朱佳威,葛海雅,耿秋東,沈默金,李楠,2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122; 2.中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、活動(dòng)受限、畸形甚至殘疾為主要臨床表現(xiàn)[1]。最新研究顯示,我國(guó)癥狀性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(診斷明確,存在膝關(guān)節(jié)疼痛等癥狀且需要就診)的患病率約為8.1%,且呈現(xiàn)出患病率逐年上升、確診年齡逐年下降的趨勢(shì)[2-3]。在臨床實(shí)踐中,中醫(yī)藥防治膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的療效顯著。

化濕定痛湯是王和鳴教授根據(jù)我國(guó)著名中醫(yī)骨傷科專家林如高的經(jīng)驗(yàn)方化裁而來,其主要成分包括蒼術(shù)、炮穿山甲、山藥、五加皮、羌活、獨(dú)活、當(dāng)歸、肉桂、甘草等。該方具有化濕散瘀、溫經(jīng)止痛之功,可顯著改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀。前期有關(guān)化濕定痛湯的研究表明,首先,其可通過減少滑膜組織中炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌,降低環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達(dá)及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成,從而減輕關(guān)節(jié)周圍組織炎癥,緩解膝關(guān)節(jié)疼痛;其次,其可抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路下游凋亡相關(guān)因子p53釋放,從而減少軟骨細(xì)胞凋亡[4-5]。但化濕定痛湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的具體作用機(jī)制仍不明確,有待進(jìn)一步研究。

代謝組學(xué)作為近年來迅速發(fā)展的一項(xiàng)技術(shù),在疾病的早期診斷、機(jī)制研究及藥物研發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[6]。因此,本研究擬通過膝關(guān)節(jié)腔注射Ⅱ型膠原酶建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型,進(jìn)而對(duì)大鼠血清代謝物進(jìn)行鑒定與分析,旨在挖掘重要的代謝物及代謝通路,為化濕定痛湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物選取SPF級(jí)SD大鼠28只,8周齡,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。動(dòng)物在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(閩)2019-0007。每籠4～5只,雌雄分開飼養(yǎng),環(huán)境溫度20～25 ℃,濕度50%～60%,光暗循環(huán)為12 h/12 h,普通飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),倫理審批編號(hào):FUTCM-201928。

1.2 藥物與試劑甲醇(Honeywell,貨號(hào):34741);乙腈(Honeywell,貨號(hào):34726、09676);甲酸、Ⅱ型膠原酶(SIGMA,F0507、C-6885);烏拉坦(上海源葉生物科技有限公司,貨號(hào):S11036);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):EK0393)。

1.3 儀器恒溫烘箱離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific,型號(hào):51028112、Heraeus Fresco17);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Ika,型號(hào):RV10V);超高效液相色譜儀、液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀(Sciex,型號(hào):ExionLC、TripleTOF 5600);電子天平(Sartorius,型號(hào):BSA124S-CW);純水/超純水一體化系統(tǒng)(Merck Millipore,型號(hào):明澈D24 UV);色譜柱(Waters,型號(hào):ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 μm,2.1 mm×100 mm)。

2 方法

2.1 藥物制備化濕定痛湯組成包括:蒼術(shù)6 g,炮穿山甲6 g,山藥9 g,五加皮9 g,羌活6 g,獨(dú)活6 g,當(dāng)歸6 g,肉桂1 g,甘草3 g,由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供。所有藥材煎煮前用水浸泡30 min,武火煮沸后,文火煎煮30 min,過濾藥液;藥渣加入冷水,以同樣方法煎煮并過濾藥液。將兩次所得藥液合并,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,最終得到濃度為0.5 g·mL-1的藥液,保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備采用膝關(guān)節(jié)腔注射Ⅱ型膠原酶[7]的方法制備膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,具體步驟為:造模第1天和第4天,腹腔注射烏拉坦溶液(200 g·L-1)麻醉大鼠[8],屈曲大鼠膝關(guān)節(jié),用記號(hào)筆標(biāo)記膝眼位置,手持1 mL注射器垂直進(jìn)入膝眼,針下有落空感則說明注射位置正確,隨即注入50 μL Ⅱ型膠原酶溶液(0.4 g·L-1),注射后適當(dāng)屈伸膝關(guān)節(jié),使其充分與膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織接觸?？瞻捉M大鼠以同樣方式注射等體積生理鹽水。

2.3 動(dòng)物分組及給藥SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組11只,造模組17只,按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行造模。因操作不當(dāng)、麻醉過量及籠內(nèi)打斗等原因,造模組大鼠死亡1只,空白組大鼠死亡3只。將造模成功的16只大鼠隨機(jī)分為模型組和化濕定痛湯組,每組各8只?；瘽穸ㄍ礈M大鼠的灌胃劑量為4.68 mg·kg-1,由成人(70 kg)與動(dòng)物體表面積換算公式[9]得出,每次灌胃前將中藥水浴加熱(38 ℃)20 min;空白組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃,每天1次,持續(xù)4周。

