王彥芳，張瀟劍，賈巍力，毛珍珍，石 文，聶 耶，宋文杰

(1空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710032；2西安醫(yī)學院研究生院，陜西 西安 710021)

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)的腫瘤中發(fā)病率位居第六，死亡率排第三，分為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝內(nèi)膽管癌以及混合性癌，其中HCC約占90%。據(jù)預估，截至2025年，受到肝癌困擾的患者數(shù)量每年將新增超過100萬[1]。雖然治療HCC手段很多，但是HCC發(fā)病隱匿，臨床診斷發(fā)現(xiàn)往往以中晚期為主，致死率高，5年生存率非常低[2]。隨著這些年癌癥系統(tǒng)性免疫療法快速發(fā)展，如免疫檢查點阻斷劑、酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體等，給HCC患者帶來了新的希望，然而HCC分子發(fā)病機制因不同的遺傳毒性損傷和病因而導致免疫反應多樣性及差異性，使得大部分患者對化療和放療具有耐藥性[3]。因此，深入闡明HCC免疫微環(huán)境調(diào)控機制，對HCC治療具有重大臨床意義。

一般而言，肝癌發(fā)生過程涉及多個步驟、多種因素，包括許多遺傳或表觀遺傳的變化，最終導致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。免疫微環(huán)境參與了癌癥的轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移等所有階段。越來越多的研究顯示具有復雜構(gòu)造的人類惡性腫瘤受到多種免疫細胞浸潤。實體腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中的免疫細胞通過吸附和聚集，活化抗腫瘤T細胞，監(jiān)視并清除腫瘤細胞，也可通過活化巨噬細胞、髓源性抑制細胞或調(diào)節(jié)性T細胞，構(gòu)建抑制免疫表達的微環(huán)境，并且還會因為腫瘤類型、分型及個體不同導致明顯的差異性[4]。多項研究發(fā)現(xiàn)TME對腫瘤的療效差別及耐藥性有巨大影響。癌癥免疫治療的療效依賴于產(chǎn)生有效和持久的適應性免疫抗腫瘤反應[5]。然而，由于腫瘤免疫逃逸和缺乏準確的預測性生物標記物，客觀反應率仍然很低，在20%～40%之間[3]。此外，由于T細胞活化增強，有時會導致治療中斷，從而發(fā)生與免疫相關(guān)的不良事件。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的免疫途徑，以改善免疫療法的反應和癌癥患者的預后。對TME進行深入研究發(fā)現(xiàn)，三級淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structures，TLS)是一種由組織細胞聚集的結(jié)構(gòu)，與次級淋巴器官(secondary lymphoid organs，SLO)類似，而且可能對HCC的預后及治療具有重要的調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)也表明，在腫瘤中具有抗腫瘤免疫反應的TLS結(jié)構(gòu)，將成為可以產(chǎn)生免疫反應的地方中樞[6]。本文就目前HCC研究現(xiàn)狀，提出了TME與HCC的關(guān)系，引出了TLS，進一步回顧了近些年來TLS在腫瘤中的研究進展，闡述了TLS對HCC預后的兩面性、TLS作為臨床免疫治療的潛在靶器官是如何通過調(diào)節(jié)TLS的形成來影響HCC預后以及提高免疫治療效果的，希望為日后的研究提供新思路。

1 TLS相關(guān)研究

1.1 TLS概述

TLS是一種新生的異位淋巴組織，又被稱為異位淋巴結(jié)構(gòu)，更有人稱之為三級淋巴器官及誘導淋巴器官等，其存在于長期慢性感染及腫瘤組織中，例如持續(xù)性病原體感染、自身免疫性疾病、同種異體排斥反應和各種癌癥。細胞結(jié)構(gòu)及功能類似于SLO，具有啟動免疫應答的能力。已有研究證實，在某些腫瘤中如黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌等，TLS對于其預后有著積極的作用，而在免疫系統(tǒng)性疾病例如橋本氏甲狀腺炎、狼瘡腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎中，與其預后差成正相關(guān)[7]。

