(zhì)控文庫濃度;測序進行使用NextSeq CN500平臺。通過分析去除低質(zhì)量和長度小于35 bp的序列進行生物信息分析;然后對比計算減去人類參考基因組使用Burrows-Wheeler,去除的低復(fù)雜度的序列的數(shù)據(jù)同時對比到病毒、細菌、真菌和寄生蟲4個微生物基因組數(shù)據(jù)進行分類,生成高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。下載自國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)分類參考(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)。宏基因組分析解釋的閾值標準:對于不同類型的微生物,閾值設(shè)置如下,細菌≥50;真菌/支原體/衣原體:序列數(shù)≥3;DNA病毒:序列數(shù)≥3;寄生蟲:序列數(shù)≥100;結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(MTC):序列數(shù)≥1[15]。

2 結(jié) 果

2.1 診斷流程

3例經(jīng)外周血mNGS檢測為曲霉陽性的患者,其他檢查結(jié)果均證實3例患者均有IPA。納入患者的流程圖如圖1所示。

圖1 3例IPA診斷過程Fig.1 The diagnostic process of 3 cases

2.2 病例描述

病例1,男性,41歲,2020年9月9日,因“咳嗽、氣喘伴發(fā)熱4 d”急診入院,2020年9月5日開始出現(xiàn)咳嗽,可咳出少許白色稀痰,伴氣喘無法平臥休息,發(fā)熱體溫最高達40 ℃,就診當?shù)蒯t(yī)院予頭孢替安、左氧氟沙星抗感染氣喘未見改善,仍反復(fù)發(fā)熱。否認任何基礎(chǔ)性疾病,否認吸煙史,機會性飲酒,具體飲酒量不祥。實驗室檢查(見表1):白細胞計數(shù)14.27×109/ L;紅細胞計數(shù)4.84×1012/ L;血紅蛋白162 g/L;血小板132×109/ L;中性粒細胞13.21×109/ L;淋巴細胞4.1×109/ L;降鈣素原0.3 ng/ml;C -反應(yīng)蛋白60.5 mg/L;2020年9月14日胸部CT:雙肺紋理增多(見圖2A、B)。入院診斷:重癥肺炎,呼吸衰竭。入院后給予無創(chuàng)呼吸機輔助通氣,亞胺培南西司他丁抗感染、甲潑尼龍抗炎等處理。入院23 h后因呼吸衰竭加重轉(zhuǎn)入重癥醫(yī)學(xué)科予氣管插管接呼吸機輔助通氣,并加左氧氟沙星抗感染等處理,同時進行了痰培養(yǎng),BALF培養(yǎng),外周血mNGS、血G試驗和GM試驗等檢查。呼吸衰竭未見改善,仍反復(fù)發(fā)熱。2020年9月12日,外周血mNGS檢測提示煙曲霉感染(見表2)。2020年9月13日,痰培養(yǎng)及肺泡灌洗液培養(yǎng)提示煙曲霉;2020年9月14日血清G試驗檢測:316.7 pg/mL,GM試驗:4.375 μg/L;肺泡灌洗液G試驗:272 pg/mL,肺泡灌洗液GM試驗4.43 μg/L。外周血mNGS檢測陽性后予伏立康唑抗真菌治療,4 d后因Ⅱ型呼吸衰竭死亡。

表1 實驗室檢查和治療Tab.1 Laboratory examination and treatment

表2 外周血mNGS結(jié)果Tab.2 Results of peripheral blood mNGS

圖2 胸部CT表現(xiàn):病例1胸部CT(A、B)雙肺紋理增粗,可見樹芽征;病例2胸部CT(C、D)雙肺多發(fā)條索狀、斑片狀高密度影,雙肺實質(zhì)密度減低,可見多發(fā)囊泡狀低密度影;病例3胸部CT(E、F)可見多發(fā)斑片狀、條索狀高密度影,右側(cè)胸腔見少量胸腔積液Fig.2 Findings of chest CT scan: Chest CT (A and B) of case 1 showed bilateral lung texture thickening and tree-in-bud sign. The chest CT of case 2 (C, D) showed multiple cords and patchy high-density shadows in both lungs, and the density of bilateral lung parenchyma was reduced, with multiple vesicular low-density shadows. Chest CT(E, F) of case 3 showed multiple patchy and cord-like high-density shadows, and a small amount of pleural effusion in the right thorax

