畢 正，魯云霞，張銀玉，李金菊，周 恒，呂溪娟，方朝暉

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230012；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230031；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230031）

糖尿病流行病學(xué)調(diào)查研究[1]顯示，我國糖尿病患者已超過1.5 億人。糖尿病群體的不斷擴(kuò)大給疾病的防治帶來新的挑戰(zhàn)與要求。糖尿病患者中90%以上的患者都是2 型糖尿病[2]，而2 型糖尿病的病因極為復(fù)雜并且受多種因素的影響，其中長期過量進(jìn)食引起的肥胖是2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[3]。

丹蛭降糖膠囊（Danzhi Jiangtang Capsule，DJC）是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的一款院內(nèi)制劑，用于2 型糖尿病患者的治療已有30 年歷史。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丹蛭降糖膠囊能夠改善糖尿病患者的多食行為，具有降低體質(zhì)量，調(diào)節(jié)血脂，降低BMI 指數(shù)等功效[4-6]。db/db 小鼠是是瘦素受體基因（Obese Gene Receptor，OB-R）純合突變小鼠，具有“體質(zhì)量快速增長，活動量少，高血脂，高血糖，高血壓及肥胖等特點(diǎn)”，是模擬肥胖型2 型糖尿病的高保真動物模型[7]。本研究旨在觀察丹蛭降糖膠囊對db/db 小鼠體質(zhì)量及攝食量的干預(yù)作用及對下丘腦攝食中樞關(guān)鍵因子的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物均購自江蘇集萃藥康集團(tuán)，分別購入SPF 級雄性db/db 小鼠18 只及SPF 級雄性db/dm 小鼠9 只，周齡均為5 周，db/db 小鼠體質(zhì)量在30 ～35 g 之間，db/dm 小鼠體質(zhì)量在15 ～20 g 之間。動物到達(dá)后飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)中心動物房SPF 級動物房層流架，飼養(yǎng)環(huán)境維持12 h 晝夜交替，溫度為（22±2）℃，濕度為50%～55%，動物自由攝食飲水，普通飼料喂養(yǎng)，均使用刨花墊料。本研究已通過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批（倫理號：LLSC20200932）。

我國是農(nóng)業(yè)大國，對農(nóng)機(jī)設(shè)備有很高的要求。隨著農(nóng)機(jī)總量的不斷擴(kuò)大，新的農(nóng)機(jī)裝備也在不斷涌現(xiàn)，導(dǎo)致我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式逐漸由人畜生產(chǎn)力向機(jī)械生產(chǎn)力轉(zhuǎn)移，基本上擺脫了幾千年的勞動力作業(yè)形式，但是，這樣勢必會給整個農(nóng)機(jī)安全監(jiān)理帶來巨大的壓力和挑戰(zhàn)。

1.2 試劑與耗材

血糖儀、 血糖試紙（Roche； 國械注進(jìn)20142404948、國械注進(jìn)20162402313）； Rabbit-Anti-AgRP Antibody（Abcam；ab254558）、Rabbit-Anti-α-MSH antibody （Bioss；bs-1848R）； 小 鼠α-MSH ELISA 試劑盒、小鼠AgRP ELISA 試劑盒、（晶美生物技術(shù)有限公司；96T；JM-12489M1、JM-13042M1）；免疫組化二步法試劑盒（中杉金橋；PV6000）；SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Servicebio；G3337-100）；EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司；B618583]；2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal；RK21203），qRT-PCR 儀（ABI；StepOne Plus）。

2 實驗方法

2.1 入組及飼養(yǎng)

見表5。

見圖2、表4。

2.2 檢測方案

然而，目前的文獻(xiàn)多是純粹的飛行器或無人潛艇的路徑規(guī)劃問題，缺乏對信息采集結(jié)合路徑規(guī)劃的研究。飛行器上搭載信息采集設(shè)備不僅需要飛行器在飛行過程中規(guī)避障礙物，還需要確保信息采集設(shè)備能夠采集到相應(yīng)的數(shù)據(jù)信息。