1.2 TLS與SLO

TLS在結(jié)構(gòu)組成方面與SLO極為相似，其基礎(chǔ)細胞組成包括T細胞、B細胞及其他基質(zhì)細胞。成熟的TLS包括T細胞區(qū)和B細胞區(qū)。T細胞區(qū)包含具有Th1、細胞毒性或記憶表型的活化T細胞，參與抗原提呈的成熟樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和成纖維網(wǎng)狀細胞；B細胞區(qū)中的生發(fā)中心(germinal center，GC)那里可以檢測到記憶B細胞和漿細胞。其中T細胞區(qū)域包裹GC。并且，在整個TLS中散在分布高內(nèi)皮微靜脈(high endothelial venules，HEV)、DC溶酶體相關(guān)膜蛋白和DC[8]。

TLS和SLO在功能上也是極為相似的，主要體現(xiàn)在編碼淋巴細胞趨化因子和淋巴毒素(lymphotoxin，LT)的基因表達上。GC區(qū)中能夠介導B細胞分化、T細胞超突變、寡克隆擴增以及最終的抗體產(chǎn)生[9]。有研究更是在敲除SLO小鼠中發(fā)現(xiàn)TLS可以取代SLO產(chǎn)生免疫應答反應[10]。

盡管TLS和SLO有著極為相似的功能，但二者仍然存在不同。在形態(tài)學上，TLS缺乏包膜，存在于各種非淋巴組織中，所以它可以是淋巴細胞聚集體，也可以是更具組織性的結(jié)構(gòu)，并且它們之間的區(qū)別也沒有一個清晰的評定標準[11]。在免疫應答過程中，TLS直接暴露于炎性環(huán)境，接受刺激抗原和細胞因子的作用，快速產(chǎn)生免疫應答的同時也可能發(fā)生過量淋巴細胞活化，進而產(chǎn)生“炎性因子風暴”，這也有可能是某些自身免疫系統(tǒng)疾病的致病因素之一[12]。在形成方面，SLO是在人體胚胎時期由淋巴組織誘導細胞與基質(zhì)細胞之間的相互作用而形成的，不同于初級及次級淋巴結(jié)構(gòu)，TLS不是在胚胎時期形成的，其在正常情況下是不存在的，主要在慢性炎癥(如持續(xù)性病原體感染、自身免疫性疾病、同種異體排斥和癌癥)部位誘導下形成，由免疫細胞聚合形成離散的結(jié)構(gòu)化組織。它們存在時間短暫，具有可塑性，主要與損傷有關(guān)，能夠在抗原清除和組織修復后而分解[10]。這也是兩者最根本的不同之處。

TLS和SLO也是緊密相連的，研究表明淋巴組織或淋巴樣組織之間是連續(xù)的。免疫應答來自具有良好組織結(jié)構(gòu)的SLO，到非包膜的非淋巴樣組織，如結(jié)腸中的派爾氏結(jié)和預先存在的淋巴濾泡等結(jié)構(gòu)，再到出生后在感染或癌癥條件下可能發(fā)生的具有可塑性的、暫時性的TLS[13]。機體通過先天性和適應性的免疫應答來抗腫瘤免疫反應以消除癌細胞，從而達到生理性康復。

1.3 TLS的形成機制

TLS是由HEV、帶有濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cell，F(xiàn)DC)的B細胞濾泡、GC和淋巴管構(gòu)成了組織程度不同的非包膜結(jié)構(gòu)，且TLSs的結(jié)構(gòu)、功能和形成在不同的組織和各種疾病之間會有所不同[14]。淋巴新生被認為是TLS形成的起始。TLS的形成過程與SLO的免疫應答過程存在多方面的重疊。

與SLO形成不同，TLS可以獨立于淋巴組織誘導細胞形成，由不同于其他淋巴結(jié)構(gòu)形成的誘導因子的信號產(chǎn)生，例如，它們可以在RORtγ-和Id2-缺陷小鼠中形成[15]。

