周曄農(nóng)，張 冰，陳 濤，楊秀玲，金 艷，呂向妮，郭 紅，易 蔚，趙 榮，段維勛，劉金成，金振曉

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710032)

心臟移植是目前治療終末期心力衰竭最有效的方法。根據(jù)國(guó)際心肺移植學(xué)會(huì)的調(diào)查，盡管有許多心力衰竭患者需要接受心臟移植，但實(shí)際上只有極少數(shù)(僅4%)的患者最終能夠獲得這一手術(shù)機(jī)會(huì)[1]，在中國(guó)，每年等待心臟移植手術(shù)的患者與成功接受移植手術(shù)患者的比例為30∶1[2]。心臟異種移植是解決供體短缺的重要手段[3]。2022年1月，馬里蘭大學(xué)團(tuán)隊(duì)成功進(jìn)行了世界首例豬-人心臟異種器官移植手術(shù)，且受者在手術(shù)后存活了60 d[4]。2023年9月，他們又進(jìn)行了第二例豬-人心臟異種移植手術(shù)，目前受者仍存活[5]。

盡管異種移植被認(rèn)為是心臟移植的一種有效替代方法，但障礙重重，需要克服的困難包括免疫排斥[6]、凝血功能障礙[7]、異種移植物生長(zhǎng)[8]、感染和炎癥[9]等。隨著基因編輯技術(shù)、免疫抑制方法以及術(shù)后管理策略的不斷改進(jìn)，心臟異種移植受體的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)[10-11]。然而在心臟同種異體移植和異種移植實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后感染很常見(jiàn)，并且顯著影響移植物存活率[12-13]。不同類(lèi)型的病原微生物，包括細(xì)菌、病毒和真菌，都可能成為移植后感染的病原體。本研究圍繞2022年空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院開(kāi)展的1例基因編輯豬-恒河猴異種心臟移植實(shí)驗(yàn)術(shù)后受體猴的臨床表現(xiàn)、檢查檢驗(yàn)指標(biāo)等數(shù)據(jù)，總結(jié)感染發(fā)生的情況、治療措施及預(yù)后轉(zhuǎn)歸，為未來(lái)的異種移植研究提供經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

供體為GTKO/β4GalNT2 KO/CMAH KO/hCD55/hCD46/hTBM基因編輯的雄性小型巴馬豬，基因編輯豬是通過(guò)體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的[10]。將表達(dá)重組人蛋白的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的豬胚胎成纖維細(xì)胞中，其中hCD55和hCD46調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑，hTBM預(yù)防凝血功能障礙。供體豬敲除主要糖類(lèi)抗原半乳糖α-1,3-半乳糖，另外兩個(gè)異種抗原N-糖基神經(jīng)氨酸和Sda被CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的插入和/或缺失突變基因敲除，這些基因編碼催化它們合成的酶，即CMAH和β4GalNT2。供體豬體質(zhì)量7 kg，受體為雄性恒河猴，體質(zhì)量10 kg。

1.2 方法

1.2.1 異種異位心臟移植 采用腹腔異位心臟移植的手術(shù)方法。術(shù)前1周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驅(qū)蟲(chóng)處理，術(shù)前12 h禁食水并清洗全身。供體豬麻醉后從劍突到柄的中線切口打開(kāi)其胸部。全身肝素化，結(jié)扎下腔靜脈和上腔靜脈，阻斷靜脈回流，切開(kāi)下腔靜脈、左上腔靜脈和左心房。主動(dòng)脈根部插入冷灌針，阻閉升主動(dòng)脈并灌注4 ℃冷組氨酸-色氨酸-酮戊二酸停搏液，同時(shí)將碎鹽水冰敷在心包上。將心臟腔靜脈、左心房、肺動(dòng)脈和主動(dòng)脈分離，取出心臟，留下足夠長(zhǎng)的大血管進(jìn)行吻合。心臟從胸腔取出后，左心房和腔靜脈開(kāi)口被封閉。受體猴麻醉后，通過(guò)中線切口打開(kāi)其腹部，暴露并分離出腎動(dòng)脈開(kāi)口下方腹主動(dòng)脈和下腔靜脈。肝素化后，鉗夾后，行腹主動(dòng)脈切開(kāi)和下腔靜脈切開(kāi)。供體主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，供體肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈端側(cè)吻合。吻合后，大血管及吻合口排氣并開(kāi)放血流，靜脈給予甲強(qiáng)龍20 mg/kg，同時(shí)給予碳酸氫鈉、利多卡因、100 mL/L葡萄糖酸鈣、硫酸鎂注射液，直至心功能恢復(fù)和竇性節(jié)律恢復(fù)。