2.3 麻醉及采血

飼養(yǎng)結(jié)束后在無菌環(huán)境下使用0.3%戊巴比妥鈉0.1 ～0.2 mL·10 g-1腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰臥位固定小鼠四肢，常規(guī)消毒后經(jīng)腹中線開腹并開胸，使用1 mL 注射器經(jīng)右心室直刺入3 mm 見針管回血停止進(jìn)針，緩慢抽取血液，取血完畢經(jīng)無菌EP 離心管壁緩慢注入并室溫靜止1 h，后放入離心機(jī)經(jīng)3 500 rpm·5 min-1分離血清，新管-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

見表6。

2.4 樣本采集

小鼠采血完畢，分離頭頸，剝離頭皮，使用彎頭眼科剪插入頭骨前囟1 ～2 mm，鈍性分離頭骨，取出完整腦組織，石蠟包埋樣本放入10%甲醛固定液，第2 天換液固定1 周，取出腦組織修塊后脫水包埋下丘腦部分；其余小鼠腦組織使用凍存管保存與液氮過夜，第2 天放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Xiao課題組設(shè)計合成了一種雙光子汞離子探針SPF-TSA(見圖5)。在加入一定濃度的汞離子后，縮硫醛與汞離子作用轉(zhuǎn)化成醛基，在DMSO∶水=1∶1的溶液中，其檢測限為28 nmol/L。在800 nm波長的雙光子激發(fā)下，探針的雙光子截面為248 GM，探針與汞離子反應(yīng)之后，雙光子截面為686 GM，說明探針與汞離子作用后，具有較好的雙光子性能，將該探針成功應(yīng)用于雙光子細(xì)胞成像。

2.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.5.1 HE 染色 蠟塊切片3 μm，常規(guī)脫水后入蘇木素染30 s，流水沖洗10 min 反藍(lán)，再入伊紅10 s后烘干，中性樹脂封片烘干后光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

見表2。

2.5.2 免疫組化 蠟塊切片3 μm，常規(guī)脫水后入檸檬酸鹽緩沖液，放入微波爐高火10 min，冷卻5 min，再高火3 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，根據(jù)組化試劑盒說明書進(jìn)行，一抗（α-MSH 1:250、AgRP 1:100）4℃過夜，最后用DAB 顯色10 min，自來水沖洗后烘干，中性樹脂封片。選取3 塊不同區(qū)域，以平均光密度AOD 作比較，AOD = IOD/Area。數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后4 位。

2.5.3 qRT-PCR 提取RNA 后使用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到樣本cDNA，然后使用試劑盒配制反應(yīng)物，詳細(xì)操作按照說明書進(jìn)行。qRT-PRC 反應(yīng)程序為預(yù)變性95 ℃3 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s 循環(huán)反應(yīng)，次數(shù)為40 次，熔解曲線由機(jī)器自設(shè)。以Actin 為內(nèi)參。2-△△CT為結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5.4 ELISA 具體方法按照說明書進(jìn)行，檢測血清α-MSH、AgRP 含量，剝離凍存腦組織下丘腦后使用電子天平稱重，稱量同質(zhì)量組織檢測下丘腦α-MSH、AgRP蛋白濃度，血清及腦組織樣本稀釋倍數(shù)均為5倍。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異使用單因素方差分析進(jìn)行檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)可視化采用GraphPad Prism 8 處理，組化定量使用Imgae J 處理。

每日測量每籠盒所剩飼料，以1 周為記錄點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計。每周對每只小鼠的體質(zhì)量測量1 次。

3 結(jié)果

3.1 各組體質(zhì)量周變化情況比較

為了促進(jìn)喂養(yǎng)工作的科學(xué)合理化，在實際執(zhí)行中，要按照一定標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)飼料，保證定時、定量和定位、定質(zhì)，按照具體的營養(yǎng)需求科學(xué)配料，以促進(jìn)飼料利用效率的提升。還要保證飼料養(yǎng)殖人員技術(shù)水平的提升，避免飼料浪費(fèi)?？茖W(xué)喂養(yǎng)在能夠降低生產(chǎn)成本的條件下，為實際的養(yǎng)殖工作提供更高的發(fā)展效益。

