羅靜遠，楊 靜，李 雪，周四元，劉道洲

(空軍軍醫(yī)大學藥學系藥劑學與藥事管理學教研室，陜西 西安 710032)

膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的腦部原發(fā)性腫瘤，占顱內腫瘤的35%～61%[1-2]。GBM侵襲能力強，在周圍正常腦組織浸潤生長，導致GBM組織與周圍正常腦組織無明顯界限，具有病死率高、復發(fā)率高及治愈率低等特點[3-4]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是第二代口服烷化劑，是目前治療GBM最有效的化療藥物[5-6]。TMZ本身沒有直接的抗GBM活性，只有水解為5-(3-甲基-三嗪-1-基)咪唑-4-甲酰胺[5-(3-methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide，MTIC]后，才能發(fā)揮抗GBM作用。TMZ在血液循環(huán)中極易水解為MTIC，但是MTIC幾乎不能通過血腦屏障[7-8]。另據(jù)報道，GBM細胞程序性細胞死亡蛋白-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)高表達，與T細胞上程序性細胞死亡蛋白1結合后，能夠抑制T細胞激活并減少T細胞分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，使GBM細胞逃避機體免疫監(jiān)視和殺傷，促進GBM的生長[9-10]。因此，當采用特定序列的PD-L1特異的siRNA(siPD-L1)抑制GBM細胞PD-L1的表達，就能夠增強機體自身免疫系統(tǒng)對GBM的殺滅，與TMZ發(fā)揮協(xié)同作用。但是siPD-L1在血液循環(huán)中不穩(wěn)定[11-12]。因此，提高TMZ和siPD-L1在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，增加它們在腦內的蓄積，是TMZ和siPD-L1發(fā)揮協(xié)同作用的關鍵。

腦組織需要大量的營養(yǎng)物質維持正常的生理功能，腦毛細血管內皮細胞表面的各類轉運體可以介導這些營養(yǎng)物質進入腦組織[13-14]。研究顯示，在腦毛細血管內皮細胞表面大約存在30種不同營養(yǎng)物質的轉運體，用來運送糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質進入腦組織。因此，直接將藥物制成氨基酸和糖的類似物，或在納米粒表面修飾氨基酸或糖類，就可以在腦毛細血管內皮細胞表面特異性轉運體的介導下穿過血腦屏障，到達病灶部位，實現(xiàn)藥物的腦內靶向遞送[15-16]?；诖?，我們采用2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)修飾脂質納米粒，共載siPD-L1和TMZ，以期提高siPD-L1和TMZ在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性及其在腦組織的分布，提高siPD-L1和TMZ治療GBM的效果[17]。本文通過研究2-DG修飾共載siPD-L1及TMZ脂質納米粒(TMZ/siPD-L1@GLPN)給藥后，TMZ在血漿中的消除動力學以及在小鼠腦內的分布動力學，旨在闡明2-DG修飾對脂質納米粒腦靶向性的影響，為腦靶向遞藥系統(tǒng)的設計提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 電子天平(AL104型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC，2695/2996，美國Waters公司)；活體成像儀(Caliper IVIS Lumina Ⅱ，美國Caliper Life Sciences公司)；摩爾超純水機(1810D型，上海摩勒科學儀器有限公司)；低溫離心機(5427R型，德國Eppendorf公司)；恒溫磁力攪拌器(GL-325B型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.2 實驗試劑 膽固醇、TMZ(Lot：FCB055744)、二油酰磷脂酰乙醇胺(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)等購自北京百靈威科技有限公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-琥珀酰亞胺購于上海炎怡生物技術有限公司；siPD-L1購自上海吉瑪制藥技術有限公司；PBS緩沖液、色譜甲醇、色譜乙腈、冰乙酸、2-DG等購自西安科昊生物工程有限責任公司；2-DG-PEG-DSPE、聚天冬氨酸-g-聚乙烯亞胺(PASP-g-PEI1800)由本課題組自行合成。TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN的制備方法如下：取siPD-L1(330 μg)溶于2 880 μL HEPES(10 mmol/L，pH=7.4)緩沖溶液中，獲得濃度為8.7 μmol/L的siPD-L1溶液；稱取2 mg PASP-g-PEI1800連接物，溶于1 mL HEPES(10 mmol/L，pH=7.4)緩沖溶液中，配制成濃度為4.5 μmol/L的PASP-g-PEI1800溶液。取配制好的siPD-L1和PASP-g-PEI1800溶液各125 μL，混勻，渦旋30 s，室溫放置30 min，制備氮磷比(N/P)為9的siPD-L1聚合物納米粒(siPD-L1@PASP-g-PEI1800)。稱取DOPE 31.6 mg、膽固醇5.4 mg、2-DG-PEG-DSPE 21.0 mg，加入2 mL氯仿/甲醇(V/V=3∶1)的混合溶液，溶解后35 ℃減壓旋轉蒸發(fā)移除氯仿/甲醇溶液，使其形成均勻薄膜。將N/P=9的siPD-L1@PASP-g-PEI1800(2 mL，包含siPD-L1 50 μg)以及飽和TMZ水溶液(2 mL)加入到脂質薄膜中，室溫下攪拌過夜，超聲1 min，隨即將脂質納米粒轉移到截留Mr為1 000的透析袋中，在蒸餾水中透析2 h，每0.5 h更換一次蒸餾水，于-80 ℃冰箱中放置24 h，冷凍干燥24 h，即得共載siPD-L1與TMZ的脂質納米粒TMZ/siPD-L1@GLPN固體粉末。采用PEG-DSPE制備沒有2-DG修飾的脂質納米粒TMZ/siPD-L1@LPN。