1.2.2 圍術(shù)期免疫抑制方案 受體猴的免疫抑制方案包括抗胸腺細(xì)胞球蛋白、αCD20抗體(利妥昔單抗)用于T細(xì)胞和B細(xì)胞抑制；阿巴西普用于阻斷CD28/B7共刺激信號(hào)通路；眼鏡蛇毒因子用于抑制補(bǔ)體激活；托珠單抗和依那西普用于抑制炎性因子，他克莫司(維持5～25 μg/L的血藥濃度)用于抑制淋巴細(xì)胞，甲潑尼龍用于抗炎和抗急性排斥反應(yīng)。受體持續(xù)微量泵注射肝素，維持活化凝血時(shí)間在基線水平的2倍，持續(xù)至受體死亡。

1.2.3 圍術(shù)期感染預(yù)防方案 給予更昔洛韋預(yù)防病毒感染，抗真菌感染選擇注射用醋酸卡泊芬凈。術(shù)前30 min給予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉0.5 g，術(shù)后繼續(xù)給予頭孢哌酮舒巴坦鈉持續(xù)6 d預(yù)防術(shù)后細(xì)菌感染。根據(jù)受體病情、藥效、用藥時(shí)長(zhǎng)調(diào)整抗生素的使用，具體給藥劑量及詳細(xì)調(diào)整過(guò)程見(jiàn)結(jié)果部分。

1.2.4 術(shù)后重癥監(jiān)護(hù) 受體猴手術(shù)結(jié)束42 min后拔除氣管插管，重癥監(jiān)護(hù)護(hù)士和醫(yī)生在術(shù)后20 d提供重癥監(jiān)護(hù)級(jí)別的監(jiān)測(cè)和管理。限制受體肢體活動(dòng)，并持續(xù)監(jiān)測(cè)呼吸、血壓等生命體征。每日早晨抽血，測(cè)定全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、炎癥因子及每日進(jìn)行引流液、胃液、口鼻腔分泌物、腹腔積液等液體的細(xì)菌培養(yǎng)，用于監(jiān)測(cè)感染。受體猴從術(shù)后第4日開(kāi)始每日進(jìn)行胸部X射線片檢查，用于監(jiān)測(cè)是否出現(xiàn)肺部感染，并根據(jù)胸片情況對(duì)肺部護(hù)理進(jìn)行調(diào)整，如加強(qiáng)翻身、拍背、霧化、吸痰等護(hù)理措施預(yù)防肺部炎癥進(jìn)展。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有生成的數(shù)據(jù)，包括線形圖，使用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 總體結(jié)果和結(jié)局

受體猴于術(shù)后當(dāng)日拔除氣管插管，存活并維持供體心臟功能持續(xù)20 d，期間受體猴一直處于束縛臥位，給予重癥監(jiān)護(hù)，最終因凝血功能紊亂死亡。

2.2 術(shù)后受體體征及臨床表現(xiàn)

2022年10月16日完成手術(shù)后，平均每0.5 h記錄一次體溫，并在次日早8∶00記錄前一日最高體溫，將每日最高體溫形成折線圖(圖1)，受體沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)極低體溫(低于36.0 ℃)或者極高體溫(超過(guò)38.5 ℃)，即使體溫超過(guò)38.0 ℃也在一般物理降溫后當(dāng)日恢復(fù)正常，從體溫來(lái)看未見(jiàn)受體出現(xiàn)明顯感染癥狀。受體于術(shù)后第6～8日出現(xiàn)偏黃色痰液，經(jīng)過(guò)加強(qiáng)肺部護(hù)理和吸痰護(hù)理后，癥狀有所改善。

