董連強(qiáng), 馬星光, 孫亞偉*

(1. 中國石油大學(xué)(華東) 化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266580; 2. 煙臺東化新材料有限公司 合成研發(fā)部,山東 煙臺 265500)

現(xiàn)有的核酸化學(xué)合成技術(shù)主要基于亞磷酰胺化學(xué)(圖1),其中5′-羥基多使用4,4′-二甲氧基三苯甲基(4,4′-dimethoxytrityl, DMT)官能團(tuán)來保護(hù),DMT官能團(tuán)主要通過質(zhì)子酸來切除,然后暴露羥基供下一步偶合反應(yīng)[1]。研究人員發(fā)現(xiàn),強(qiáng)酸對嘌呤類核苷的糖苷鍵有較強(qiáng)的破壞作用,會導(dǎo)致核酸序列上嘌呤堿基的無規(guī)則脫落,使DNA結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常[2]。為解決上述問題,本文提出使用光可降解保護(hù)基團(tuán)來替代現(xiàn)有的酸脫保護(hù)的DMT基團(tuán),避免DNA合成中脫嘌呤現(xiàn)象的出現(xiàn)[3-4]。

圖1 DNA合成循環(huán)流程

光脫保護(hù)基團(tuán)是一類光敏化合物,可被特定波長的光激發(fā),發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),在特定位置發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂[5]。目前光保護(hù)基團(tuán)的光響應(yīng)范圍主要集中在紫外區(qū)間(280～350 nm),但該波段的光照會破壞核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu),因而在該部分工作中,用可在藍(lán)光波長下進(jìn)行光脫保護(hù)的保護(hù)基團(tuán)對核苷的活性位點(diǎn)進(jìn)行選擇性保護(hù)。如圖2～3所示,本文選擇7-二乙胺基-4-羥甲基香豆素和7-二乙胺基-4-羥甲基(2-二氰甲基)香豆素作為光可降解保護(hù)基團(tuán)[6-9],最大吸收波長分別為365 nm和450 nm,分別處于紫外和可見光的藍(lán)光波段[10]。

圖2 光敏醇合成工藝流程

圖3 光敏脫氧胞苷合成工藝流程

基于此,本文選用N-4-乙?；撗醢兆鳛槟Ｐ突衔?將上述香豆素基團(tuán)作為光脫除保護(hù)基,以碳酸二酯鍵將香豆素光可降解保護(hù)基團(tuán)與脫氧核苷的5′-羥基連接,探究了不同結(jié)構(gòu)的香豆素單元在紫外以及藍(lán)光下的保護(hù)和脫保護(hù)策略,證實(shí)了香豆素類光脫除保護(hù)基團(tuán)在核苷類化合物的保護(hù)和脫保護(hù)中的高效作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Rotavapor R-210型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BUCHI); HJ-6型磁力攪拌器(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造公司); Bruker AMX-400 MHz型核磁共振譜儀; REFLEX-Ⅲ型質(zhì)譜儀(Bruker); ZF-5型手提式紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司); XS105型電子天平(METTLER TOLEDO); VACUCELL型真空干燥箱(浙江錢江偉岸干燥設(shè)備有限公司); 2XZ-2型旋片式真空泵(上海真空泵生產(chǎn)廠); Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司); U1型LED強(qiáng)光手電筒(杰克斯曼電子有限公司);450型藍(lán)色激光器(OXLasers公司)。

鹽酸、硝酸銀、N,N二異丙基乙基胺和硅膠粉等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);4-二甲氨基吡啶、叔丁基二甲基氯硅烷、三氯乙酸、四丁基氟化銨、三乙胺氫氟酸鹽和冰醋酸等(阿拉丁集團(tuán));甲苯等(富宇化學(xué)試劑有限公司);7-二乙胺基-4-甲基香豆素、對硝基苯基氯甲酸酯、雙(2,5-二氧代環(huán)戊基)碳酸酯和雙(三氯甲基)碳酸酯(化夏化學(xué)有限公司);丙二腈、勞森試劑(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司);N-4-乙?；?’-脫氧胞苷(Sigma-Aldrich公司);吡啶(上海Admas-beta公司),所有試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成

