拜云虎，王全暉，岳 瑋，謝 峻，吳菲菲，王亞云，楊雁靈，張春旭

(1解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院普外科，河南 鄭州 450007；2空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽胰脾外科，陜西 西安 710032；解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院：3全科醫(yī)學科，4檢驗輸血科，河南 鄭州 450007；5空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院教學實驗中心，陜西 西安 710032)

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由急性或慢性肝病或門體分流引起的腦功能障礙[1]。在全球范圍內(nèi)，慢性肝病約影響8.44億人，每年造成約200萬人死亡，其中100萬人與肝硬化及其并發(fā)癥有關(guān)，而HE發(fā)生率占肝硬化患者的30%～40%[2]。血液循環(huán)中氨含量的升高被認為是肝硬化患者HE的一個關(guān)鍵致病因素[3-4]。因此，降低血氨水平是改善HE的重要措施，也是當前治療HE的主要手段之一。目前對于高氨損傷中樞神經(jīng)的具體機制仍然不清楚，因此，進一步研究其相關(guān)機制為臨床提供潛在的藥物靶點具有重要意義。

氨是在氨基酸分解代謝、嘌呤分解和腸道微生物代謝等生物過程中產(chǎn)生的一種細胞毒性代謝物。既往大量研究表明高氨導致線粒體氧化功能障礙、ATP合成減少、自由基生成增加等[5-6]。但目前鮮有關(guān)于高氨狀態(tài)時線粒體形態(tài)的變化與自噬之間關(guān)系的報道。由于腦組織對能量需求較高，腦內(nèi)富含線粒體，且線粒體參與調(diào)節(jié)各種重要的細胞過程，包括代謝、ATP生成和炎癥激活。線粒體形態(tài)的變化會隨著細胞環(huán)境的變化而發(fā)生分裂或融合，線粒體分裂和融合的平衡對腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7]。線粒體通過不斷的分裂和融合，改變自身的形狀、大小和數(shù)量，以滿足細胞的代謝需求[8]。盡管線粒體分裂對腦內(nèi)神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞的功能性吞噬很重要，但過度的線粒體分裂會導致各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，包括缺血-再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病帕金森病和阿爾茨海默病。線粒體自噬蛋白Pink1是清除受損線粒體的重要蛋白之一，而過度的自噬也會損傷線粒體，導致線粒體功能形態(tài)的異常。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在肝損傷誘導的HE中，腦組織內(nèi)線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1以及自噬蛋白Pink1表達增多[9-10]，但是體外高氨狀態(tài)與線粒體形態(tài)之間的關(guān)系及機制仍然不清楚。本研究旨在探討高氨誘導線粒體異常分裂和功能障礙的分子機制以及Pink1對線粒體裂變的調(diào)節(jié)作用。假設(shè)高氨誘導線粒體自噬Pink1以及分裂蛋白Drp1表達增多，線粒體出現(xiàn)碎片化和功能障礙，而減少Pink1表達可減緩高氨誘導的線粒體功能障礙的進展。本研究為高氨誘導神經(jīng)細胞損傷提供了可能的分子機制，為治療高氨血癥或HE提供理論依據(jù)和潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SHSY5Y細胞購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。CCK-8試劑盒(CA1210)購自北京索萊寶生物科技有限公司；增強型ATP檢測試劑盒(50027)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Pink1的慢病毒購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司?？贵w：Pink1(ab23707，Abcam，英國)，Parkin(PA5-13399，Invitrogen，美國)，Drp1(9570S，CST，英國)，β-actin(Abclonal，中國)；免疫熒光以及Western blotting二抗均購自Abbkine生物有限公司(中國)。NH4Cl(213330，Sigma，美國)。F-12培養(yǎng)基(C11765500BT，Gibco，美國)，MEM培養(yǎng)基(C11095500BT，Gibco，美國)，F(xiàn)BS(10099-141，Gibco，美國)。慢病毒pCLenti-U6-shRNA(Pink1)-CMV-Puro-WPRE購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SHSY5Y細胞培養(yǎng) 將SHSY5Y細胞培養(yǎng)基配置為：420 mL/L MEM+420 mL/L F-12+150 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗，在37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%時傳至6孔板或96孔板中用于后續(xù)實驗。