圖1 術(shù)后受體體溫隨時(shí)間變化曲線圖

2.3 術(shù)后受體血細(xì)胞分析和血清學(xué)指標(biāo)

受體每日進(jìn)行血細(xì)胞分析和血清炎性因子的濃度檢查來(lái)初步評(píng)估是否存在感染。如圖2所示，受體白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞波動(dòng)明顯，但并未發(fā)生極度升高的情況，其中10月29日(術(shù)后第13日)全系升高最明顯，可能由于前一日受體接受了異體猴全血輸注的原因。同時(shí)，因?yàn)槭荏w早期發(fā)生凝血功能紊亂，失血情況較為明顯，通過(guò)血細(xì)胞分析可能無(wú)法準(zhǔn)確判斷感染的情況。因此進(jìn)一步分析了受體每日血清炎性因子水平變化(圖3)，受體C-反應(yīng)蛋白和降鈣素原在術(shù)后均處于極低水平，未提示感染的發(fā)生。

圖2 術(shù)后受體白細(xì)胞計(jì)數(shù)(A)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(B)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(C)隨時(shí)間變化曲線圖

圖3 術(shù)后受體C反應(yīng)蛋白(A)和降鈣素原(B)的血清濃度隨時(shí)間變化曲線圖

2.4 術(shù)后受體胸部X射線檢查

受體從術(shù)后第4日開(kāi)始每天進(jìn)行一次床旁胸部X射線檢查，結(jié)果如圖4所示，10月25日(術(shù)后第9日)胸片顯示右肺中下部斑片狀高密度影，我們加強(qiáng)肺部護(hù)理，對(duì)受體進(jìn)行霧化、祛痰、間歇吸痰等治療。術(shù)后第10日胸片顯示肺部高密度影減少。而術(shù)后第12日和第13日胸片顯示右側(cè)中部肺野大片斑片狀高密度影，經(jīng)加強(qiáng)肺部護(hù)理和治療至術(shù)后第20日，受體的胸片未見(jiàn)明顯的感染征象。

圖4 術(shù)后受體胸部X射線圖片匯總

2.5 術(shù)后受體血液及分泌物細(xì)菌培養(yǎng)

當(dāng)出現(xiàn)可疑感染征象(肺部斑片狀陰影、黃色痰液、體溫超過(guò)38 ℃)時(shí)，醫(yī)護(hù)人員會(huì)對(duì)受體的血液、痰液、口腔分泌物、腹水、引流液、胃液等進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢查。在10月30日返回的化驗(yàn)結(jié)果中顯示，10月28日(術(shù)后第12日)采集的腹腔引流液、10月29日(術(shù)后第13日)采集的胃液、10月30日(術(shù)后第14日)采集的口腔分泌物和腹水中均培養(yǎng)出了溶血葡萄球菌，提示存在細(xì)菌感染的證據(jù)，但感染原發(fā)灶未知。

2.6 術(shù)后受體抗感染藥物調(diào)整過(guò)程

本次圍術(shù)期預(yù)防用抗生素選擇頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉，術(shù)前30 min給藥。術(shù)后抗病毒藥物選擇更昔洛韋，每2 d給藥1次，每次給藥12.5 mg?？股匾廊皇褂妙^孢哌酮鈉舒巴坦鈉，術(shù)后每8 h給藥1次，每次給藥0.5 g靜脈滴注。術(shù)后第6日出現(xiàn)黃色痰液后，由于未出現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果且頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉使用時(shí)間較長(zhǎng)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)更換為哌拉西林他唑巴坦，每8 h給藥1次，每次給藥1.5 g靜脈滴注。由于術(shù)后第9日和第11日肺部X射線檢查發(fā)現(xiàn)斑片狀陰影，為對(duì)抗可能出現(xiàn)的肺部感染和及時(shí)控制病情進(jìn)展，術(shù)后第11日將抗生素升級(jí)為注射用美羅培南，每8 h給藥1次，每次給藥0.1 g微量泵注射(3 h注射完畢)，并加用抗真菌藥物卡泊芬凈，每日1次，每次給藥25 mg微量泵注射(2 h注射完畢)。10月30日根據(jù)腹腔引流液細(xì)菌培養(yǎng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次受體感染的溶血葡萄球菌對(duì)利奈唑胺敏感，因此抗生素更換為利奈唑胺葡萄糖注射液，每12 h給藥1次，每次給藥0.1 g靜脈滴注，直至受體死亡。