稱取100 g(400 mmol)化合物1置于2 L圓底燒瓶中,分散于1000 mL無水二氯甲烷中,于室溫下攪拌,并向體系中加入90 g(530 mmol)EDC·HCl,然后加入23 mL(440 mmol)乙酸和50 g(440 mmol)DMAP,將反應(yīng)體系避光處理。反應(yīng)18 h后向反應(yīng)體系中加入飽和NaHCO3溶液,觀察到有氣泡現(xiàn)象產(chǎn)生,然后旋蒸去除溶劑,再向體系中加入1000 mL乙酸乙酯萃取,用飽和食鹽水對有機(jī)相進(jìn)行洗滌,再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相,最后旋干得到113 g粗產(chǎn)物化合物2。

化合物2: 黃褐色油狀液體,收率98%;1H NMR(DMSO-d6, 400MHz)δ: 1.11～1.14(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.17(s, COCH3, 3H), 3.41～3.46(q,J=6.7 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.27(s, CH2O, 2H), 6.00(s, CH, 1H), 6.55～6.56(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.69～6.72(q,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.46～7.48(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 62.3, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125, 147.3, 149.2, 155.5, 160.8, 170.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H19NO4{[M+H]+} 290.1387, found 290.1444。

(2) 化合物3的合成

將上一步得到的化合物2(400 mmol)加入2 L的圓底燒瓶中,分散于1000 mL甲苯中,稱取105 g(260 mmol)Lawessons reagent加入體系中反應(yīng),于115 ℃加熱攪拌反應(yīng)4 h,停止加熱后繼續(xù)反應(yīng)12 h。將反應(yīng)體系中的甲苯旋蒸去除,剩余固體用乙酸乙酯和水進(jìn)行萃取,有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌,然后用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。粗產(chǎn)品進(jìn)行柱層析純化,最終得到104 g化合物3。

化合物3: 紅色固體,收率85%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.12～1.16(t,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.76(s, COCH3, 3H), 3.45～3.50(q,J=6.7 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.26(s, CH2O, 2H), 6.73(d, CH, 1H), 6.82～6.85(q,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.69～6.72(s, ArH, 1H), 7.46～7.48(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 62.4, 91.4, 104.3, 104.8, 126, 137.5, 150.2, 155.2, 170.2, 195.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H19NO3S {[M+H]+} 306.1159, found 306.1238。

(3) 化合物4的合成

稱取200 g(655 mmol)的化合物3置于2500 mL圓底燒瓶中,加入1000 mL的甲苯進(jìn)行溶解,并向溶液中加入含220 g(1311 mmol)硝酸銀的硅膠粉混合物,室溫下攪拌5 min。分別稱取90 g(1311 mmol)丙二腈和160 g(1311 mmol)DMAP置于圓底燒瓶中,加入500 mL的甲苯使之溶解,室溫下攪拌5 min。將丙二腈和DMAP的混合液逐滴加入到化合物3的溶液中,90 ℃下加熱攪拌反應(yīng)4 h,停止加熱后繼續(xù)反應(yīng)10 h。抽濾除去不溶物,然后旋蒸去除甲苯,剩余固體用乙酸乙酯和水進(jìn)行萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。粗產(chǎn)品進(jìn)行柱層析純化,最終得到120 g化合物4。

化合物4: 紅色固體,收率52%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.13～1.17(t,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.15(s, COCH3, 3H), 3.48～3.54(q,J=8 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 5.37(s, CH2O, 2H), 6.74(s, CH, 1H), 6.67～6.68(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 6.88～6.90(t,J=2.7 Hz, ArH, 1H), 7.60～7.62(d,J=8 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 20.8, 47.1, 53.7, 63.3, 92.7, 105.9, 106.1, 113.6, 117.7, 125.3, 130.5, 149.5, 154.6, 170.2, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H19N3O3{[M+H]+} 338.1499, found 338.1568。

(4) 化合物5的合成

稱取50 g(148 mmol)的化合物4置于2500 mL圓底燒瓶中,加入500 mL無水乙醇進(jìn)行溶解,再加入400 mL HCl的乙醇溶液(12 mol/L),于60 ℃下攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢后向體系中加入飽和的NaHCO3溶液以中和剩余的鹽酸。然后旋蒸去除溶劑,加入乙酸乙酯和水對體系進(jìn)行萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥,將產(chǎn)物旋干后進(jìn)行真空干燥,得到40 g化合物5。

