李錦 努爾比耶姆·阿布力克木 王剛 李嫣然 劉露露 姜春暉 王曉東 姜濤 和清源 王云玲 王儉

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科,烏魯木齊 830011;2.北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科 磁共振設(shè)備與技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

隱球菌屬中的新生隱球菌和哥特隱球菌是主要致病菌,具有嗜中樞性,每年導(dǎo)致全球100萬例患者感染和60萬例免疫抑制患者(艾滋病、移植受者)因機(jī)會性侵襲性感染而死亡[1]。 腦隱球菌感染一般表現(xiàn)為腦膜腦炎,14%～25%的患者可發(fā)生腦實(shí)質(zhì)隱球菌肉芽腫[2-3],其隱匿的臨床表現(xiàn)和緩慢發(fā)作的癥狀[4],易造成漏診誤診。目前動物模型可復(fù)制臨床上不常見的疾病,避免人體實(shí)驗(yàn)造成的傷害,同時獲得人類臨床研究難以獲取的資料。MRI可以提供動物模型與人類疾病相似圖像結(jié)果。因此建立有效的腦隱球菌感染模型,探討MRI影像學(xué)表現(xiàn),可為腦隱球菌研究提供與人體接近的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图霸u估方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供清潔級SD(Sprgue-Dawley)大鼠30只,對大鼠進(jìn)行編號及體質(zhì)量測量,均為雌性,4～5月齡,體重250 g左右,于自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi)喂養(yǎng)。

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會論證、批準(zhǔn)實(shí)施(審批號:20190225-100)。

1.2 隱球菌菌株培養(yǎng)稀釋與制備

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科復(fù)蘇傳代成功的A型新生隱菌轉(zhuǎn)種于YPD(yeast extract peptone dextrose medium)培養(yǎng)基中,將傳代成功的菌苔稀釋于10 mL生理鹽水,使用微量移液器取1 μL混懸液置于細(xì)胞計數(shù)板表面,按技術(shù)規(guī)程進(jìn)行計數(shù),至少計數(shù)兩次,取其平均值,配置成濃度為1×106CFU/mL混懸液備用。

1.3 動物模型建立

大鼠麻醉(肌注舒泰10 mg/kg +鹽酸賽拉嗪10 mg/kg)成功后,立體定位儀固定鼠腦,按《大鼠腦立體定位圖譜》[5]定位標(biāo)記尾狀核(前囟:前1 mm,右/左3.5 mm)作為針刺點(diǎn)。術(shù)區(qū)備皮,剃去頭頂毛發(fā)暴露囟門,1%濃度碘伏消毒,切開并分離皮下組織及骨外膜;顱骨鉆顱骨鉆孔,骨穿刺針垂直穿刺,有落空感時拔出針芯;10 μL微量進(jìn)樣器吸取10 μL稀釋備用的菌懸液,緩慢垂直進(jìn)針約4 mm,以1 μL/min勻速注射入尾狀核,注射完畢后停針8 min,緩慢旋轉(zhuǎn)拔針2 min,拔針紗布按壓,顱骨鉆孔處骨蠟封閉,外科線縫合,留觀至麻醉蘇醒。

1.4 MRI檢測與MRI圖像判讀

大鼠分別于造模后14 d、21 d、28 d行MRI掃描監(jiān)測接種情況。大鼠麻醉平穩(wěn)后,使用德國西門子Skyra 3.0TMRI成像設(shè)備、8通道相控矩陣腕關(guān)節(jié)線圈進(jìn)行頭顱掃描,大鼠取俯臥位置頭于線圈中心固定,保持呼吸道通暢,掃描序列包括T1WI、T2WI序列。

掃描參數(shù)如下:T1WI(T1加權(quán)像):TE(回波時間)=3.7 ms,TR(重復(fù)時間)=1500 ms,FA(翻轉(zhuǎn)角)=9°,TI(翻轉(zhuǎn)時間)=900 ms,層厚=1 mm,FOV(掃描野)=267 mm,體素=0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm;T2WI(T2加權(quán)像):TE=92 ms,TR=3620 ms,FA=120°,層厚=2 mm,FOV=80 mm,分辨率=256×256。采集圖像后,由兩名影像科醫(yī)生進(jìn)行分析、判讀,討論影像學(xué)表現(xiàn),確定模型結(jié)果。