3 討論

在異種移植實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中，醫(yī)生們往往關(guān)注的是受體術(shù)后感染情況，特別是跨物種病毒感染。首次進(jìn)行豬-人心臟移植后，在受者體內(nèi)檢測(cè)到豬巨細(xì)胞病毒的存在，證實(shí)了豬源病毒向宿主傳播的可能性[14]。在本研究中，我們主要關(guān)注大量使用免疫抑制劑相關(guān)的術(shù)后受體病原體感染情況。在可能感染的病原體種類(lèi)中，細(xì)菌感染一直是同種異體心臟移植后的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[15]，有必要采取措施預(yù)防和監(jiān)測(cè)圍手術(shù)期細(xì)菌感染的發(fā)生[16]。

由于免疫抑制和感染預(yù)防策略的不斷進(jìn)步，包括在移植前進(jìn)行傳染病篩查和采用抗菌素預(yù)防，心臟移植后患者細(xì)菌感染的發(fā)生率顯著下降[12]。革蘭陰性菌，如克雷伯氏菌和大腸桿菌，是最常見(jiàn)的感染病原體；其次是革蘭陽(yáng)性菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌[15-17]。一般來(lái)說(shuō)，異種移植后使用的免疫抑制劑的種類(lèi)和劑量明顯高于同種異體移植，受體術(shù)后細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)更大[6]。1996年，DAVIS等[18]進(jìn)行了異位豬-食蟹猴心臟異種移植，在4只受體動(dòng)物中，有2只因全身感染而死亡。具體而言，一只食蟹猴的血液培養(yǎng)結(jié)果顯示革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性菌血癥，而另一只食蟹猴的血液培養(yǎng)結(jié)果提示存在播散性巨細(xì)胞病毒感染，并伴有嚴(yán)重的巨細(xì)胞病毒肺炎。隨后不久，有研究團(tuán)隊(duì)將轉(zhuǎn)基因豬的心臟原位移植到狒狒受體中，結(jié)果顯示，10只狒狒中有2只出現(xiàn)嚴(yán)重的術(shù)后感染并發(fā)癥(肺炎和全血細(xì)胞減少癥)，最終導(dǎo)致死亡[19]。2006年，BYRNE等[20]進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因豬-狒狒的腹部異位心臟移植研究。他們發(fā)現(xiàn)，隨著免疫抑制劑種類(lèi)和劑量的增加，感染并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)也增加。在接受移植的63只狒狒中，有16只因敗血癥死亡，其中一半的敗血癥是由細(xì)菌引起的。后來(lái)，隨著術(shù)后監(jiān)測(cè)手段的改進(jìn)以及抗生素研發(fā)的進(jìn)步，術(shù)后感染變得更加可控[21]。在本研究中，我們對(duì)術(shù)后感染相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第14日，受體的引流液、胃液、口腔分泌物和腹腔積液中都培養(yǎng)出了相同的細(xì)菌——溶血葡萄球菌，這表明受體發(fā)生了系統(tǒng)性感染。