化合物5: 橙紅色固體,收率95%;1H NMR(d6-DMSO, 400MHz)δ:1.09～1.11(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 3.43～3.46(q,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.76(t, CH2OH, 2H), 5.72(s, CH2OH, 1H), 6.59(s, CH, 1H), 6.76(s, ArH, 1H), 6.79～6.81(m, ArH, 1H), 7.49～7.50(d,J=4 Hz, ArH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.3, 12.9, 47.1, 53.7, 63.9, 92.7, 105.9, 106.1, 113.6, 117.7, 125.3, 130.5, 149.5, 154.6, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C17H17N3O2{[M+H]+} 296.1349, found 296.1426。

(5) 化合物7的合成

稱取5 g(20 mmol)化合物1加入到250 mL圓底燒瓶中,加入100 mL無水乙腈進(jìn)行溶解,然后加入5 g(42 mmol)DMAP,再加入6 g(30 mmol)對硝基苯基氯甲酸酯,于室溫下攪拌反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后將體系進(jìn)行濃縮,等待產(chǎn)物結(jié)晶后進(jìn)行抽濾操作。然后加入0.3 g(2.4 mmol)DMAP和9 g(20 mmol)3′-OTBDMS-dCBz,于室溫下攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)完畢后對體系進(jìn)行旋蒸,然后用乙酸乙酯和水萃取,無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。柱層析純化,將得到的洗脫液進(jìn)行旋蒸以及抽真空干燥,得到8.3 g化合物7。

化合物7: 淡黃色固體,收率58%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 0.04(s, SiCH3, 6H), 0.83(s, SiCCH3, 9H), 1.04～1.06(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.18～2.23(m, 2’H, 1H), 2.28～2.30(m, 2’H, 1H), 3.68～3.71(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.05～4.06(d,J=4 Hz, 3’H, 1H), 4.37～4.39(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 5.33(s, 5’H, 1H), 5.96(s, ArCH2O, 2H), 6.13～6.15(t,J=4 Hz, 4’H, 1H), 6.48(s, 1’H, 1H), 6.63～6.65(t,J=4 Hz, O=CCH=C, 1H), 6.86～6.90(m, ArH, 2H), 7.04～7.06(t,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.34～7.36(d,J=8 Hz, C=CHC=N, 1H), 7.46～7.49(t,J=8 Hz, O=CArH, 2H), 7.57～7.60(t,J=6 Hz, O=CArH, 1H), 7.96～7.97(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.12～8.13(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.22(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.0, 12.9, 25.9, 30.9, 41.1, 47.1, 66.3, 66.7, 73.8,89.3, 95.0, 95.7, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125.0, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.0, 147.3, 149.2, 155.1, 155.5, 160.8, 162.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C37H46N4O9Si {[M+H]+} 719.3107, found 719.3091。

(6) 化合物8的合成

稱取3 g(4 mmol)化合物7加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水四氫呋喃,加入10 mmol(1 mol/L)四丁基氟化銨,再向反應(yīng)體系中滴加50滴冰醋酸于室溫下攪拌反應(yīng)0.5 h。旋蒸除去四氫呋喃,然后用乙酸乙酯和水進(jìn)行萃取,無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。粗產(chǎn)品進(jìn)行柱層析純化,將得到的洗脫液進(jìn)行旋蒸以及真空干燥后得到1.8 g化合物8。

化合物8: 淡黃色固體,收率75%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.02～1.04(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.14～2.19(m, 2’H, 1H), 2.36～2.40(m, 2’H, 1H), 3.30～3.33(q,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.12～4.13(t,J=2 Hz, 3’H, 1H), 4.28～4.30(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 4.40～4.42(t,J=4 Hz, 5’H, 1H), 4.45～4.48(m, OH, 1H), 5.32(s, ArCH2O, 2H), 5.65(s, 4’H, 1H), 5.95(s, 1’H, 1H), 6.19(s, ArH, 2H), 6.43(s, ArH, 1H), 6.60～6.61(m, C=CHC=N, 1H), 7.46～7.48(t,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 7.57～7.59(d,J=8 Hz, O=CArH, 1H), 7.98～7.99(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.15～8.16(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.23(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 40.1, 47.1, 66.3, 66.7, 70.7,85.5, 95.0, 95.7, 97.1, 108.5, 110.5, 111.7, 125.0, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.8, 147.3, 149.2, 154.4, 155.5, 160.8, 162.9, 167.0; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C31H32N4O9{[M+Na]+} 627.2083, found 627.2051。

