高 偉, 梁琳瑯, 于 浩, 宋 威, 陳若然, 喬 冰

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科;2.心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

近年來,兒童、青少年糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率逐年增長。2015年,約有193 000例年齡<20歲的患者被診斷患有糖尿病[1-2]。1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)被稱為胰島素依賴型DM和青少年發(fā)病型DM[3]。其特征是胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素不足或缺乏,可能是由β細(xì)胞的破壞導(dǎo)致的。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的特征是胰島素抵抗,胰腺β細(xì)胞仍然產(chǎn)生胰島素,但細(xì)胞對胰島素產(chǎn)生抗性,不能利用循環(huán)葡萄糖[4-5]。兒童和青少年中未確診的DM可導(dǎo)致醫(yī)療急癥,如糖尿病酮癥酸中毒、嚴(yán)重低血糖、昏迷,甚至死亡[6],起病機(jī)制目前尚不清楚。本研究針對不同數(shù)據(jù)集進(jìn)行挖掘,以尋找兒童期DM發(fā)病的關(guān)鍵基因和信號途徑,為早期篩查發(fā)現(xiàn)DM和探尋治療靶點提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 下載GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中DM數(shù)據(jù)集:兒童GSE9006和成人GSE7014。GSE9006選取GPL96平臺,健康對照24例,T1DM樣本43例,從其中20例T1DM患者中獲得了1個月和4個月的隨訪樣本;T2DM樣本12例。GSE7014中,健康對照6例,T1DM 10例,T2DM 20例。

1.2 研究方法

1.2.1 差異基因篩選 差異基因篩選采用limma、GEOquery和Biobase等R包,令DM與健康對照組織的數(shù)據(jù)相比對,篩選校正后P<0.05,并且上調(diào)表達(dá)基因log2FC>1.0,下調(diào)表達(dá)基因log2FC<-1.0。

1.2.2 GO分析及KEGG分析 GO分析和KEGG分析由DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)篩選得到,利用R中的ggplot2包繪圖。

1.2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將鑒別出的差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),隨后利用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析并實現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖可視化。

1.2.4 核心網(wǎng)絡(luò)及hub基因篩選 利用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)提取核心網(wǎng)絡(luò),依據(jù)網(wǎng)絡(luò)規(guī)模設(shè)定degree和k-core值。選取核心網(wǎng)絡(luò)中自由度最大者為hub基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 兒童T1DM剛確診時篩出差異基因25個,其中,表達(dá)上調(diào)2個,下調(diào)23個;確診1個月時,篩出差異基因25個,其中,表達(dá)上調(diào)12個,下調(diào)13個;確診4個月時,篩出差異基因46個,其中,表達(dá)上調(diào)27個,下調(diào)19個。兒童T1DM共篩選出差異基因88個,其中,表達(dá)上調(diào)36個,下調(diào)52個。兒童T2DM篩選出差異基因68個,其中,表達(dá)上調(diào)33個,下調(diào)35個。成人T1DM篩選出差異基因972個,其中,表達(dá)上調(diào)207個,下調(diào)765個。成人T2DM篩選出差異基因1 267個,其中,表達(dá)上調(diào)305個,下調(diào)962個。見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖(a.GSE9006-T1DM-剛確診時;b.GSE9006-T1DM-確診1個月時;c.GSE9006-T1DM-確診4個月時;d.GSE9006-T1DM;e.GSE9006-T2DM;f.GSE7014-T1DM;g.GSE7014-T2DM)

2.2 差異基因比較 1型間差異基因比較:兒童DM剛確診與確診1個月時比較,共有差異表達(dá)基因1個,EGR2。確診1個月與確診4個月時比較,共有差異表達(dá)基因7個,分別是EGR2、HLA-DRB6、DDIT4、KLF10、SIK1、JUN和CD69。兒童期與成人期比較,共有差異表達(dá)基因9個,分別是ESR1、DDIT4、FAM46C、SIK1、NFIB、SPTBN1、LBP、SERPINA3和MAFF。

2型間差異基因比較:兒童DM與成人DM比較,共有差異基因7個,分別為PTPRD、NAMPT、SGK1、CYP1B1、PLXNC1、MAF和SPTBN1。

1、2型間差異基因比較:兒童期共有差異基因19個,成人期共有差異基因773個。

2.3 差異基因的GO功能富集分析及KEGG通路分析 兒童T1DM和T2DM共同的GO分子功能富集在:RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié);炎癥反應(yīng);免疫應(yīng)答。兒童T1DM特有的GO功能:信號轉(zhuǎn)導(dǎo);RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控;G蛋白偶聯(lián)受體信號通路。兒童T2DM型特有的GO功能:細(xì)胞黏附;血管生成;蛋白質(zhì)磷酸化。見圖2a、b。

圖2 差異基因的GO功能富集分析及KEGG通路分析(a.兒童期T1DM特有GO功能富集;b.兒童期T2DM特有GO功能富集;c.兒童期KEGG分析;d.成人期T1DM特有GO功能富集;e.成人期T2DM特有GO功能富集;f.成人期KEGG分析)

兒童T1DM和T2DM共同的KEGG信號通路為:細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用;TNF信號通路;趨化因子信號通路。兒童T1DM特有的KEGG通路為:沙門氏菌感染;NF-κb信號通路。兒童T2DM特有的KEGG信號通路為:HTLV-1感染;類固醇生成;脂肪細(xì)胞脂肪分解的調(diào)節(jié)。見圖2c。