溶血葡萄球菌發(fā)生侵襲性感染主要引起化膿性炎癥。葡萄球菌可通過(guò)多種途徑侵入機(jī)體，導(dǎo)致皮膚或器官的多種感染，甚至感染敗血癥[22]。但是在本研究中，受體血液中并沒(méi)有培養(yǎng)出溶血葡萄球菌，而且直到受體死亡也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的感染癥狀。因此我們認(rèn)為，雖然移植術(shù)后明確發(fā)生了細(xì)菌感染，但細(xì)菌感染并不是主要致死原因，但其是否推動(dòng)了受體整體情況惡化需要進(jìn)一步研究。近年來(lái)異種心臟移植術(shù)后最明顯、最嚴(yán)重的感染并發(fā)癥是2015年的一項(xiàng)研究，7只狒狒中有4只出現(xiàn)感染相關(guān)并發(fā)癥，其中包括由腸道糞便菌群引起的菌血癥、肺炎和感染性腹膜炎，以及1例巨細(xì)胞病毒引起的肺炎。此外，研究表明使用抗CD20單抗不僅不能提高生存率，還會(huì)顯著增加感染風(fēng)險(xiǎn)[23]，但是為了抑制免疫排斥反應(yīng)，目前抗CD20單抗幾乎是在異種移植過(guò)程中必須使用的藥物。非全身性細(xì)菌感染也可能導(dǎo)致致命的結(jié)果。在一項(xiàng)研究中，心臟異種移植受體發(fā)生由大腸桿菌引起的縱隔炎，嚴(yán)重影響受體壽命[24]。這些結(jié)果提示我們，無(wú)論術(shù)后細(xì)菌感染病情是否可控，我們?nèi)砸e極預(yù)防并遏制其發(fā)生。

本研究中，我們從多方面對(duì)受體感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如胸部放射檢查、血細(xì)胞分析、血清炎性因子等，但是都存在特異性不足的問(wèn)題。胸片檢查的確出現(xiàn)了肺部炎癥的征象，但是也可能是因?yàn)樾呐K功能差或者長(zhǎng)時(shí)間臥床出現(xiàn)的肺水腫或滲出；血細(xì)胞分析容易受到失血、輸血的影響；血清炎癥因子在一定程度上能夠反映感染的發(fā)生，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)C-反應(yīng)蛋白和降鈣素原在一定程度上可以用來(lái)診斷感染的發(fā)生，并且與感染的預(yù)后存在極大的相關(guān)性[25-26]。然而需要注意的是，手術(shù)或異種移植本身所引起的全身性應(yīng)激可能也是導(dǎo)致炎癥因子升高的原因之一。在本研究中，我們觀察到移植術(shù)后受體的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和炎性因子沒(méi)有明顯升高的情況。此外肺部不良征象也通過(guò)加強(qiáng)肺部護(hù)理、實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和積極的治療策略調(diào)整得到控制和逆轉(zhuǎn)。

本中心從研究結(jié)果中總結(jié)了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，并制定了下一步實(shí)驗(yàn)的感控規(guī)劃：首先，與專(zhuān)業(yè)生物檢測(cè)機(jī)構(gòu)合作，對(duì)供體豬和受體猴進(jìn)行術(shù)前病毒、細(xì)菌檢測(cè)及圍術(shù)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；其次，制定參與基因編輯豬-猴異種移植的工作人員防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)對(duì)暴露事件后的緊急處理預(yù)案，以及建立科學(xué)且周密的圍術(shù)期感染控制標(biāo)準(zhǔn)和可執(zhí)行性強(qiáng)的感染控制管理措施，包括抗生素的使用；最后，定時(shí)對(duì)受體猴的血液、體液、分泌物及各種管道、物體表面、工作人員手、空氣進(jìn)行監(jiān)測(cè)和培養(yǎng)。異種心臟移植圍術(shù)期積極預(yù)防和控制感染是器官移植手術(shù)的重要環(huán)節(jié)之一，通過(guò)制定科學(xué)、周密的感染控制標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施集束化規(guī)范化感控管理措施，制定參與異種移植工作人員防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)與發(fā)生暴露后的緊急處置預(yù)案，為今后開(kāi)展異種心臟移植臨床試驗(yàn)提供依據(jù)和借鑒。