2.4 樣本制備末次灌胃后2 h,腹腔注射烏拉坦溶液(200 g·L-1)麻醉大鼠,麻醉劑量為5 mL·kg-1。腹主動(dòng)脈采血,靜置1 h后離心(3 000 r·min-1)10 min,取上清。取20 μL血清樣品,加入50%甲醇120 μL,充分震蕩混勻,提取樣品中的代謝物,常溫靜置10 min。提取液放-20 ℃冰箱過夜,使樣品中的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。然后,提取液離心(6 000 r·min-1)20 min,留取上清液,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)血清樣品各取出10 μL混合,即為質(zhì)量控制(quality control,QC)樣品。

2.5 ELISA檢測(cè)血清IL-1β濃度嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,大致步驟如下:首先,配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和抗體工作液;然后加樣(標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品),37 ℃恒溫箱中孵育90 min;繼而加入工作液進(jìn)行反應(yīng),PBS洗滌3次;加入TMB顯色液,37 ℃避光孵育30 min,加入TMB終止液終止反應(yīng);最后在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量光密度(optical density,OD)值,并計(jì)算血清IL-1β濃度。

2.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)

2.6.1 液相檢測(cè)條件采用超高效液相色譜儀采集數(shù)據(jù),色譜柱溫度為35 ℃,流速為0.4 mL·min-1。流動(dòng)相A:1%甲酸水溶液,B:乙腈(1%甲酸),梯度洗脫:0～0.5 min,5%B;0.5～7 min,5%～100%B;7～8 min,100%B;8～8.1 min,100%～5%B;8.1～10 min,5%B。

2.6.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件采用液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀以信息依賴性采集(information-dependent acquisition,IDA)模式采集數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本進(jìn)行一次正離子模式采集(5 000 V)和一次負(fù)離子模式采集(-4 500 V)。在一個(gè)采集循環(huán)中(0.56 s),一級(jí)采集范圍為60～1 200 Da,采集時(shí)間為150 ms;然后從一級(jí)圖譜中挑選帶一個(gè)正電荷或負(fù)電荷,每秒信號(hào)積累強(qiáng)度超過100的前12個(gè)信號(hào)離子進(jìn)行二級(jí)碎裂掃描。在采集過程中,每間隔20個(gè)樣本進(jìn)行一次儀器準(zhǔn)確度校正操作。同時(shí),每間隔10個(gè)樣本進(jìn)行一次QC樣品掃描,根據(jù)QC樣品的質(zhì)量差距校正整批實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差。

2.6.3 數(shù)據(jù)分析

2.6.3.1 主成分分析(principal component analysis,PCA)為了更加直觀地展示各組大鼠血清代謝輪廓的差異及相似性,通過主要新變量(主成分)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類,去除重復(fù)性差的樣本(離群樣本)和異常樣本(在置信區(qū)間-Hotelling T2橢圓外的樣本),由此得到的PCA模型反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài),有利于把握數(shù)據(jù)的總體情況。

2.6.3.2 偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法,在降維的同時(shí)結(jié)合了回歸模型,并通過設(shè)定適當(dāng)?shù)拈撝祵?duì)回歸結(jié)果進(jìn)行判別分析。因此,該方法不僅能揭示不同組別樣本間的差異,還可以識(shí)別導(dǎo)致這些差異的具體變量(如化合物或生物標(biāo)志物)。

2.6.3.3 差異代謝物篩選及代謝通路分析根據(jù)非靶向代謝組學(xué)差異代謝物的篩選條件:ratio≥ 2或ratio≤1/2,Qvalue≤0.05或P≤0.05,及VIP≥1,分別篩選空白組與模型組、模型組與化濕定痛湯組的血清差異代謝物。

將差異代謝物上傳至KEGG網(wǎng)站(https://www.kegg.jp/),分別得到空白組與模型組、模型組與化濕定痛湯組的代謝通路;根據(jù)P值進(jìn)行升序排序,篩選顯著性排名前25的代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清IL-1β濃度比較與空白組比較,模型組大鼠血清IL-1β濃度顯著升高(P<0.05);與模型組比較,化濕定痛湯組大鼠血清IL-1β濃度顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。 圖1 各組大鼠血清IL-1β濃度比較