表2 各組體質(zhì)量周變化情況比較（±s ，n = 9） g

表2 各組體質(zhì)量周變化情況比較（±s ，n = 9） g

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周齡db/dm 組db/db 組DJC 組619.83±0.6533.03±1.03###32.49±1.05 721.16±1.3837.29±1.32###36.26±1.07 821.74±1.4539.80±2.85###37.31±1.81△922.41±1.9742.29±3.36###38.10±1.67△△1022.86±1.7943.80±4.84###39.31±2.38△△1123.29±1.7845.78±6.72###38.80±3.22△△1224.03±2.1347.58±7.80###38.58±3.94△△1324.44±1.9950.54±10.04###36.96±5.02△△△1425.33±1.9852.00±11.32###35.54±6.10△△△1525.90±1.5254.02±12.85###35.36±6.57△△△1626.53±2.0155.57±14.00###34.76±5.74△△△1726.69±1.8656.87±14.19###34.76±5.52△△△1826.99±1.6158.13±14.65###34.70±5.84△△△

3.2 各組攝食量周變化情況比較

見表3。

表3 各組攝食量周變化情況比較（±s ，n = 3） g

表3 各組攝食量周變化情況比較（±s ，n = 3） g

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

周齡db/dm 組db/db 組DJC 組756.70±1.40112.70±6.13### 98.33±4.83△△868.00±1.81125.23±2.00### 107.37±11.82△971.23±1.90126.03±6.38### 99.33±5.53△△1074.00±1.30125.10±11.98### 101.43±6.60△1175.43±1.95125.33±8.40### 95.73±9.33△△1273.90±3.60115.63±6.61### 92.30±3.22△△1375.97±2.08124.70±3.40### 96.03±2.37△△△1474.83±2.50119.03±6.99### 102.83±2.87△△△1573.73±0.85119.60±2.05### 96.73±4.78△△△1671.03±1.81121.13±1.50### 96.97±1.14△△△1772.37±1.51125.23±2.29### 97.40±1.59△△△1871.67±1.27117.83±6.02### 95.03±1.48△△△

3.3 各組病理形態(tài)學(xué)變化情況比較

HE 染色顯示，db/dm 組下丘腦病理改變不明顯，細(xì)胞形態(tài)完整，間質(zhì)血管無明顯充血及出血現(xiàn)象；db/db 組可見大量細(xì)胞核深染、固縮且空泡化嚴(yán)重，膠質(zhì)細(xì)胞增生侵蝕；DJC 組較db/db 組病理改變減輕，可見少量細(xì)胞核深染，少量空泡變性。見圖1。

圖1 各組病理形態(tài)學(xué)顯微圖（HE 染色，400x）

3.4 各組免疫組化及定量比較

除此以外，未來，貨幣政策仍需繼續(xù)發(fā)力。業(yè)內(nèi)人士表示，從央行三季度貨幣政策執(zhí)行報告以及各方數(shù)據(jù)來看，市場流動性相對充裕，但金融機(jī)構(gòu)的風(fēng)險偏好仍偏低，放貸意愿不足，繼續(xù)穩(wěn)定融資、疏通貨幣政策傳導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)并將持續(xù)成為下一步政策的重點(diǎn)。宋清輝認(rèn)為，未來貨幣政策應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注小微企業(yè)和“三農(nóng)”領(lǐng)域等，并通過實施定向降準(zhǔn)政策，保持流動性合理充裕。同時，貨幣政策方向應(yīng)該朝民營企業(yè)傾斜，消除“梗阻”同時刺激金融市場對于民企的支持力度。

圖2 各組免疫組化及定量圖（400x）

表4 免疫組化定量數(shù)據(jù)（±s，n = 3）

表4 免疫組化定量數(shù)據(jù)（±s，n = 3）

注：與db/dm 組比較，## P ＜0.01；與db/db 組比較，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001

項目db/dm 組db/db 組DJC 組α-MSH0.100 2±0.006 20.022 9±0.013 4##0.145 1±0.020 2△△△AgRP0.033 4±0.004 80.048 3±0.000 7##0.035 3±0.002 4△△

3.5 qRT-PCR

小鼠到達(dá)后經(jīng)無菌通道進(jìn)入SPF動物房檢疫室，經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至小鼠專用飼養(yǎng)室層流架。轉(zhuǎn)入層流架后禁食6 h 候采取尾尖采血快速檢測血糖，db/db 小鼠空腹血糖≥11.1 mmol·L-1時分入db/db 組及DJC 組，db/dm 組全部入組并檢測空腹血糖以作對照。DJC 組按體表面積計算每只灌胃630 mg·kg-1·d-1[8]，db/db 組及db/dm 組按同質(zhì)量每日灌胃純凈水。按種屬隨機(jī)分入飼養(yǎng)籠盒，每籠3 只小鼠。飼養(yǎng)周期為12 周。