1.2.2 NH4Cl處理 高氨模型的制備方法：SH-SY5Y細胞配成1×108/L細胞懸液，接種于96孔板，待貼壁后，給予以培養(yǎng)基為溶液配置后的不同濃度(1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)的NH4Cl(紫外消毒，過濾)，Sham組內(nèi)加入不含NH4Cl的培養(yǎng)基，余均相同，之后分別在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24、48 h，待做后續(xù)處理。

1.2.3 細胞凋亡檢測 細胞凋亡-Hoechst檢測試劑盒購自碧云天(C0003，中國)，SH-SY5Y細胞接種于12孔板，待貼壁后，給予以培養(yǎng)基為溶液配置后的不同濃度(0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)的NH4Cl，Sham組內(nèi)加入不含NH4Cl的培養(yǎng)基，余均相同，之后分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入0.25 mL固定液，固定10 min，使用PBS清洗3次，加入0.25 mL Hoechst染色液，染色5 min，隨后使用PBS清洗3次，加入熒光封片劑于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 感染慢病毒 將SH-SY5Y細胞配成2×108/L細胞懸液，細胞按30%匯合度接種到12孔板。每孔鋪1 mL，12 h細胞貼壁后感染慢病毒。感染12～20 h后換培養(yǎng)基，每孔加入1 mL新鮮的培養(yǎng)基。72 h后共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.5 CCK-8檢測 在96孔板中配置100 μL的細胞懸液(細胞量為1×108/L)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h(在37 ℃，50 mL/L CO2的條件下)；細胞貼壁后更換培養(yǎng)液為不同濃度的NH4Cl培養(yǎng)基，濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L；分別孵育24、48 h后更換培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液；加入CCK-8后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育2 h，用酶標儀測定A450 nm值。

1.2.6 蛋白水平檢測 提取細胞蛋白，采用BCA法蛋白定量、SDS-PAGE電泳后，孵育多克隆兔抗Drp1(1∶1 000)，兔抗Pink1(1∶1 000)，兔抗Parkin(1∶1 000)，鼠抗β-actin(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育；第2日孵育相應二抗(1∶5 000)，加入ECL液發(fā)光檢測并拍照保存數(shù)據(jù)。以β-actin為內(nèi)參進行半定量分析。

1.2.7 免疫熒光染色 固定細胞，進行封閉后，孵育多克隆兔抗Drp1(1∶200)，兔抗Pink1(1∶250)，4 ℃過夜孵育；孵育相對應的種屬二抗(1∶500)，加染DAPI后封片，在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.8 透射電鏡分析 細胞病毒轉(zhuǎn)染后，進行固定電鏡制樣，在JEM-1200EX型透射電鏡80 kV下觀察。觀察指標：①單位面積線粒體分布密度；②單位面積線粒體數(shù)量；③單位面積線粒體平均面積。

1.2.9 線粒體ATP指標檢測 按照生廠商說明書，將細胞裂解勻漿，檢測ATP的含量。詳見碧云天操作試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 高氨導致細胞存活率降低

我們將SHSY5Y細胞分別用0、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L NH4Cl處理24～48 h后進行觀察。首先，顯微鏡觀察細胞形態(tài)，結(jié)果顯示隨著NH4Cl濃度的升高細胞出現(xiàn)破碎，相同濃度下NH4Cl處理時間越長細胞破碎則越明顯(圖1A)。用CCK-8進行細胞活性檢測，在NH4Cl作用24 h時，同Sham組(0 mmol/L NH4Cl)進行比較，細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，5.0 mmol/L NH4Cl處理細胞已經(jīng)出現(xiàn)核致密濃染的凋亡現(xiàn)象，在10.0 mmol/L時凋亡程度進一步增加(圖1B)。在10.0 mmol/L NH4Cl處理24 h狀態(tài)下細胞活性顯著降低(P<0.05，圖1C)，而在48 h時則顯示在較低濃度1 mmol/L的NH4Cl狀態(tài)下細胞活性同樣顯著降低(P<0.01，圖1C)。以上結(jié)果表明細胞活性與氨的濃度以及作用時間明顯相關(guān)。為了進一步觀察氨在未誘導細胞活性降低以前是否對線粒體功能和形態(tài)產(chǎn)生影響，因此本研究根據(jù)實驗結(jié)果選擇氨濃度5.0 mmol/L的NH4Cl處理細胞24 h作為處理條件。