3.2 各組大鼠血清代謝組學(xué)分析結(jié)果

3.2.1 血清代謝物PCA結(jié)果空白組與模型組的PCA結(jié)果顯示,兩組樣本的組內(nèi)聚類情況良好且無離群值,但組間代謝輪廓差異明顯,見圖2。模型組與化濕定痛湯組的PCA結(jié)果顯示,兩組樣本的組內(nèi)聚類情況良好且無離群值,但組間代謝輪廓差異較大,見圖3。

圖2 空白組與模型組大鼠血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)PCA得分圖

3.2.2 血清代謝物PLS-DA結(jié)果將空白組與模型組進(jìn)行對(duì)比并建立回歸模型,兩組數(shù)據(jù)區(qū)分明顯,見圖4。經(jīng)200次置換檢驗(yàn)后,Q2在縱軸上的截距為-0.701,表明該P(yáng)LS-DA模型可靠且不會(huì)過度擬合,見圖5。將模型組與化濕定痛湯組進(jìn)行對(duì)比并建立回歸模型,兩組數(shù)據(jù)區(qū)分明顯,見圖6。經(jīng)200次置換檢驗(yàn)后,Q2在縱軸上的截距為-0.615,表明該P(yáng)LS-DA模型可靠且不會(huì)過度擬合,見圖7。由此說明,空白組與模型組、模型組與化濕定痛湯組之間可能存在差異代謝物,有必要進(jìn)一步篩選。

圖3 模型組與化濕定痛湯組大鼠血清代謝組 學(xué)數(shù)據(jù)PCA得分圖

圖4 大鼠血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)PLS-DA得分圖

圖5 空白組與模型組大鼠血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù) 200次置換檢驗(yàn)圖

圖6 模型組與化濕定痛湯組大鼠血清代謝組 學(xué)數(shù)據(jù)PLS-DA得分圖

3.2.3 血清差異代謝物與空白組比較,模型組大鼠血清中篩選出93個(gè)差異代謝物,其中60個(gè)代謝物上調(diào),33個(gè)代謝物下調(diào)。這些差異代謝物大致可以分為4類,即脂類及類脂分子(44個(gè)代謝物)、有機(jī)酸及其衍生物(14個(gè)代謝物)、有機(jī)雜環(huán)化合物(12個(gè)代謝物),其他(23個(gè)代謝物)。

與模型組比較,化濕定痛湯組大鼠血清中篩選出122個(gè)差異代謝物,其中72個(gè)代謝物上調(diào),50個(gè)代謝物下調(diào)。這些差異代謝物大致可分為4類,即脂類及類脂分子(56個(gè)代謝物)、有機(jī)酸及其衍生物(25個(gè)代謝物)、有機(jī)雜環(huán)化合物(11個(gè)代謝物),其他(30個(gè)代謝物)。

圖7 模型組與化濕定痛湯組大鼠血清代謝組學(xué) 數(shù)據(jù)200次置換檢驗(yàn)圖

將空白組與模型組、模型組與化濕定痛湯組的差異代謝物進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),三組共同調(diào)控28個(gè)差異代謝物,包括熊去氧膽酸、苯甲醇、精氨酸、對(duì)甲酚硫酸鹽、苯乙酰甘氨酸、尿囊酸、甘氨膽酸鈉、川陳皮素、癸二酸、谷氨酰胺、皮質(zhì)酮、2-哌啶酮、硫酸吲哚酚等,見表1。

3.2.4 血清代謝通路富集分析將空白組與模型組的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,并篩選顯著性排名前25的通路,包括谷胱甘肽代謝、生物素代謝、類固醇生成、谷氨酸代謝、膽汁酸合成、脂肪酸代謝、酮體代謝、鳥氨酸循環(huán)、亞麻酸和亞油酸代謝以及肉堿合成等通路,見圖8。

圖8 空白組與模型組大鼠血清差異代謝物富集通路分析

將模型組與化濕定痛湯組的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,并篩選顯著性排名前25的通路,包括類固醇生成、亞麻酸和亞油酸代謝、鳥氨酸循環(huán)、天冬氨酸代謝、葡萄糖-丙氨酸循環(huán)、谷氨酸代謝、丙氨酸代謝及肉堿合成等通路,見圖9。

圖9 模型組與化濕定痛湯組大鼠血清差異 代謝物富集通路分析

將空白組與模型組、模型組與化濕定痛湯組的代謝通路進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),三組共同富集的代謝通路有6條,即類固醇生成、鳥氨酸循環(huán)、谷氨酸代謝、丙氨酸代謝、亞麻酸和亞油酸代謝以及肉堿合成通路。