表5 各組mRNA 相對表達(dá)量數(shù)據(jù)（±s ，n = 8）

表5 各組mRNA 相對表達(dá)量數(shù)據(jù)（±s ，n = 8）

注： 與db/dm 組比較，### P ＜0.001； 與db/db 組比較，△△△P ＜0.001

項目db/dm 組db/db 組DJC 組α-MSH 1.00±0.310.26±0.08###0.60±0.15△△△AgRP1.01±0.252.87±0.70###1.42±0.41△△△

3.6 ELISA

基于增加資源數(shù)量，提高資源質(zhì)量，改善資源功能的邏輯，推動礦業(yè)供給側(cè)改革。由煤、鐵等大宗礦產(chǎn)的開采向稀土、鎢、鋰等新興戰(zhàn)略性、高技術(shù)礦產(chǎn)資源開采轉(zhuǎn)變，將共伴生稀土礦、鎢礦等納入總量控制指標(biāo)管理。推動非煤能源如天然氣、地?zé)帷㈨搸r氣、煤層氣等相對環(huán)保型資源的開發(fā)使用，優(yōu)化資源使用結(jié)構(gòu)。

表6 Elisa 檢測定量數(shù)據(jù)（±s ）

表6 Elisa 檢測定量數(shù)據(jù)（±s ）

注：與db/dm 組比較，### P ＜0.001；與db/db 組比較，△△△P ＜0.001

項目例數(shù)db/dm 組db/db 組DJC 組血清α-MSH/（μg·L-1）9 8.33±0.35 6.37±0.17### 7.40±0.22△△△血清AgRP/（pg·mL-1）9108.67±4.60182.84±10.39###141.41±8.46△△△下丘腦α-MSH/（μg·L-1）8 8.11±0.36 5.85±0.34### 6.98±0.16△△△下丘腦AgRP/（pg·mL-1）8100.75±4.94175.68±8.27###137.96±7.14△△△

4 討論

在過去30 年里，全球糖尿病患者人數(shù)近乎增長了2 倍之多，因糖尿病引起的各種并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡，也排在人類死亡因素的第9 名[2]。我國糖尿病人群的患病率連年攀升，近年的數(shù)據(jù)顯示我國糖尿病的患病人群已超過1.5 億人[1]。這不但給患者及患者家屬帶來巨大經(jīng)濟(jì)及生活負(fù)擔(dān)，也使得我國衛(wèi)生健康防治壓力急劇增高。

糖尿病作為一種患病率居高不下的疾病，自古以來便被多種書籍所記載?！端貑枴て娌≌摗酚涊d：“帝曰：有病口甘者，病名為何？何以得之？岐伯曰：此五氣之溢也，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也。此人必數(shù)食甘美而多肥，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。”此記述詳細(xì)描繪了多食導(dǎo)致肥胖，而肥胖又引起脾癉，進(jìn)而發(fā)展為消渴的過程[9]。即不節(jié)制的飲食會引起人體肥胖，而肥胖會導(dǎo)致現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的糖尿病前期，進(jìn)而會發(fā)展為糖尿病。

中醫(yī)學(xué)將食欲亢進(jìn)的病位定于胃，而又與心、肝、脾等臟器相關(guān)[10]。DJC 包含太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭六種中藥顆粒。藥理學(xué)研究表明，澤瀉能夠促進(jìn)胰島素受體底物1（Insulin Receptor Substrate-1，IRS-1）磷酸化，形成磷酸化的胰島素受體底物1（phospho-IRS1，p-IRS1），從而降低血糖，減輕胰島素抵抗[11]，同時，澤瀉能夠通過削弱游離脂肪酸的作用，從而減少肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油和總膽固醇的沉積[12]，預(yù)防肥胖；太子參能夠通過改善2 型糖尿病患者HIF-1α 及SIRT1 的表達(dá)，從而減輕胰島素抵抗，減少脂肪沉積，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖及血脂的作用[13]；地黃所含地黃低聚糖能夠降低db/db小鼠體內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖[14]，抑制肝糖異生，減少三酰甘油的生成[15]；菟絲子能夠經(jīng)JAK-STAT 通路調(diào)節(jié)機(jī)體的糖脂代謝，降低胰島素敏感性[16-17]；水蛭能夠通過抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)as）等脂肪合成相關(guān)酶發(fā)揮作用，從而減少膽固醇和脂肪酸的合成，降低血脂[18]。