1.1.3 實驗動物 昆明小鼠購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，所有動物實驗符合動物倫理要求，并通過空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利與倫理委員會批準(許可證號：KY20194106)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma)，檢測波長為329 nm，流動相為甲醇/水(1 mL/L醋酸溶液)=20/80(V/V)，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為室溫。

1.2.2 小鼠血漿及組織樣品的處理 ①血漿樣品的處理：小鼠尾靜脈注射給藥后，在預定時間點摘除眼球取全血，并加入肝素鈉抗凝，于室溫條件下5 000g離心5 min，吸取上清液300 μL，加入到2 mL離心管中，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋30 s后，于12 000g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取10 μL注入HPLC系統(tǒng)，測定血漿樣品中TMZ的濃度。②組織樣品的處理：小鼠尾靜脈注射給藥后，在預定時間點處死小鼠，獲取小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎等器官組織，稱取組織質量，向每個組織中加入1 mL生理鹽水(肝臟加入2 mL)，勻漿后取勻漿液500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋30 s后，于12 000g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取10 μL注入HPLC系統(tǒng)，測定組織樣品中TMZ的濃度，最終計算出每克組織中TMZ的含量。

1.2.3 方法學驗證

1.2.3.1 專屬性實驗 獲取小鼠的空白血漿及腦組織勻漿液，加入一定量的TMZ溶液，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和腦組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進樣，記錄色譜圖。

1.2.3.2 標準曲線的繪制 準確稱取TMZ 30 mg，充分溶解后加入到50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線。吸取不同體積的上述TMZ溶液，加入蒸餾水稀釋成5、10、50、100、200、500 mg/L的標準溶液。吸取900 μL空白血漿及各組織勻漿液，加入TMZ標準溶液100 μL，渦旋30 s，配制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的含藥血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和各組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進樣，獲取峰面積，以峰面積(Y)作為縱坐標，TMZ濃度(X)作為橫坐標，進行線性回歸，繪制血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中檢測TMZ的標準曲線，計算回歸方程。

1.2.3.3 精密度實驗 量取TMZ標準溶液，加入空白血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，渦旋30 s，配制成濃度分別為2、11、40 mg/L的含藥樣品，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和組織樣品，按“1.2.1”液相條件進樣，獲取峰面積，根據(jù)標準曲線方程，計算TMZ濃度。1 d內間隔相同時間后，重復上述操作3次，計算方法的日內精密度；連續(xù)3 d在相同時間點重復上述操作，計算方法的日間精密度。