(7) 化合物10的合成

將3 g(10 mmol)化合物5加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水乙腈,然后加入2.6 g(21 mmol)DMAP,再加入2.2 g(30 mmol)對硝基苯基氯甲酸,于室溫攪拌反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后進(jìn)行濃縮,待產(chǎn)物結(jié)晶后進(jìn)行抽濾得到產(chǎn)物。然后向體系中加入1.4 g(12 mmol)DMAP和4.4 g(10 mmol)3′-OTBDMS-dCBz,于室溫下攪拌反應(yīng)6 h。用乙酸乙酯和水萃取,無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。柱層析純化,將得到的洗脫液進(jìn)行旋蒸及真空干燥得到3.4 g化合物10。

化合物10: 黃褐色固體,收率45%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 0.04(d, SiCH3, 6H), 0.83(s, SiCCH3, 9H), 1.06～1.08(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.17～2.20(q,J=4 Hz, 2’H, 1H), 2.28～2.30(t,J=4 Hz, 2’H, 1H), 3.68～3.71(t,J=6 Hz, ArNCH2CH3, 4H), 4.06(d, 3’H, 1H), 4.38～4.39(d,J=4 Hz, 5’H, 1H), 5.46(s, 5’H, 1H), 6.11～6.14(t,J=6 Hz, ArCH2O, 2H), 6.60(s, 4’H, 1H), 6.81～6.82(d,J=4 Hz, 1’H, 1H), 6.89～6.90(d,J=4 Hz, O=CCH=C, 1H), 7.04～7.06(t,J=2.7 Hz, ArH, 2H), 7.15～7.16(d,J=4 Hz, ArH, 1H), 7.29～7.30(d,J=4 Hz, C=CHC=N, 1H), 7.46～7.49(t,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 7.56～7.59(t,J=4 Hz, O=CArH, 1H), 7.96～7.97(d,J=4 Hz, O=CArH, 2H), 8.08～8.09(d,J=4 Hz, NCH=C, 1H), 11.21(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: -2.0, 12.9, 25.9, 30.9, 41.1, 47.1, 53.7, 66.3, 66.7, 73.8, 89.3, 92.7, 95.0, 95.7, 105.9, 106.1, 111.7, 113.6, 125.3, 127.5, 128.8, 130.5, 132.1, 133.2, 143.0, 149.5, 154.6, 154.4, 155.1, 162.9, 167.0, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C40H48N6O8Si {[M+Na]+} 789.3039, found 789.3036。

(8) 化合物11的合成

稱取3 g(4 mmol)化合物10加入到100 mL圓底燒瓶中,溶于20 mL無水四氫呋喃中,再加入10 mmol四丁基氟化銨(1 mol/L),再向反應(yīng)體系中滴加50滴冰醋酸,于室溫下攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去四氫呋喃,加入水和乙酸乙酯進(jìn)行萃取,無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。通過柱層析對產(chǎn)物進(jìn)行純化,將得到的洗脫液進(jìn)行旋蒸及真空干燥后得到1.3 g化合物11。

化合物11: 黃褐色固體,收率50%;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.09～1.12(t,J=4 Hz, ArNCH2CH3, 6H), 2.04～2.08(m,J=16 Hz, 2’H, 1H), 2.10～2.14(m,J=16 Hz, 2’H, 1H), 3.28(d, ArNCH2CH3, 4H), 3.45～3.48(q,J=3 Hz, 3’H, 1H), 3.71～3.72(d,J=4 Hz, 5’H, 1H), 3.92～3.94(t,J=2.7 Hz, 5’H, 1H), 3.97～4.01(q,J=4 Hz, OH, 1H), 4.20(s, ArCH2O, 2H), 4.33～4.34(d,J=4 Hz, 4’H, 1H), 4.96～4.98(t,J=2.7 Hz, 1’H, 1H), 5.41～5.45(q,J=4 Hz, ArH, 2H), 5.72(s, ArH, 1H), 6.14～6.17(t,J=4.0 Hz, C=CHC=N, 1H), 6.59～6.62(d,J=12 Hz, O=CArH, 2H), 6.82～6.84(d,J=8 Hz, O=CArH, 1H), 7.38(d, O=CArH, 2H), 7.72～7.74(d,J=8 Hz, NCH=C, 1H), 11.25(s, NH, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.9, 40.1, 47.1, 53.7, 66.3, 66.7, 70.7, 85.5, 92.7, 95.0, 95.7, 105.9, 106.1, 108.5, 110.5, 111.7, 113.6, 125.3, 127.5, 128.8, 132.1, 133.2, 143.8, 149.5, 154.4, 154.6, 155.1, 160.8, 162.9, 167.0, 191.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C34H32N6O8{[M+Na]+} 675.2175, found 675.2153。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物5的合成路線優(yōu)化