A：不同濃度NH4Cl處理24、48 h對細胞形態(tài)的作用(標尺為100 μm)；B：不同濃度NH4Cl處理24 h對細胞凋亡的影響(Hoechst染色，標尺為25 μm)；C：不同濃度NH4Cl處理24、48 h對細胞增殖能力的影響。Sham：0 mmol/L NH4Cl。aP<0.05，bP<0.01 vs Sham。圖1 不同濃度和時間的高氨處理對細胞的影響

2.2 氨誘導線粒體相關(guān)自噬表達增多

為了觀察高氨對細胞線粒體自噬的影響，我們觀察了高氨誘導后的線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1/Parkin蛋白表達變化。實驗分Sham組(0 mmol/L NH4Cl組)和NH4Cl組(經(jīng)5.0 mmol/L NH4Cl處理組)。5.0 mmol/L的NH4Cl處理24 h后提取細胞蛋白進行Western blotting和免疫熒光觀察表達變化。Western blotting結(jié)果顯示，高氨誘導細胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1/Parkin表達增加，與Sham組相比具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01，圖2A～B)。進一步使用免疫熒光染色顯示，NH4Cl組Pink1表達水平明顯高于Sham組(P<0.01，圖2C)。以上結(jié)果顯示NH4Cl顯著增加細胞內(nèi)線粒體自噬蛋白Pink1/Parkin的表達。

A：蛋白印跡顯示5.0 mmol/L NH4Cl處理24 h誘導自噬蛋白Pink1-Parkin表達；B：Western blotting分析高氨誘導自噬蛋白Pink1-Parkin結(jié)果；C：免疫熒光觀察高氨誘導Pink1表達(標尺為25 μm)；Sham：0 mmol/L NH4Cl；NH4Cl：5.0 mmol/L NH4Cl。aP<0.05，bP<0.01 vs Sham。圖2 氨誘導線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1的結(jié)果

2.3 敲除Pink1可減少氨誘導的Drp1增多

為了闡明Pink1對線粒體裂變是否有影響，我們進一步構(gòu)建慢病毒pCLenti-U6-shRNA(Pink1)-CMV-Puro-WPRE轉(zhuǎn)染氨誘導的SH-SY5Y細胞，觀察其對線粒體動力學蛋白Drp1的影響。實驗分為3組：Sham+Pink1NC組(0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理)、NH4Cl+Pink1NC組(5.0 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒組)、NH4Cl+Pink1KD組(5.0 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾組)。首先通過免疫熒光染色驗證病毒表達效果良好(圖3A)。用免疫熒光染色觀察Drp1在高氨時表達增加，而敲除Pink1后熒光表達減弱(圖3B)。進一步行Western blotting的結(jié)果顯示，與Sham+Pink1NC組相比，高氨誘導線粒體Drp1表達增加(P<0.01)，而敲除Pink1后則Drp1表達減少(P<0.05，圖3C)。以上結(jié)果顯示高氨顯著增加細胞內(nèi)Drp1表達，敲除Pink1后則會減少Drp1。

A：敲除Pink1(Pink1KD)的免疫熒光染色(標尺為25 μm)；B：免疫熒光觀察Pink1KD對Drp1的影響(標尺為25 μm)；C：Western blotting及分析結(jié)果觀察Pink1KD對Drp1的影響。Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾。aP<0.05 vs NH4Cl+Pink1NC，bP<0.01 vs Sham+Pink1NC。圖3 敲除Pink1對線粒體動力相關(guān)蛋白Drp1的影響

2.4 敲除Pink1改善高氨誘導線粒體碎片化樣變

線粒體動力相關(guān)蛋白Drp1增加往往表示線粒體分裂能力增強，提示線粒體可能碎片化樣變。那么，高氨誘導后線粒體是否存在碎片化樣變以及敲除Pink1之后是否對線粒體碎片化具有緩解作用，為了闡明此問題，本研究分別取Sham+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1KD組進行電鏡觀察線粒體數(shù)目以及分布情況。結(jié)果顯示，與Sham+Pink1NC組相比，NH4Cl+Pink1NC組細胞內(nèi)線粒體數(shù)目明顯增加，且線粒體內(nèi)膜中的空泡樣變明顯增多，而敲除Pink1后線粒體碎片化樣變被緩解(圖4A)。進一步對單位面積內(nèi)的線粒體數(shù)量進行分析，顯示減少線粒體內(nèi)Pink1誘導的自噬可緩解高氨相關(guān)的線粒體數(shù)目增加(P<0.05，圖4B)；對線粒體的平均面積分析提示高氨誘導線粒體平均面積減少(P<0.01)，而對線粒體覆蓋率無明顯影響，敲除Pink1減少線粒體平均密度(P<0.05)，但對線粒體平均面積和線粒體覆蓋率均無明顯影響(圖4B)。結(jié)果提示Pink1介導并參與高氨誘導的Drp1增加所導致的線粒體分裂。