病例2,男性,78歲,因“咳嗽、咳痰、氣喘40年,加重并發(fā)熱12 d”2022年7月24日急診入住重癥醫(yī)學(xué)科。有反復(fù)氣喘發(fā)作住院治療病史,并長期不規(guī)則布地奈德粉吸入劑(普米克都保)控制癥狀。既往有高血壓病史20余年,未規(guī)則監(jiān)測及控制血壓;吸煙50余年,20支/天。查體:體溫38 ℃,呼吸40次/分,桶狀胸,雙肺呼吸音低,未聞及干濕性啰音。肺部CT提示雙肺炎癥,慢性支氣管炎,肺氣腫(見圖2C、D)。入院診斷:重癥肺炎,Ⅱ呼吸衰竭,慢性阻塞性肺疾病急性加重。入院后予氣管插管接呼吸機輔助通氣,并與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合伏立康唑抗感染治療及對癥處理,同時送檢痰培養(yǎng)、支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng),支氣管肺泡灌洗液G/GM試驗,外周血G/GM試驗,支氣管肺泡灌洗液和外周mNGS。2022年7月25日外周血mNGS提示煙曲霉及黃曲霉感染(見表2);肺泡灌洗液mNGS提示屎腸球菌、白念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、單純皰疹病毒1型;血G試驗:489.1 pg/mL,血GM試驗:3.49 μg/L;肺泡灌洗液G試驗:>600 pg/mL,肺泡灌洗液GM試驗4.21 μg/L(見表1);2022年7月27日痰培養(yǎng)結(jié)果為煙曲霉。經(jīng)治療病情未改善2022年7月29日放棄治療死亡。

病例3,女性,62歲,2021年7月26日診斷為T淋巴母細胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/L),給予CHOP方案(環(huán)磷酰胺+表柔比星+長春地辛+潑尼松)化療8個療程。2022年8月25日再次入院予原方案化療,化療后出現(xiàn)骨髓抑制(見表1)。2022年9月9日出現(xiàn)發(fā)熱,最高體溫40 ℃,血液內(nèi)科給予哌拉西林/他唑巴坦抗感染治療,未見改善,2022年9月11日出現(xiàn)意識模糊,呼吸困難,血壓下降,行肺部CT提示:雙肺炎癥(見圖2E、F),考慮膿毒癥,呼吸衰竭轉(zhuǎn)入重癥醫(yī)學(xué)科。給予萬古霉素聯(lián)合亞胺培南西司他丁、氟康唑抗感染,同時送檢痰培養(yǎng)、肺泡灌洗液培養(yǎng)、血G試驗、GM試驗,外周血mNGS等檢查。2022年9月13日外周血mNGS提示銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、黃曲霉、屎腸球菌(見表2),調(diào)整氟康唑為伏立康唑抗真菌。2022年9月12日血G試驗<37.5 pg/mL,血GM試驗1.98 μg/L。2022年9月14日血培養(yǎng)提示銅綠假單胞菌、屎腸球菌,痰培養(yǎng)、支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果為黃曲霉。2022年9月15日因膿毒癥休克、呼吸衰竭死亡。