2017年,MARCHAN課題組[10-14]報道了可見光波段響應(yīng)的香豆素光脫保護(hù)基團(tuán),該課題組以7-二乙胺基-4-甲基香豆素為原料,通過對其2-位進(jìn)行修飾,得到不同波長響應(yīng)的香豆素光脫保護(hù)基團(tuán),在化合物3到化合物4的合成中,有大量硫化銀副產(chǎn)物產(chǎn)生,硫化銀具有極高的黏稠性,使整個反應(yīng)的分離純化難度增加。為解決以上問題,本研究采用硝酸銀與層析100～200目的硅膠混合投料模式,有效避免了黏稠固體的產(chǎn)生,在一定程度上降低了分離純化的難度,在優(yōu)化反應(yīng)過程的同時使收率由原來的40%提高到了52%。

2.2 香豆素類連接試劑的選擇

在本文中用碳酸二酯鍵將光可降解保護(hù)基團(tuán)和脫氧核苷5′-羥基連接到一起,由于碳酸二酯鍵在中等強(qiáng)度的酸性和堿性環(huán)境下均具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性,所以可以耐受DNA合成過程中的強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性化學(xué)環(huán)境。如表1所示,同時考察了三光氣、羰基二咪唑和對硝基苯基氯甲酸酯等常見連接試劑對目標(biāo)物合成收率的影響,其中添加三光氣的反應(yīng)速度最快,但是反應(yīng)副產(chǎn)物較多,分離純化的價值極低;添加羰基二咪唑后該反應(yīng)的二取代副產(chǎn)物較多且反應(yīng)速度慢,產(chǎn)物通過柱層析分離純化困難,收率低無法滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。因此最終選擇對硝基苯基氯甲酸酯作為連接試劑,該試劑與化合物1和化合物5的反應(yīng)效率高,并且副產(chǎn)物較少,反應(yīng)后處理簡單。其中化合物6和化合物9可以通過結(jié)晶的方式分離純化,收率分別為63%和60%。

表1 不同保護(hù)試劑對化合物10合成的影響

2.3 香豆素-PNC與5′-羥基反應(yīng)的條件探究

將制備的香豆素-PNC單體與脫氧胞苷5′-羥基進(jìn)行連接保護(hù),如表2～4所示,本文考察了不同溶劑、添加劑、溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。通過對N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行對比,確定最優(yōu)溶劑為乙腈;通過對1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯、N,N-二異丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶等有機(jī)堿進(jìn)行對比,確定最優(yōu)添加劑為4-二甲氨基吡啶。此外在不加添加劑的情況下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),收率低于40%。通過探究不同反應(yīng)溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,確定最優(yōu)反應(yīng)溫度為65 ℃。因此光可降解保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)條件如下:溶劑為乙腈,添加劑為4-二甲氨基吡啶,反應(yīng)溫度為65 ℃。

表2 不同溶劑對化合物7收率的影響

表3 不同添加劑對化合物7收率的影響

表4 不同溫度對化合物7收率的影響

2.4 光脫保護(hù)條件的確定以及光解動力學(xué)曲線

為了探究光敏核苷單體的應(yīng)用前景,在光敏脫氧核苷合成后,對紫外光響應(yīng)的光敏脫氧胞苷(化合物8)進(jìn)行光降解實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)介紹和紫外光敏香豆素的吸收光譜[15],光解實(shí)驗(yàn)決定采用最大吸收波長為365 nm進(jìn)行光解實(shí)驗(yàn),使用光功率密度為500 mW/cm2的紫外燈。為確定紫外香豆素光可降解保護(hù)單元徹底脫保護(hù)的最佳光照時間,在光照時間分別為15 s、 30 s、 60 s、 90 s、 120 s和150 s的條件下進(jìn)行HPLC表征,并整合出光解動力學(xué)曲線。通過對圖4分析得知,在120 s的紫外光照下化合物8的光解率達(dá)到了100%。因此將紫外光照時間定為120 s,確?；衔?能夠全部發(fā)生光解。