1.5 病理標(biāo)本采集與研究

MRI掃描圖像采集完以頸椎脫位法處死大鼠,將所有死亡的大鼠腦與顱骨分離,觀察大腦形態(tài), 切開測量腫瘤大小, 行病理切片制作與HE染色,將制好的病理切片置于電子顯微鏡下,由兩名動物實(shí)驗(yàn)中心病理醫(yī)生閱讀切片,分析、確定結(jié)論。

2 結(jié) 果

2.1 MRI表現(xiàn)

隱球菌肉芽腫形成MRI表現(xiàn):尾狀核可見類圓形或結(jié)節(jié)樣異常信號影,T1WI低信號、T2WI高信號。隱球菌性腦膜腦炎MRI表現(xiàn):尾狀核腦膜、室管膜明顯線樣異常信號改變,伴側(cè)腦室不同程度水腫。無異常組:腦實(shí)質(zhì)及腦膜未見明顯異常信號。

2.2 建模成功率與動物生存

第14天建模成功率43.33%:30只SD大鼠腦感染隱球菌模型中1只于造模后第2天死亡;9只(30%)形成隱球菌肉芽腫;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎;16只(53.33%)未見明顯異常;其中1只大鼠于14 d常規(guī)MRI掃描后死亡,MRI未見明顯異常。

第21天建模成功率60%:28只腦隱球菌感染模型鼠中14只(46.67%)表現(xiàn)為隱球菌肉芽腫形成,7只與第14天MRI表現(xiàn)無差別,3只由腦膜腦炎演變,4只由無異常演變;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎,1只與14 d MRI表現(xiàn)無差別,3只由無異常演變;10只(33.33%)未見明顯異常。2只由肉芽腫演變。

第28天建模成功率73.33%:28只腦隱球菌感染模型鼠中18只(60%)表現(xiàn)為隱球菌肉芽腫形成,14只與21 d MRI表現(xiàn)無差別,4只由無異常演變;4只(13.33%)隱球菌性腦膜腦炎;6只(20%)未見明顯異常。

2.3 病理結(jié)果(HE染色)

隱球菌肉芽腫病灶肉眼觀鼠腦尾狀核區(qū)、部分腦表面可見黃色濃稠滲出液和壞死灶,鏡下觀可見由淋巴細(xì)胞及多核巨細(xì)胞構(gòu)成的肉芽腫灶,內(nèi)見大量類圓形藍(lán)染真菌孢子聚集(見圖1)。

圖1 SD大鼠腦感染隱球菌肉芽腫鏡下病理圖像,HE染色10×10倍鏡下(A)見腦實(shí)質(zhì)多發(fā)囊腔,腦實(shí)質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤;HE染色40×10倍鏡下(B)見腦實(shí)質(zhì)散在大量類圓形藍(lán)染真菌孢子Fig.1 Microscopic pathological observations of cryptococcal granu-loma of the brain, under 10×10 fold microscope (A) with HE staining, multiple cysts and inflammatory cell infil-tration in brain parenchyma were seen; under the 40×10 fold microscope (B) with HE staining, a large number of round-like blue-stained fungal spores were scattered in the brain parenchyma

腦膜腦炎病灶肉眼觀鼠腦尾狀核區(qū)局部充血水腫,鏡下觀可見腦膜和/或腦室管膜多發(fā)類圓形藍(lán)染真菌孢子。

無異常組肉眼觀鼠腦組織大體未見明顯異常,鏡下觀未見真菌孢子浸潤。

3 討 論

隱球菌是一種具有多糖的孢子囊的酵母菌,是影響神經(jīng)系統(tǒng)的最普遍的真菌[6],可以感染免疫低下和免疫正常的個體,在免疫功能低下的患者中更常見,如細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能受損的患者、血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者、實(shí)體器官移植受者以及接受長期皮質(zhì)類固醇或其他免疫抑制治療的患者[7]。腦隱球菌感染臨床表現(xiàn)無特異性,隱球菌性腦膜腦炎患者通常在2～4周內(nèi)出現(xiàn)頭痛、嗜睡、發(fā)燒等亞急性癥狀, 僅1/4的患者出現(xiàn)典型的頸部僵硬等腦膜腦炎癥狀[8],免疫功能低下患者隱球菌感染易與其他疾病重疊,導(dǎo)致延遲診斷增加神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的風(fēng)險[9],致使隱球菌引起的腦損傷難以正確診斷和有效治療,因此快速鑒別診斷和早期治療對于獲得良好結(jié)果至關(guān)重要[10]。

