李 波, 劉呈武, 劉卓偉, 黎志豪.

(廣東眾生睿創(chuàng)生物科技有限公司 工藝開發(fā)部, 廣東 廣州 510700)

流行性感冒是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病,其中甲型流感病毒的傳染性最強(qiáng)且變異率較高[1]。流感病毒RNA聚合酶中的PB2蛋白可以識(shí)別并結(jié)合宿主mRNA的帽狀結(jié)構(gòu),產(chǎn)生病毒mRNA,進(jìn)而合成病毒蛋白[2]。昂拉地韋的化學(xué)名稱為(2S, 3S)-3-[[6-環(huán)丙基-5-氟-2-(5-氟-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基]氨基]二環(huán)[2.2.2]辛烷-2-羧酸,是由廣東眾生睿創(chuàng)生物科技有限公司研發(fā)的全新結(jié)構(gòu)的RNA聚合酶PB2蛋白抑制劑[3-7]。昂拉地韋是具有明確作用機(jī)制和全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類創(chuàng)新藥物,臨床上擬用于成人單純性甲型流感的治療,是國(guó)內(nèi)首個(gè)獲批臨床試驗(yàn)的治療甲型流感的小分子RNA聚合酶PB2蛋白抑制劑,可以抑制病毒生命周期基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等多種功能,達(dá)到抗甲型流感病毒的作用。目前,昂拉地韋已完成III期臨床研究,2023年7月,眾生睿創(chuàng)公布III期臨床試驗(yàn)頂線數(shù)據(jù),昂拉地韋較安慰劑可顯著縮短中位7項(xiàng)流感癥狀緩解時(shí)間和中位發(fā)熱緩解時(shí)間,較安慰劑或?qū)φ账幙筛酶斓亟档图仔土鞲胁《据d量,顯著縮短病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間,現(xiàn)推進(jìn)NDA上市申請(qǐng)中。昂拉地韋的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 昂拉地韋的結(jié)構(gòu)

昂拉地韋原料合成工藝中用到物料亞硝酸叔丁酯,存在產(chǎn)生工藝雜質(zhì)SMI-H[8]的風(fēng)險(xiǎn),該雜質(zhì)中含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)疊氮基,為潛在的基因毒性雜質(zhì),能夠直接或間接作用于人體DNA,導(dǎo)致基因突變或誘發(fā)疾病[9-16]。本文參照人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)(ICH)M7遺傳毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則,采用基于專家知識(shí)規(guī)則(Derek Nexus 6.0.1)和統(tǒng)計(jì)學(xué)模型(Sarah Nexus 3.0.0)的2個(gè)軟件對(duì)SMI-H進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示其為風(fēng)險(xiǎn)較高的潛在基因毒性雜質(zhì)(Derek預(yù)測(cè)結(jié)果為Plausible, Sarah預(yù)測(cè)結(jié)果為Positive)?；诨蚨拘噪s質(zhì)對(duì)人體有較大的安全隱患,為保證昂拉地韋藥物的安全性,需要對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行充分的研究。由于SMI-H是未經(jīng)報(bào)道的全新結(jié)構(gòu)分子化合物,因此通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)[17-19],自行設(shè)計(jì)路線來(lái)定向合成潛在基因毒性雜質(zhì)SMI-H(圖2)。

圖2 化合物SMI-E-A的合成機(jī)理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE Ⅲ 400 MHz型核磁共振波譜儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo),德國(guó)Bruker有限公司); AB Sciex API 150型質(zhì)譜儀(美國(guó)ABI公司); 安捷倫1260 Infinity II型高效液相色譜儀; AB SCIEX Triple Quad 4500型液質(zhì)聯(lián)用儀。