3 討 論

近年來,侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的發(fā)病率迅速增加,據(jù)估計,全世界每年的患者人數(shù)已從20萬增加到30多萬,年平均發(fā)病率為4.1例/10萬人,易發(fā)生在免疫抑制患者,其中IPA占90%以上,并且死亡率也非常高[16]。目前臨床上IPA常用的診斷方法包括胸部計算機斷層掃描(CT)、半乳甘露聚糖試驗、直接顯微鏡檢查、真菌培養(yǎng)、血漿、血清、全血或支氣管肺泡灌洗液(BALF)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和組織病理學(xué)等。IPA的胸部CT可表現(xiàn)為暈征、空氣新月征、樹芽征等,但在細菌感染、伴有組織性肺炎的閉塞性細支氣管炎、伴有多血管炎的肉芽腫病、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥和局灶性肺損傷中也能觀察到,圖像往往是非典型的,很難通過影像學(xué)與其他感染相區(qū)分。1,3-β- D -葡聚糖試驗、GM試驗、直接鏡檢、真菌培養(yǎng)等也有敏感性低、特異性差的缺點[17-18]。盡管組織病理學(xué)是金標準,但血液病、重癥患者的身體狀況和凝血功能往往很差,有創(chuàng)獲取組織標本的方法往往難以耐受。BALF基因檢測的敏感性和特異性均高于血液基因檢測和培養(yǎng)[17],患者病情危重時難以接受氣管鏡檢查,使其臨床應(yīng)用受到很大限制,因此,非常需要一種快速且無創(chuàng)的方法來準確診斷IPA。

宏基因組二代測序(mNGS)是一種無偏倚的方法,理論上可以檢測臨床樣本中的所有病原體,特別適用于罕見、新穎和非典型的復(fù)雜傳染病病因,比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法靈敏度更高[19]。雖然曲霉很難在外周血中生長,但生長在肺泡中的菌絲可以穿透空氣和血液屏障,侵蝕毛細血管內(nèi)皮細胞,侵入小動脈和肺實質(zhì),在這個過程中,DNA片段可能會進入血液,所以外周血PCR檢測可用于診斷IPA,PCR檢測提高了曲霉早期診斷的可能性,PCR技術(shù)檢測曲霉存在方法學(xué)標準化困難,對實驗場地的配置、實驗操作規(guī)范性、操作人員的要求較高,以及傳統(tǒng)PCR、巢式PCR技術(shù)存在容易污染樣本、假陽性率高、不能量化等缺點,未能大規(guī)模應(yīng)用。已證實血漿mNGS可以識別重癥細菌性肺炎患者呼吸道病原體進入血循環(huán)中DNA[20],但血漿mNGS能否用于IPA的診斷尚不清楚。本研究3例患者均通過外周血mNGS及時被診斷為曲霉感染,病例2和病例3還發(fā)現(xiàn)為混合感染,治療期間血培養(yǎng)未能培養(yǎng)出曲霉,我們的研究表明,外周血mNGS可以同時檢測引起肺部感染的細菌和真菌感染,有助于快速明確病情和調(diào)整治療方案。Hong等[21]在2018年首次使用血漿NGS技術(shù),確診的侵襲性真菌感染的病原體,包括曲霉菌屬和非曲霉菌屬,在9例患者中,7例血漿NGS上檢測到活檢中發(fā)現(xiàn)的相同真菌。我們的研究也證實了外周血mNGS可以用于IPA的診斷,但外周血mNGS的檢測效率還需要大規(guī)模的臨床試驗來證實。本研究3例患者均在發(fā)熱后采集外周血標本,病程中未再進行外周血mNGS檢測,因此,曲霉cfDNA何時會存在于外周血中,何時采集外周血、外周血采血消毒標準怎么把握也尚不清楚,運用外周血mNGS診斷IPA仍然是需要進一步探索的課題。

本研究有一定的局限性。首先,這是一項回顧性研究,可能存在一定的偏倚。第二,本研究3例患者因血小板低或身體狀況不佳,不能耐受CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺或氣管鏡下氣管穿刺,沒有病理結(jié)果,雖然3例病例都有微生物學(xué)證據(jù)且G試驗、GM試驗陽性,但它們畢竟不是IPA診斷的金標準,所以存在不是曲霉感染的可能性。第三,本研究樣本量非常小,診療過程中也只進行了1次的外周血mNGS,無法確定曲霉cfDNA在外周血中的存在時間。

綜上所述,本研究證實了通過外周血mNGS檢測曲霉cfDNA可用于IPA的診斷,且是一種快速、簡單、無創(chuàng)的診斷方法,但目前mNGS檢測費用昂貴,臨床運用受到一定的限制。