成人T1DM和T2DM共同GO分子功能富集在:RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正、負(fù)向調(diào)節(jié);凋亡過程。成人T1DM特有GO功能富集在:DNA為模板的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控;RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄;神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。成人T2DM特有GO功能主要富集在:細(xì)胞黏附;凋亡的調(diào)控;細(xì)胞外基質(zhì)。見圖2d、e。

成人T1DM和T2DM共同的KEGG信號通路為:PI3K-Akt信號通路;黏附;剪接體;細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等。成人T1DM特有的KEGG信號通路為:癌癥信號通路;癌癥中蛋白聚糖。成人T2DM特有的KEGG信號通路為:抗生素的生物合成;cGMP-PKG信號通路;胰島素信號通路。見圖2f。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)hub基因篩選 兒童T1DM網(wǎng)絡(luò)有56個節(jié)點,131條邊,取子網(wǎng)絡(luò)后有11個節(jié)點,排除與T2DM共有的基因后,自由度最大的基因為趨化因子配體1(chemokine C-X-C motif ligand 1,CXCL1)。兒童T2DM網(wǎng)絡(luò)有33個節(jié)點,59條邊,取子網(wǎng)絡(luò)后有6個節(jié)點,排除與T1DM共有的基因后,自由度最大的基因為趨化因子2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)。成人T1DM網(wǎng)絡(luò)有804個節(jié)點,3 246條邊,degree≥25且k-core≥15取核心子網(wǎng)絡(luò)。成人T2DM網(wǎng)絡(luò)有1 104個節(jié)點,6 320條邊,degree≥25且k-core≥15取核心子網(wǎng)絡(luò)。見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)篩選(a.GSE9006-T1DM;b.GSE9006-T2DM;c.GSE7014-T1DM;d.GSE7014-T2DM)

2.5 hub基因預(yù)測的受試者工作特征曲線 兒童期T1DM和T2DM的hub基因CXCL1和CCL2的受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線顯示兩者分別對兒童期T1DM和T2DM有良好的預(yù)測和診斷能力,曲線下面積分別為0.85、0.77。見圖4。

圖4 hub基因ROC曲線

3 討論

兒童DM的發(fā)病機(jī)制有多種研究,但多基因參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中核心基因的確定仍然存在爭論。本研究旨在對GSE9006和GSE7014數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,以篩選出針對兒童期DM起病有診斷和預(yù)測作用的基因。

本研究GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),不同DM時期亞型間有較多相同的分子功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。核心網(wǎng)絡(luò)建立后提取hub基因發(fā)現(xiàn),兒童期T1DM和T2DM的hub基因分別為CXCL1和CCL2,計算ROC曲線下面積證明其對DM有良好的預(yù)測和診斷能力。CXCL1和CCL2在成人期DM對應(yīng)的亞型中均不是差異表達(dá)基因,說明兒童期DM和成人期DM的hub基因并不相同,不同時期發(fā)病的DM致病機(jī)制也不盡相同。兒童期T1DM、T2DM的hub基因CXCL1和CCL2可作為鑒別診斷標(biāo)志物,既可預(yù)測發(fā)病可能,對于兒童期DM基因篩查檢測具有重要意義;同時也是潛在的治療靶點。

T1DM是一種異質(zhì)性自身免疫性疾病,免疫系統(tǒng)因素在T1DM的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7]。趨化因子作為免疫系統(tǒng)的重要成員,有4個亞家族,分別是CC、CXC、CX3C和C[8]。CXCL1具有促進(jìn)炎癥和誘導(dǎo)炎癥的作用,同時,還有協(xié)助運輸白細(xì)胞,促進(jìn)血管生成和輔助新生血管形成的作用[9]。Hakimizadeh等[10]研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,T1DM患者血漿趨化因子CXCL1水平升高且與T1DM并發(fā)癥密切相關(guān),發(fā)生并發(fā)癥的T1DM患者的趨化因子水平升高。Takahashi等[11]研究表明,與對照組T2DM受試者比較,T1DM受試者血清CXCL1顯著升高,是一個很好的T1DM標(biāo)記物,可能表明易發(fā)生自身免疫性疾病。Darakhshan等[12]研究發(fā)現(xiàn),與正常健康產(chǎn)婦相比較,妊娠DM產(chǎn)婦的母親及新生兒血清中CXCL1表達(dá)水平顯著升高,推測CXCL1可能與兒童T1DM遺傳致病有關(guān)。

T2DM患者常伴有許多生理和心理上的并發(fā)癥,Herder等[13]研究表明,T2DM患者高CCL2水平與較低的抑郁癥發(fā)生率相關(guān),而在T1DM中則不存在這種關(guān)聯(lián)。Jourdan等[14]研究發(fā)現(xiàn),胰島炎癥促進(jìn)β細(xì)胞丟失和T2DM發(fā)生,趨化因子CCL2高表達(dá)是炎癥巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志。Dabrowska-Zamojcin等[15]研究了接受腎移植并接受鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑治療的患者,發(fā)現(xiàn)移植后DM發(fā)展的危險性與CCL2 rs1024611 G等位基因數(shù)呈顯著正相關(guān),并揭示了這種多態(tài)性是移植后DM的獨立危險因素,說明CCL2不但是T2DM產(chǎn)生的關(guān)鍵基因,并且其單核苷酸多態(tài)性影響DM發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),兒童期T1DM、T2DM的CXCL2和CCL2基因可能是兒童DM的hub基因,具有診斷和預(yù)測發(fā)病的作用。