所用試劑均為市售分析純。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成

取2-氯-5-氟煙腈(1)(12.54 g, 80 mmol)置于500 mL三口燒瓶中,加入無(wú)水正丁醇(50 mL)攪拌。用恒壓滴液漏斗緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的水合肼(32.09 g, 320 mmol),反應(yīng)體系升溫至100 ℃攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)完畢,將反應(yīng)體系降溫至30 ℃,控溫?cái)嚢? h。過(guò)濾,濾餅用水(100 mL)和正庚烷(50 mL)分別淋洗1次,控制內(nèi)溫在60 ℃以下,減壓濃縮至無(wú)餾分。用真空干燥箱減壓干燥至恒重,得到淺黃色固體210.15 g,收率83.29%,純度99%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 12.08(s, 1H, NH), 8.38(dd,J=2.7 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.98(dd,J=8.8 Hz, 2.8 Hz, 1H, ArH), 5.56(s, 2H, NH2);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 154.43, 152.84, 150.11, 148.73, 148.70, 138.29, 138.10, 115.01, 114.87, 105.79, 105.74; DEPT135(150 MHz, DMSO-d6)δ: 138.29, 138.10, 115.01, 114.87; MS(ESI)m/z: Calcd for C6H5FN4{[M+H]+}153.13, found 153.0。

(2) 3-疊氮基-5-氟-1H-吡唑[3,4-b]吡啶的合成

取3-氨基-5-氟-1H-吡唑[3,4-b]吡啶(2)(10.0 g, 65.7 mmol)置于500 mL三口燒瓶中,加入無(wú)水乙腈(100 mL)攪拌。用恒壓滴液漏斗緩慢加入亞硝酸叔丁酯(10.2 g, 98.6 mmol)和50%的水合肼(9.9 g, 98.6 mmol),反應(yīng)體系升溫至60 ℃攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)完畢,將反應(yīng)體系降溫至30 ℃,減壓濃縮至無(wú)餾分,柱層析(洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=10 ∶1,V∶V;二氯甲烷 ∶甲醇=10 ∶1,V∶V)純化,得到白色固體(3)10.2 g,收率87.18%,純度97%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.69(s, 1H, NH), 8.62(dd,J=2.8 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 8.01(ddd,J=8.3 Hz, 2.8 Hz, 0.7 Hz, 1H, ArH);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 155.67, 154.05, 149.82, 140.84, 140.64, 139.51, 139.48, 113.83, 113.69, 106.17, 106.12; MS(ESI)m/z: Calcd for C6H3FN6{[M-H]+}177.13, found 177.0。

(3) 化合物SMI-H的合成

向500 mL反應(yīng)瓶中加入無(wú)水二氯甲烷(200 mL, 20 v/w), 化合物3(10.0 g, 56.2 mmol),開啟攪拌,加入3,4-二氫吡喃(4.96 g, 59.0 mmol)和對(duì)甲基苯磺酸(1.93 g, 11.2 mmol), 25 ℃攪拌反應(yīng)24 h。向反應(yīng)液中加入飽和碳酸氫鈉溶液(200 mL, 20 v/w),在25 ℃下繼續(xù)攪拌10 min后靜置,分液,有機(jī)相用100 mL飽和氯化鈉水溶液洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥,過(guò)濾,減壓濃縮,干法上柱。流動(dòng)相:正庚烷 ∶乙酸乙酯=1 ∶0～10 ∶1,V∶V。濃縮后,30～40 ℃真空烘箱干燥,得到白色固體SMI-H 11.2 g,收率76%,純度99.1%[HPLC面積歸一化法:色譜柱ACE Excel 3 C18-PFP(4.6 mm×150 mm, 3 μm),流動(dòng)相A為純化水,流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,柱溫35 ℃,流速1.0 mL·min-1,tR=14.603 min];1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.70(s, 1H, ArH), 8.11(dd,J=10.0 Hz, 2.5 Hz, 1H, ArH), 5.97(dd,J=10.0 Hz, 5.0 Hz, 1H, ArH), 3.94(d,J=10.0 Hz, 1H, CH), 3.68(dt,J=20.0 Hz, 5.0 Hz, 1H), 2.40(tdd,J=12.9 Hz, 10.6 Hz, 4.2 Hz, 1H), 2.04～2.00(m, 1H), 1.92(dd,J=13.0 Hz, 2.9 Hz, 1H), 1.76(tdd,J=10.5 Hz, 7.4 Hz, 3.4 Hz, 1H), 1.60～1.54(m, 2H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 156.28, 154.65, 148.13, 140.98, 140.78, 139.68, 139.64, 114.64, 114.50, 107.61, 107.56, 82.34, 67.62, 29.19, 25.06, 22.80; DEPT135(150 MHz, DMSO-d6) CHδ: 140.98, 140.78, 114.65, 114.50, 82.34; CH2δ: 67.62, 29.19, 25.06, 22.80; DEPT90(150 MHz, DMSO-d6) CHδ: 140.98, 140.78, 114.65, 114.50; MS(ESI)m/z: Calcd for C11H11FN6O{[M+H]+}263.25, found 263.10。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用法