A：電鏡下SHSY-5Y細胞中線粒體的形態(tài)(標尺為500 nm)；B：Sham+Pink1NC、NH4Cl+Pink1NC和NH4Cl +Pink1KD誘導的SHSY-5Y細胞中線粒體平均面積、線粒體平均密度、線粒體平均覆蓋率。Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾。aP<0.05 vs NH4Cl+Pink1NC，bP<0.01 vs Sham+Pink1NC。圖4 減少Pink1可改善氨誘導線粒體碎片化

2.5 敲除Pink1可改善高氨誘導線粒體ATP合成功能障礙

為了闡明Pink1調(diào)控線粒體分裂后是否對線粒體合成ATP功能有影響，我們分別在Sham+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1NC組、NH4Cl+Pink1KD組中檢測了線粒體合成ATP的功能。檢測結(jié)果顯示：高氨導致細胞ATP合成功能減退，與NH4Cl+Pink1NC相比顯著降低(P<0.01)，而給予Pink1KD后則可以明顯恢復線粒體的ATP合成功能，與高氨誘導組(NH4Cl+Pink1NC)相比顯著增加(P<0.01，圖5)。該結(jié)果提示高氨狀態(tài)下線粒體合成功能受損，減少高氨誘導的線粒體過度自噬可部分恢復線粒體合成ATP的功能。

Sham+Pink1NC：0 mmol/L NH4Cl組給予Pink1空病毒處理；NH4Cl+Pink1NC：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1空病毒組；NH4Cl+Pink1KD：5 mmol/L NH4Cl處理后給予Pink1干擾組。bP<0.01 vs Sham+Pink1NC組，dP<0.01 vs NH4Cl +Pink1NC組。圖5 Pink1KD對氨誘導線粒體ATP合成功能的影響

3 討論

HE是嚴重肝功能不全時常見的并發(fā)癥，而目前認為氨中毒學說為其主要病因之一[11]。盡管人們普遍認為高氨血癥誘導的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元損傷在介導神經(jīng)系統(tǒng)紊亂中起著主要作用[12]，但其潛在的分子機制尚不清楚，其中具有爭議的是高氨血癥引起的大腦能量代謝改變的作用。本研究探討了與Pink1調(diào)節(jié)作用相關(guān)的高氨誘導的線粒體功能障礙相關(guān)的分子機制，研究結(jié)果如下：①高氨誘導的細胞損傷，導致線粒體分裂和自噬異常升高，進而損害線粒體功能；②在SHSY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞中，Pink1敲除降低Drp1水平，減少線粒體過度分裂，恢復了線粒體合成ATP的功能[13]。在高氨誘導細胞損傷之前已經(jīng)導致細胞內(nèi)線粒體自噬和分裂異常增加，線粒體合成ATP功能減退，這代表了HE發(fā)病早期氨即已對線粒體功能造成損傷。