表1 各組大鼠血清差異代謝物鑒定與分析

4 討論

IL-1β屬于白細(xì)胞介素-1家族,是一種經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子,參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生理活動(dòng),如細(xì)胞增殖、分化和凋亡[10-11]。大量研究證實(shí),IL-1β在髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要作用[12-13]。IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為上調(diào)分解代謝、抑制合成代謝以及誘導(dǎo)炎癥因子合成[14]。此外,IL-1β可通過提高Bax和caspase水平誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn),暴露于IL-1β的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的死亡或壞死特征。該研究亦證實(shí),IL-1β能顯著下調(diào)CHON-001細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白水平,同時(shí)顯著上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)水平,從而說明IL-1β可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解。本研究中,模型組大鼠血清IL-1β濃度顯著升高,而化濕定痛湯可顯著下調(diào)IL-1β濃度,從而延緩軟骨退變。

研究發(fā)現(xiàn),化濕定痛湯能夠干預(yù)類固醇生成途徑。類固醇激素是一類重要的調(diào)節(jié)分子,主要在腎上腺、卵巢和睪丸中合成,他們對(duì)類固醇性刺激作出反應(yīng),調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育并驅(qū)動(dòng)多種生理過程,如生殖和代謝[17]。自噬可對(duì)儲(chǔ)存的前體膽固醇及其后續(xù)運(yùn)輸過程發(fā)揮關(guān)鍵作用,進(jìn)而調(diào)控類固醇生成過程,這表明自噬與膽固醇穩(wěn)態(tài)之間存在聯(lián)系[18]。作為一種細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制,自噬已成為骨關(guān)節(jié)炎研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究表明,軟骨細(xì)胞可能通過激活自噬程序來抑制細(xì)胞凋亡[19-20]。化濕定痛湯可能通過調(diào)節(jié)類固醇生成途徑治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎,但其是否通過干預(yù)自噬過程參與調(diào)節(jié),尚需進(jìn)一步研究。

皮質(zhì)酮是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一種激素,本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清皮質(zhì)酮水平顯著升高,而化濕定痛湯的干預(yù)起到明顯的抑制作用。研究顯示,在骨性關(guān)節(jié)炎中,軟骨細(xì)胞基質(zhì)丟失是一個(gè)關(guān)鍵的病理變化[21]。皮質(zhì)酮可以促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體易位進(jìn)入細(xì)胞核,并與11β-羥基類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,從而影響軟骨細(xì)胞基質(zhì)的生成[22]。因此,化濕定痛湯可能通過調(diào)節(jié)皮質(zhì)酮水平,發(fā)揮其在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎治療中的作用。

熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是一種天然存在的二羥基親水性膽汁酸,目前被廣泛用于治療多種肝臟疾病,包括原發(fā)性膽汁性肝硬化[23]。研究顯示,UDCA的作用機(jī)制涉及免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用等[24-25]。骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展與氧化應(yīng)激、活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)[26-27]。研究證實(shí),口服UDCA可減輕骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的疼痛癥狀和軟骨丟失情況,并緩解軟骨下骨的氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]。UDCA的軟骨保護(hù)作用可能是通過抑制促炎細(xì)胞因子分泌和減弱軟骨細(xì)胞的分解代謝活性來實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清UDCA水平降低,而化濕定痛湯能夠回調(diào)UDCA水平,說明UDCA可能是化濕定痛湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)之一。

對(duì)甲酚硫酸鹽(p-Cresol sulfate,PCS)是一種可與蛋白質(zhì)結(jié)合的尿毒癥毒素,由肝臟和腸道菌群通過酪氨酸、苯丙氨酸的代謝產(chǎn)生。PCS因其高白蛋白結(jié)合能力,被認(rèn)為是慢性腎病臨床并發(fā)癥的潛在因素[29-30]。多項(xiàng)研究表明,PCS可導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能障礙,其機(jī)制主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究顯示,在前額葉皮質(zhì)中,PCS能夠增加促炎細(xì)胞因子(如IL-1β、JNK、p38、p65、NF-κB和AP-1)的表達(dá)和活性,同時(shí)降低循環(huán)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neutotrophic factor,BDNF)和5-羥色氨水平,增加皮質(zhì)酮含量[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn),化濕定痛湯顯著下調(diào)大鼠血清PCS水平,這可能是化濕定痛湯組大鼠血清促炎細(xì)胞因子水平降低的原因之一。

綜上,本研究采用LC-MS/MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)探討化濕定痛湯對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用及機(jī)制。PCA和PLS-DA結(jié)果顯示,各組樣本的聚類情況良好,但組間代謝輪廓差異較大。通過鑒定與篩選,最終確定了28個(gè)顯著性差異代謝物;隨后,對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,結(jié)果表明化濕定痛湯可能通過調(diào)控這些差異代謝物及干預(yù)類固醇生成、鳥氨酸循環(huán)、谷氨酸代謝等代謝通路從而發(fā)揮治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用。本研究為探索化濕定痛湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供了新的靶標(biāo)和思路。