液相色譜:檢測(cè)器-AB SCIEX Triple Quad 4500;色譜柱:飛諾美Kinetex C18柱;流動(dòng)相A:甲酸 ∶水(1 ∶1000);流動(dòng)相B:甲醇;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;采集時(shí)間:10 min;洗針液:體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇-水;洗脫程序:梯度洗脫;質(zhì)譜條件:掃描類型-MRM;離子化形式:ESI;極性:positive; CAD(碰撞氣壓力):8 psi; GS1(霧化氣壓力):50 psi;GS2(霧化氣壓力):50 psi; CUR GAS(氣簾氣壓力):40 psi; IS(離子化氣壓):5500 V; Temp(干燥氣溫度):500 ℃;閥切換程序:0～4 min, To Waste; 4～8 min, To MS; 8～10 min, To Waste。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物2的工藝條件優(yōu)化

以 2-氯-5-氟煙腈5 g的反應(yīng)規(guī)模,分別考察了溶劑種類、水合肼的用量和反應(yīng)溫度對(duì)化合物2收率和選擇性的影響。選擇性為反應(yīng)結(jié)束時(shí)體系中化合物2的含量,采用面積歸一化法HPLC進(jìn)行分析。

(1) 溶劑的種類

表1研究了不同溶劑體系(4 v/w)對(duì)反應(yīng)選擇性的影響。由表1可見,醇類溶劑體積的反應(yīng)選擇性明顯優(yōu)于二氯甲烷體系,乙醇和正丁醇的反應(yīng)選擇性優(yōu)于甲醇體系,其中以正丁醇的選擇性最佳,因此,選擇正丁醇作為反應(yīng)溶劑。

表1 溶劑種類對(duì)化合物2反應(yīng)選擇性的影響

(2) 水合肼的用量

表2研究了不同水合肼用量對(duì)反應(yīng)選擇性的影響。由表2可見,4.0 eq和5.0 eq的水合肼體系選擇性最高,由于水合肼具有強(qiáng)堿性和吸濕性,本著提質(zhì)增效的原則,選擇4.0 eq的水合肼。

表2 水合肼用量對(duì)化合物2反應(yīng)選擇性的影響

(3)反應(yīng)溫度

表3研究了反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響。由表3可見,溫度為95 ℃和105 ℃時(shí)收率最高,溫度降低時(shí),收率亦會(huì)降低。

表3 反應(yīng)溫度對(duì)化合物2收率的影響

2.2 化合物3(SMI-E-A)的潛在反應(yīng)機(jī)理解析

經(jīng)文獻(xiàn)檢索,未見有SMI-H的制備方法,分析SMI-E-A的疊氮化反應(yīng)機(jī)理(圖2),水合肼和亞硝酸類似物生成疊氮酸,SMI-D在亞硝酸叔丁酯的作用下生成重氮鹽中間態(tài),疊氮酸進(jìn)攻重氮鹽中間態(tài)生成SMI-E-A。