肥胖的本質(zhì)是能量攝入與消耗之間的失衡[19]，過多的食物進(jìn)入腸道后被分解為葡萄糖，以肝糖原的形式進(jìn)行存儲，糖酵解生成的磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化形成甘油，糖氧化分解生成的乙酰CoA 合成脂肪酸，進(jìn)而形成脂肪存儲于全身[20]。攝食行為的控制中樞位于下丘腦弓狀核（Arcuate nucleus，ARC），該區(qū)域主要含有能夠增強(qiáng)食欲的神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NP-Y）和刺鼠相關(guān)肽（Agouti-related peptide，AgRP）以及抑制食欲的促阿片-黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）[21]。其中AgRP與POMC 是一對相互拮抗的神經(jīng)元物質(zhì)，分別發(fā)揮著促進(jìn)食欲和抑制食欲的作用[22]。脂肪細(xì)胞來源的瘦素（Leptin）與其長亞型瘦素受體[23]（leptin receptor long isoform， LepRb）結(jié)合后激活Janus 激酶 2（Janus Kinase 2，JAK2），形成磷酸化的Janus激酶 2（phospho-JAK2，p-JAK2），p-JAK2 又進(jìn)一步激活STAT3，STAT3 的激活會使得IRS-1 磷酸化為p-IRS1，最終抑制刺激食欲的POMC 及其衍生物α-MSH 的生成并刺激增強(qiáng)食欲AgRP 的生成[24]。

例19中作者將“一帶一路”受到歐洲各國的歡迎預(yù)設(shè)為既成事實，從而關(guān)閉了對話空間。從上下文看，例20中的“indeed”既強(qiáng)調(diào)了事實本身又透露出一種驚訝和嘲諷的態(tài)度。

db/db 小鼠作為一種leptin-R 缺失動物模型，能夠在高保真情況下模擬肥胖癥、2 型糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。STAT3 通路作為經(jīng)典的瘦素通路，上游靶點(diǎn)leptin-R 的缺失導(dǎo)致瘦素?zé)o法與受體結(jié)合，進(jìn)而影響下游通路的激活，最終使得STAT3 無法促進(jìn)POMC 的分泌，進(jìn)而POMC 衍生物α-MSH 的生成無法得到保證，同時也無法抑制AgRP 的分泌，形成了過多的AgRP，最終導(dǎo)致食欲的增高，并發(fā)生瘦素/胰島素抵抗[25-26]。

課題組前期已經(jīng)在GK 大鼠模型上證明DJC 能夠提高胰島素受體底物IRS1 的表達(dá)[27]，也能夠提高SD 大鼠STAT3 的表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化[28]。本研究證實了DJC 能夠促進(jìn)下丘腦α-MSH 的分泌并抑制下丘腦AgRP 的分泌；也證實了db/db 小鼠相較其野生同型對照db/dm 小鼠，下丘腦存在更多的AgRP 蛋白且存在更少的α-MSH 蛋白，而這種趨勢被DJC 所改善；同時，在mRNA 層面也觀察到了相同的趨勢，即db/db 小鼠較db/dm 小鼠含有更多的AgRP mRNA，更少的α-MSH mRNA，這種趨勢同樣被DJC 所改善；使用免疫組化方法進(jìn)行的相關(guān)抗原定量得到了相同結(jié)果。以上這些結(jié)果與db/dm 組、db/db 組及DJC 組所表現(xiàn)出的體重趨勢，進(jìn)食趨勢相符合。由此，我們認(rèn)為DJC 能夠通過促進(jìn)α-MSH的表達(dá)并抑制AgRP 的表達(dá)來改善小鼠進(jìn)食行為，減輕體質(zhì)量，從而改善小鼠的肥胖狀態(tài)，進(jìn)而降低糖尿病的發(fā)生風(fēng)險。