與程序化SLO和孤立淋巴濾泡的形成類似，TLS的形成是一個多步驟的過程。首先，局部成纖維細胞的重編程在TLS的形成中起著至關(guān)重要的作用[16]。在炎癥的刺激下，局部成纖維細胞獲得了淋巴細胞特性，表達大量的趨化因子(如CCL19、CCL21、CXCL13和黏附分子ICAM-1和VCAM-1)，但它的信號啟動通過不同的途徑發(fā)生，提供激活信號的細胞也因環(huán)境而異，這種功能主要歸因于髓系細胞、CD4+T細胞以及先天淋巴細胞[17]。緊接著在不同細胞來源的IL-17和IL-22協(xié)助下，驅(qū)動成纖維細胞啟動，并進一步膨脹擴張[18]。然而，成纖維細胞產(chǎn)生的趨化因子并不足以驅(qū)動TLS的新生，還需要招募多個造血細胞來促進這一過程。同時，在抗原刺激下，TLS中髓系細胞和B細胞充當抗原遞呈細胞[19]。因此，趨化因子的獲得和抗原呈遞都可能是驅(qū)動TLS形成的關(guān)鍵，但這些功能不一定重疊。在SLO的形成和成熟中，LT β受體(LT β receptor，LTβR)信號通路是必需的。而在TLS的新生中，LTβR的刺激似乎并不是必需的，而在維持組織中淋巴結(jié)(lymph node，LN)成纖維細胞是必需的[18]。

在TLS進一步成熟過程中，HEV的形成至關(guān)重要。TLS中的初始淋巴細胞簇由活化的B細胞、T細胞與髓細胞共同形成，而原始的淋巴細胞則需要通過HEV表達外周淋巴結(jié)血管地址素配體CD62L以及CCR7(CCL21和CCL19的受體)進入TLS[14]。與LN類似，HEV的形成似乎依賴于LTα1β2，而與LTβR相關(guān)性仍有待進一步的研究[20]。

TLS成熟的最后一個標志是B細胞濾泡內(nèi)FDC的形成，然而TLS中的FDC祖細胞尚不清楚，有報道表明FDC的形成需要SLO中的LTβR和TNFR1信號，其中LTα1β2對于TLS中FDC的生成非常重要，能夠允許GC反應和抗原呈遞[21]，如果將激活的局部基質(zhì)細胞與遷移的免疫細胞相遇，將會分化為FDC。盡管對SLO與TLS的研究已經(jīng)很多了，然而驅(qū)動腫瘤中TLS形成的機制仍幾乎未知。

2 TLS對HCC患者預后的影響

大量的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中，一部分癌癥的預后與TLS的存在呈正相關(guān)，而在一些癌癥中則表現(xiàn)為較差的預后，其中較差的預后主要與TLS的成分、位置等有關(guān)。在不同類型腫瘤的間質(zhì)、浸潤邊緣和/或核心中均可發(fā)現(xiàn)TLS[22]。那么在肝癌中，TLS在不同的位置是如何影響預后的？HCC是一種炎癥驅(qū)動型癌癥，其特征為肝硬化結(jié)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌間質(zhì)中存在大量TLS，這將增加術(shù)后2年晚期復發(fā)的風險，有人認為它們可能作為肝癌祖細胞龕位[23]。在肝癌組織中TLS的密度低于癌旁組織，且瘤內(nèi)的成熟TLS比不成熟TLS更能夠預測肝癌患者較低的早期復發(fā)率，然而癌旁組織中的TLS則對早期和晚期復發(fā)沒有預后價值。

在我們的研究團隊中，根據(jù)HE染色結(jié)果，將空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院和癌癥基因組圖譜肝癌患者分為TLS+組和TLS-組，分別研究了其對HCC患者預后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)TLS是HCC早期復發(fā)的低風險因素，而對晚期復發(fā)無影響[24]。因此，正常情況下在腫瘤間質(zhì)中的TLS能夠促進腫瘤形成、激發(fā)炎癥狀態(tài)，而腫瘤內(nèi)TLS則真正反映了持續(xù)的、有效的抗腫瘤免疫[12]。

綜上所述，TLS可能在肝細胞癌的不同區(qū)域中具有雙重預后作用。在肝癌間質(zhì)中的TLS提高了晚期復發(fā)率，而腫瘤內(nèi)成熟的TLS則降低早期復發(fā)率，提示良好的預后作用，在癌旁組織中的TLS則對預測預后無明顯的價值。