1.2.3.4 回收率實驗 量取TMZ標準溶液，加入空白血漿、腦、心、肝、脾、肺及腎組織勻漿液，渦旋30 s，配制成濃度分別為2、11、40 mg/L的含藥樣品，按照“1.2.2”方法處理血漿及各組織勻漿液樣品，按“1.2.1”液相條件進樣，獲取峰面積，根據(jù)標準曲線方程計算TMZ濃度，計算分析方法的回收率。

1.2.4 血漿及組織樣品中TMZ含量測定 將小鼠分成3組，分別尾靜脈注射游離TMZ、TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN，每組中TMZ的給藥劑量均為50 mg/kg，于給藥后1、5、15、30 min及1、2、4、8、12、24 h，摘除眼球取小鼠全血，并加入肝素鈉抗凝，處死小鼠后獲取腦、心、肝、脾、肺、腎，按照“1.2.2”方法處理血漿樣品和組織樣品，按“1.2.1”液相條件進樣，獲取峰面積，代入標準曲線，求取各時間點血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎內的TMZ含量。

1.2.5 活體成像觀察脂質納米粒在正常體內的分布 取正常小鼠，尾靜脈注射Cy7.5標記的TMZ/siPD-L1@GLPN以及Cy7.5標記的TMZ/siPD-L1@LPN，在12、24 h后，用異氟烷麻醉小鼠，采用活體成像儀觀察脂質納米粒在小鼠體內的分布。

2 結果

2.1 TMZ檢測的HPLC方法學驗證

2.1.1 專屬性實驗 專屬性實驗結果顯示，在實驗設定的色譜條件下，TMZ的保留時間約為4.3 min，血漿以及腦勻漿液基質對TMZ的測定無干擾，提示建立的HPLC方法專屬性良好(圖1)。

A：含TMZ血漿；B：含TMZ腦組織勻漿液。TMZ：替莫唑胺。圖1 血漿以及腦組織勻漿液中TMZ的高效液相色譜圖

2.1.2 標準曲線的繪制 根據(jù)峰面積，以峰面積(Y)作為縱坐標，TMZ濃度(X)作為橫坐標，進行線性回歸，繪制血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液中檢測TMZ的標準曲線，計算回歸方程。在實驗設定的濃度范圍內，峰面積與TMZ濃度之間線性關系良好(表1)。

表1 血漿及不同組織勻漿液中TMZ檢測標準曲線及線性范圍

2.1.3 精密度實驗 精密度實驗結果顯示，檢測高、中、低3個TMZ濃度，其日內精密度以及日間精密度的相對標準差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，表明測定方法精密度良好，符合新藥臨床前研究要求(表2)。

表2 HPLC測定血漿及不同組織勻漿液中TMZ的日內精密度和日間精密度(n=3)

2.1.4 回收率實驗 回收率實驗結果顯示，檢測高、中、低3個TMZ濃度的回收率大于98%，小于103%，RSD均小于5%，符合新藥臨床前研究要求，能夠用于TMZ含量測定(表3)。

表3 HPLC測定血漿及不同組織勻漿液中TMZ的回收率(n=3)

2.2 血漿及組織樣品中TMZ含量測定

TMZ在小鼠體內血藥濃度隨時間變化的曲線顯示，相較于游離TMZ，小鼠尾靜脈注射TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN后，TMZ的消除速度明顯減慢，TMZ在血液中的循環(huán)時間顯著延長(圖2)。

TMZ：替莫唑胺；PD-L1：程序性細胞死亡蛋白-配體1；siPD-L1：PD-L1特異的圖2 尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@GLPN和TMZ/siPD-L1@LPN后，小鼠血漿中TMZ濃度時間變化曲線

給予游離TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，TMZ在小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎等組織內的分布結果顯示，小鼠靜脈注射游離TMZ后，TMZ能夠迅速分布于腦組織；小鼠靜脈注射TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，TMZ進入腦組織的速度減慢；與游離TMZ和TMZ/siPD-L1@LPN相比，TMZ/siPD-L1@GLPN能顯著提高TMZ在腦組織內的蓄積。尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN和TMZ/siPD-L1@GLPN后，血漿及腦、心、肝、脾、肺、腎等組織中TMZ濃度-時間曲線下面積(area under the curve，AUC)如表4所示，與游離TMZ相比，TMZ/siPD-L1@GLPN能夠顯著提高TMZ在血漿及腦組織內的AUC，且效果顯著優(yōu)于TMZ/siPD-L1@LPN。以上結果表明TMZ/siPD-L1@GLPN能夠增加TMZ在血液中的循環(huán)時間，增加TMZ在腦組織內的分布及滯留。