建立動物模型是研究隱球菌的方法之一,根據(jù)研究需求,選擇合適的動物模型及建模方式是研究的關(guān)鍵。研究表明小鼠對隱球菌天然易感,但小鼠體型小,血、腦脊液含量少,無法進(jìn)行一些精細(xì)操作;家兔隱球菌性腦膜腦炎模型則需使用免疫抑制劑[11]。大鼠與人類的生理具有很高的相似性,容易外科操作處理,表現(xiàn)出較少的應(yīng)激反應(yīng)。此次實(shí)驗(yàn)大鼠建模后存活率93.33%,死亡率僅6.67%,提示存活率高、可行性強(qiáng),大鼠可以作為腦隱球菌感染的建模對象。接種方式的選擇,既往研究隱球菌大鼠模型氣管接種主要用于建立隱球菌肺炎模型[12],很難建立顱內(nèi)感染模型;靜脈注射和腹腔注射可以感染腦或肺,但感染的程度可能不同,無法控制實(shí)驗(yàn)變量的統(tǒng)一[11],所以選擇直接顱內(nèi)注射,不僅感染方式直接,減少干擾因素,而且此方式易致病并易動態(tài)觀察感染狀態(tài)。研究結(jié)果顯示大鼠隱球菌感染模型成功率為73.33%,形成腦隱球菌肉芽腫60%,形成腦膜炎13.33%,表明直接顱內(nèi)注射可得到較高的致病率和較高的致病性,可以建立較好的隱球菌感染動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

MRI是一種多功能且無創(chuàng)的成像方式,具有出色的穿透深度、組織覆蓋率和軟組織對比度[13],且人們越來越重視對使用大鼠模型在腦部疾病與藥物干預(yù)的縱向研究中MRI的應(yīng)用[14]。相關(guān)研究報道,在隱球菌性腦膜腦炎發(fā)生前2個月時, CT常規(guī)掃描可無異常發(fā)現(xiàn),但MRI優(yōu)于CT,可為臨床的早期診斷和處理提供依據(jù)[15]。此次實(shí)驗(yàn)以第28天MRI影像表現(xiàn)為最后結(jié)果,4只(13.33%)大鼠形成隱球菌腦膜腦炎,隱球菌穿透腦膜血管壁,遷移到 Virchow-Robin(血管周圍)[16]間隙,隨后隨著炎癥細(xì)胞的激活和黏液物質(zhì)的沉積而擴(kuò)張形成膠狀假囊[17]在MRI表現(xiàn)為尾狀核腦膜、室管膜線樣異常信號改變,伴側(cè)腦室不同程度水腫。18只(60%)大鼠形成腦隱球菌肉芽腫形成,大量生物體和凝膠狀物質(zhì)[18]增殖形成肉芽腫[19]。凝膠狀物質(zhì)在T1WI顯示低信號,T2WI 成像顯示圍繞高信號中心的低信號環(huán)。此次實(shí)驗(yàn)大鼠腦隱球菌肉芽腫在MRI上表現(xiàn)為尾狀核類圓形或結(jié)節(jié)樣異常信號影,T1WI低信號T2WI高信號。本實(shí)驗(yàn)利用MRI對大鼠隱球菌的建模進(jìn)行評估,探討每一只大鼠在造模初期、中期、晚期影像學(xué)表現(xiàn),與病理結(jié)果比較,結(jié)果高度一致,核磁判斷感染準(zhǔn)確率高,表明MRI是評估隱球菌感染的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于僅掃描了MRI常規(guī)序列,對隱球菌性腦膜腦炎感染的影像學(xué)表現(xiàn)探討欠佳;但是成功建立了大鼠顱內(nèi)隱球菌感染模型,并且能夠確保建模后大鼠的存活率及建模成功率,MRI可以清楚的顯示大鼠腦內(nèi)病變,一定程度上反映病理學(xué)特征。綜上所述,大鼠顱內(nèi)隱球菌感染模型可為未來中樞神經(jīng)隱球菌感染研究提供與人體接近的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?MRI在評估腦隱球菌感染方面有良好的價值。

致謝:感謝海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(上海長征醫(yī)院)皮膚科,上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳敏老師對新生隱球菌培養(yǎng)及傳代技術(shù)的支持。