時間/s圖4 化合物8光解動力學(xué)曲線

Time/min圖5 化合物8光照前后HPLC譜圖

時間/min圖6 化合物11光解動力學(xué)曲線

Time/min圖7 化合物11光照前后HPLC譜圖

將進(jìn)行2 min紫外光照后的化合物8通過反相高效液相色譜記錄光照前后HPLC出峰的時間差異。從圖5可以看出,化合物8在光照前的保留時間為2.98 min,但是在經(jīng)過2 min的光照后,2.98 min處的信號消失,新的化合物保留時間變?yōu)?.74 min。同時對N-4乙?；撗醢者M(jìn)行液相色譜分析,發(fā)現(xiàn)其在該分析條件下的保留時間是2.74 min,證實(shí)化合物8可以按照預(yù)期方式發(fā)生香豆素保護(hù)基團(tuán)的光脫保護(hù)。通過電噴霧電離質(zhì)譜對光照后的結(jié)果進(jìn)行表征,所得結(jié)果為298.1398({[M+H]+}),與N-4乙?；撗醢盏姆肿恿拷Y(jié)果一致。綜上可知,以碳酸二酯鍵連接的7-二乙胺基-4-羥甲基香豆素保護(hù)基團(tuán)可在2 min的紫外照射下完全脫除。

在驗(yàn)證完紫外光敏脫氧胞苷光解的可行性后,對藍(lán)光響應(yīng)的光敏脫氧胞苷(化合物11)進(jìn)行可見光照射下的光降解實(shí)驗(yàn)。根據(jù)藍(lán)光光敏香豆素的吸收光譜決定采用其最大吸收波長為450 nm進(jìn)行光解實(shí)驗(yàn),使用功率為2.5 W的藍(lán)色激光作為光源。為確定最佳光照時間,分別對光照時間為3 min、 6 min、 9 min、 12 min、 15 min、 18 min、 21 min和24 min的結(jié)果進(jìn)行HPLC表征,并整合出光解動力學(xué)曲線,以此確定藍(lán)光光敏脫氧胞苷的最佳光解時間。通過對圖6分析得知,在大于18 min的藍(lán)光光照下化合物11的光解率達(dá)到了100%,為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性特此將藍(lán)光光照時間設(shè)置為20 min,以確?；衔?1能夠全部發(fā)生光解。

將進(jìn)行20 min藍(lán)光光照后的化合物11通過反相高效液相色譜記錄光照前后HPLC出峰的時間差異。由圖7可以看出,光照前化合物11在反相高效液相色譜中的保留時間為3.09 min。光照后該信號消失,新的化合物保留時間變?yōu)?.73 min,與N-4乙?；撗醢毡Ａ魰r間一致。

通過電噴霧電離質(zhì)譜對光照后的結(jié)果進(jìn)行表征,所得結(jié)果為298.1398({[M+H]+}),與N-4乙?；撗醢盏姆肿恿拷Y(jié)果一致。綜上可知,該實(shí)驗(yàn)證實(shí)7-二乙胺基-4-羥甲基(2-二氰甲基)保護(hù)基團(tuán)在藍(lán)光照射下可以實(shí)現(xiàn)高效脫除。

綜上所述,本文分別對紫外光敏脫氧胞苷和藍(lán)光光敏脫氧胞苷進(jìn)行了光解實(shí)驗(yàn)和結(jié)果驗(yàn)證,結(jié)果充分說明了光解實(shí)驗(yàn)的成功。

本文中將在不同波長下可發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的香豆素類化合物作為脫氧核苷化合物5′-羥基的光響應(yīng)保護(hù)基,確定了合成過程中的最優(yōu)溶劑、添加劑和溫度,探究了合成效率最佳的反應(yīng)條件。同時對上述保護(hù)基團(tuán)的光降解行為進(jìn)行了初步研究,探索了在不同光照時間下紫外和藍(lán)光2種光可降解保護(hù)基團(tuán)的光降解脫保護(hù)效率,確定了最佳脫保護(hù)光照時長。該研究為光控DNA的合成化學(xué)進(jìn)行了較為細(xì)致的前期研究。