表4 小鼠尾靜脈注射TMZ、TMZ/siPD-L1@LPN及TMZ/siPD-L1@GLPN后TMZ在各組織內的AUC

2.3 活體成像儀觀察脂質納米粒在正常體內的分布

取正常小鼠，尾靜脈注射Cy7.5標記的TMZ/siPD-L1@GLPN以及Cy7.5標記的TMZ/siPD-L1@LPN，在12、24 h后，異氟烷麻醉小鼠，采用活體成像儀觀察脂質納米粒在小鼠體內的分布。結果顯示，TMZ/siPD-L1@LPN幾乎不能穿過血腦屏障，在12 h和24 h時，僅有很少量的脂質納米粒在腦組織內蓄積；而TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內的蓄積明顯增多，在12 h時熒光強度達到6.83×107，且24 h后，在腦部仍舊能觀察到TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內的蓄積，熒光強度為2.35×107(圖3)。小鼠被處死后，將腦、心、肝、脾、肺、腎等器官組織取出，活體成像儀觀察納米粒在小鼠各器官組織的蓄積。結果顯示，TMZ/siPD-L1@GLPN在腦組織內能夠大量蓄積，蓄積量顯著高于TMZ/siPD-L1@LPN給藥組(P<0.01，圖4)。以上結果表明，TMZ/siPD-L1@GLPN不僅能高效跨血腦屏障轉運，而且能夠在腦組織中滯留較長時間。

A：TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN在小鼠體內分布的活體成像觀察結果；B：腦組織內平均熒光強度統(tǒng)計結果。TMZ：替莫唑胺；PD-L1：程序性細胞死亡蛋白-配體1；siPD-L1：PD-L1特異的圖3 TMZ/siPD-L1@GLPN及TMZ/siPD-L1@LPN在正常小鼠體內的分布

3 討論

TMZ是目前治療GBM最為有效的化療藥物，但是TMZ在血液循環(huán)中極易水解為MTIC，MTIC幾乎不能通過血腦屏障，從而極大地降低了TMZ在腦內的蓄積。本研究以2-DG-PEG-DSPE、膽固醇及DOPE等構成的脂質薄膜為外層殼，采用前期合成的新型陽離子聚合物PASP-g-PEI1800壓縮siPD-L1，采用薄膜分散法將siPD-L1及TMZ共同負載在脂質納米粒TMZ/siPD-L1@GLPN中。研究結果顯示，相較于游離TMZ，TMZ/siPD-L1@LPN及TMZ/siPD-L1@GLPN均可以降低TMZ的水解，從而減慢TMZ在體內的清除，顯著提升TMZ在血液中的循環(huán)時間。

研究顯示，DOPE是一種常用的助磷脂，在制備陽離子脂質體過程中具有很強的協(xié)同作用。DOPE能夠干擾類脂膜，降低內涵體膜的穩(wěn)定性，并增加脂質納米粒與質膜的融合，從而使脂質納米粒從內涵體逃逸[18]。前期研究結果顯示，TMZ/siPD-L1@GLPN能夠從溶酶體高效逃逸，將包裹在脂質納米粒內的藥物釋放到細胞漿內[17]。由于血腦屏障的存在，大多數(shù)藥物難以進入到腦組織[19-20]。我們前期研究結果顯示，腦毛細血管內皮細胞表面，葡萄糖轉運體-1高表達[17]，因此，HPLC及活體成像儀檢測結果顯示，相較于TMZ/siPD-L1@LPN，TMZ/siPD-L1@GLPN在小鼠腦組織內蓄積及滯留時間顯著延長，表明2-DG修飾可以顯著增加脂質納米粒的腦靶向性，從而更好地發(fā)揮抗GBM活性。