2.3 SMI-H在起始物料和昂拉地韋原料藥中的方法開發(fā)和檢測(cè)

根據(jù)ICH M7指導(dǎo)原則,基因毒性雜質(zhì)的可接受風(fēng)險(xiǎn)攝入量毒理學(xué)閾值(TTC)為每天不超過(guò)10 μg。昂拉地韋每日服用的最大劑量為800 mg,按照TTC公式(限度=10 μg/日最大劑量)計(jì)算,SMI-H在原料藥和片劑中的可接受限度定為12.5×10-6。

采用自行開發(fā)的高效液相色譜法對(duì)昂拉地韋關(guān)鍵起始物料SMI進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)證,該方法靈敏度高、專屬性好、耐用性強(qiáng)且專屬度高。具體色譜條件為:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ACE Excel 3 C18-PFP, 150 mm×4.6 mm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱);以水為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,進(jìn)行線性梯度洗脫;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣體積10 μL。

檢測(cè)結(jié)果顯示,SMI-H在多批次關(guān)鍵起始物料SMI檢測(cè)中均有檢出,檢出數(shù)據(jù)范圍為0.1%～0.2%,高于基于攝入量毒理學(xué)閾值(TTC)計(jì)算得到的限度12.5×10-6,低于SMI質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的限度0.3%,典型譜圖見圖3。

圖3 SMI-H液相檢測(cè)數(shù)據(jù)

采用自行開發(fā)的液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)對(duì)昂拉地韋原料藥進(jìn)行檢測(cè),該方法從系統(tǒng)適用性、專屬性、線性及范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性等方面進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》2020年版四部“9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的規(guī)定要求,因此可以運(yùn)用此方法準(zhǔn)確檢測(cè)昂拉地韋原料藥中SMI-H的含量。

檢測(cè)結(jié)果如表4所示,SMI-H在多批次昂拉地韋原料藥檢測(cè)中均未檢出,低于基于攝入量毒理學(xué)閾值(TTC)計(jì)算得到的限度12.5×10-6,III期臨床批次原料藥典型檢測(cè)數(shù)據(jù)如表4所示,均未檢出。

表4 昂拉地韋中SMI-H的多批次檢測(cè)數(shù)據(jù)

2.4 SMI-H晶型穩(wěn)定性

根據(jù)雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)存和多批次原料藥檢測(cè)的需要,本文同步考察SMI-H的晶型穩(wěn)定性。0個(gè)月、 3個(gè)月、 6個(gè)月和12個(gè)月的XRD疊加譜圖如圖4所示,可以看出,SMI-H的晶型較穩(wěn)定,角度峰一致,室溫即可長(zhǎng)期保存,為后續(xù)起始物料和原料藥的批次檢測(cè)提供有益的數(shù)據(jù)支持。

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本文對(duì)昂拉地韋關(guān)鍵起始物料和原料藥中潛在的基因毒性雜質(zhì)SMI-H進(jìn)行合成和表征,主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于避免使用劇毒和易爆的疊氮化鈉,合成工藝條件溫和、原料易得并且操作簡(jiǎn)便?；诒ＷC昂拉地韋商業(yè)化生產(chǎn)批次工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的考量,采用自行建立并驗(yàn)證的高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用方法,對(duì)昂拉地韋關(guān)鍵起始物料和原料藥中的SMI-H進(jìn)行檢測(cè),數(shù)據(jù)顯示在昂拉地韋關(guān)鍵起始物料有檢出但低于SMI現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍(≤0.3%),在昂拉地韋原料藥中未檢出,安全風(fēng)險(xiǎn)可控。本研究為昂拉地韋藥品的質(zhì)量控制、安全性評(píng)價(jià)及NDA申報(bào)上市提供數(shù)據(jù)支撐和有益參考,具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。