3 TLS對免疫治療的影響

免疫檢查點的出現(xiàn)為腫瘤患者迎來了福音，然而并不是所有患者均有較好的免疫反應。因此，迫切需要確定一個可以對免疫反應敏感的腫瘤標志物。在接受抗PD-1治療的腫瘤患者中，臨床反應的一個重要前提是腫瘤部位存在足量的抗腫瘤T細胞和PD-1配體，在進行抗PD-1治療時，被抑制的細胞重新激活成為效應細胞，進一步殺死惡性細胞[25]。腫瘤突變負荷也是作為評估免疫治療反應的另一個指標。然而，這些標記都不能完全預測患者對免疫療法的反應。在對非小細胞型肺癌抗PD-1治療的研究中發(fā)現(xiàn)，對治療有反應的患者體內(nèi)富集TLS[26]。而且在各種疫苗試驗中也發(fā)現(xiàn)，給予惡性腫瘤治療性疫苗接種后，可以刺激TLS形成，同時產(chǎn)生大量T淋巴細胞，說明TLS可能是誘導抗腫瘤免疫的主要成分[27]。根據(jù)以上的研究結(jié)果可以推測，腫瘤中TLS的誘導可能促進淋巴細胞的招募和腫瘤控制；而作為各種免疫細胞的聚集地，TLS對腫瘤復發(fā)的控制，給免疫治療反應的評估帶來新的契機。例如，最近的兩項研究表明，對免疫治療有反應的黑色素瘤患者中TLS的密度高于那些無反應的患者[28]。

鑒于TLS的抗腫瘤免疫的積極效果，最近出現(xiàn)了一系列老鼠模型的報告，研究如何誘導TLS新生。例如，使用血管靶向肽將LIGHT靶向腫瘤血管，從而使大量T淋巴細胞涌入血管，增強抗PD-1和抗CTLA4免疫檢查點抑制劑的療效[29]。再如，誘導HEV和基質(zhì)的形成，進一步促進抗腫瘤免疫細胞的聚集，從而導致腫瘤破壞[30]。這一新興技術(shù)未來可能被用于在免疫低的腫瘤和免疫高的腫瘤中誘導TLS，與抑制炎癥環(huán)境的治療藥物和/或免疫檢查點抑制劑結(jié)合使用，進一步改進某些患者對免疫檢查點抑制劑反應差的情況。

4 結(jié)束語

HCC作為一個炎癥驅(qū)動型癌癥，在慢性炎癥刺激后，局部產(chǎn)生免疫細胞的非包膜性團塊聚集，最終在各種趨化因子的作用下形成TLS，而TLS可能在肝細胞癌的不同區(qū)域中具有雙重預后作用。在肝癌間質(zhì)中的TLS提高了晚期復發(fā)率，而腫瘤內(nèi)成熟的TLS則降低早期復發(fā)率，提示良好的預后作用，在癌旁組織中的TLS則對預測預后無明顯的價值。

根據(jù)TLS的抗腫瘤免疫反應的特征，將為HCC誘導良好的淋巴樣新生環(huán)境，從而有效促進局部T細胞反應和腫瘤消退。且有研究發(fā)現(xiàn)，在進行免疫治療后有反應的患者TLS密度比無反應的患者高，可能在提高免疫治療的敏感性方面TLS也體現(xiàn)出了優(yōu)越性。因此，在將來的腫瘤治療中，我們可以試著通過各種方法誘導產(chǎn)生TLS，進而提高免疫療效，尤其是對免疫力差的患者。所以隨著對HCC中的TLS研究的日益深入，免疫療法新靶點的出現(xiàn)會給肝癌患者帶來新的曙光。我們不僅可以通過檢測TLS來實現(xiàn)肝癌的早期診斷，還能提高肝癌患者的生存率，這將會是抗癌戰(zhàn)役的重要轉(zhuǎn)折點。

由于TLS測定方法不同，耗時長，主觀性強，難以用于臨床實踐，同時缺乏可重復和標準化的TLS識別方法。目前，TLS鑒定方法只能通過組織活檢進行，然而，隨著全球公開數(shù)據(jù)和人工智能的發(fā)展，使TLS識別標準化成為可能，這是臨床實踐中對抗癌癥的一個有力武器。在將來對TLS的研究中，我們還可以尋找相關(guān)的標志物，從外周組織(如血液、消化液，甚至排泄物)中識別某種特征，將減少患者損傷，提高檢測效率。