研究表明，氨中毒會引起腦能量代謝的明顯降低[14-15]。據(jù)報道，氨會抑制三羧酸循環(huán)酶，氨對線粒體電子呼吸鏈復合物的抑制可促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成和氧化應激[16]。腦組織對ATP的高度持續(xù)依賴使細胞內(nèi)線粒體成為HE治療中至關(guān)重要，且有望成為治療HE的重要方向。研究最初表明線粒體分裂增加與凋亡激活之間存在聯(lián)系，但現(xiàn)在很清楚線粒體形態(tài)也與生物能量學密切相關(guān)，并受代謝需求變化的影響，線粒體分裂通過將受損的細胞器從健康網(wǎng)絡(luò)中分離出來，通過線粒體自噬降解，從而有助于質(zhì)量控制[17]。線粒體通過質(zhì)量控制維持自身穩(wěn)態(tài)，其主要通過線粒體自噬、線粒體動力學、線粒體生物合成等方式來維持線粒體完整性和功能。KLEELE等[7]通過體外細胞研究發(fā)現(xiàn)線粒體Pink1/Parkin介導的自噬與線粒體周邊分裂伴隨發(fā)生，并且過度的線粒體自噬導致線粒體碎片化樣改變和自噬穩(wěn)態(tài)失衡將進一步加重損傷線粒體功能。本研究為了揭示高氨狀態(tài)下線粒體自噬對線粒體分裂的影響，因此研究調(diào)控線粒體自噬蛋白Pink1，觀察線粒體分裂狀態(tài)的表達變化。線粒體融合和裂變對調(diào)控線粒體功能具有重要的意義。線粒體不斷進行融合和裂變以維持細胞器的保真度[18]。線粒體的形態(tài)變化受大量蛋白質(zhì)的控制，其中Drp1通過介導哺乳動物的線粒體裂變過程有效地影響細胞存活和凋亡[19-20]。用siRNA或線粒體分裂抑制劑-1抑制Drp1的活性，可大大提高線粒體的穩(wěn)定性并部分抑制細胞凋亡，這表明細胞凋亡的進展至少部分取決于Drp1介導的線粒體片段化[19，21]。以上研究結(jié)果與本文中發(fā)現(xiàn)高氨前期發(fā)生線粒體損傷結(jié)論一致。

線粒體形態(tài)受Drp1介導的裂變過程調(diào)控，Drp1可促進線粒體裂變影響神經(jīng)元功能[22]。線粒體過度的分裂提示線粒體碎片化、線粒體功能障礙、合成ATP能力減退。DREWS等[23]在人星形膠質(zhì)瘤細胞中給予5 mmol/L NH4Cl高氨誘導6 h即表現(xiàn)出線粒體碎片化，24 h最為嚴重，但延長時間并未增加碎片化程度。線粒體碎片化與線粒體自噬關(guān)系密切。線粒體自噬自2005年首次提出后已被證明與多種系統(tǒng)疾病有關(guān)，目前研究已闡明線粒體自噬主要由兩種分子途徑介導，一條通路通過缺氧誘導因子1亞單位α激活，另一條由Pink1/Parkin通路參與介導[24-26]。而本文研究發(fā)現(xiàn)，高氨通過誘導損傷導致Pink1高表達，并伴隨著Drp1誘導的線粒體過度分裂，電鏡結(jié)果進一步得到證實。最近一項在帕金森病模型中的研究表明，Pink1的過表達促進神經(jīng)元內(nèi)線粒體分裂，而Pink1敲除失活導致過度融合，同時減少線粒體的碎片化，該研究與本文研究結(jié)果一致[27]。2021年，KLEELE等[7]通過對線粒體生理學的精細時空分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)線粒體膜電位和質(zhì)子泵動力降低，ROS和Ca2+水平增加導致線粒體Pink1/Parkin介導的自噬發(fā)生，且該現(xiàn)象發(fā)生在Drp1由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體外膜分裂位點之前。以上成果與本文研究結(jié)果表明Drp1誘導的線粒體分裂依賴于Pink1對線粒體自噬的調(diào)控，通過調(diào)控Pink1可改善線粒體功能以及形態(tài)，有望成為治療HE高氨誘導的神經(jīng)元損傷的新靶點。線粒體分裂根據(jù)細胞環(huán)境的不同分為進行生物發(fā)生的分裂(即中央分裂)以及自我保護的損傷排除性的分裂(即邊緣分裂)，而在高氨不同程度處理狀態(tài)下線粒體分裂模式可能存在差異，需要進一步確認，這也將是下一步的研究方向。

總之，本研究揭示在體外高氨模型中敲除Pink1表達，可減少Drp1誘導的線粒體過度分裂，并顯著恢復線粒體ATP合成功能，從而緩解高氨誘導的能量代謝障礙。因此，Pink1介導的線粒體自噬對于了解高氨誘導的線粒體形態(tài)異常和功能障礙具有重要意義，有望成為治療HE的潛在靶點。當然，Pink1與高氨之間的具體機制仍需要進一步大量體內(nèi)和體外實驗的驗證和闡明。