韓丹陽(yáng)，王晨莉，時(shí)美伶，蘇兆鐸，杜寶珍

（北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京 100075）

天然來(lái)源的多糖類藥物在發(fā)揮抗腫瘤效果的同時(shí)，表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性或無(wú)細(xì)胞毒性的顯著優(yōu)勢(shì)[1]。研究[2]已經(jīng)表明，多糖類藥物能夠通過(guò)激活巨噬細(xì)胞和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。提示多糖可能具有免疫保護(hù)的能力。亮菌口服液（Armillariella oral solution，AOS）作為擁有完全知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中成藥，亮菌多糖是其核心成份，臨床上被用于改善慢性胃炎、腸炎的臨床癥狀和體征[3]、放化療引起的白細(xì)胞減少[4]和結(jié)直腸癌的抗腫瘤治療[5]。尤其Cheng HR 等報(bào)道，亮菌多糖中的β-1，6-葡聚糖，即AAMP-A70，能激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并將促瘤的M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抑瘤的M1 型巨噬細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。此外亮菌多糖還具有更高的利用率、更低的生產(chǎn)成本和更高的回收率，有利于在工業(yè)規(guī)模上的擴(kuò)大生產(chǎn)。然而，亮菌多糖能否對(duì)結(jié)腸癌、黑色素瘤和肉瘤等惡性腫瘤是否有保護(hù)作尚未有報(bào)道。本研究分別從離體（采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116 細(xì)胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10 細(xì)胞）和在體（構(gòu)建肉瘤荷瘤小鼠）兩個(gè)層面，檢測(cè)亮菌多糖的對(duì)結(jié)腸癌/黑色素瘤腫瘤細(xì)胞的毒性、抗增殖活性和對(duì)肉瘤荷瘤小鼠外周血的血小板計(jì)數(shù)、總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分型計(jì)數(shù)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和尿素水平（UREA）的含量以及肝、腎、脾的組織病理學(xué)的影響。以期為亮菌口服液療效的開(kāi)發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6 ～8 周齡Balb/c 雌性小鼠24 只，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組）、低劑量組（亮菌多糖25 mg·kg-1）和高劑量組（亮菌多糖50 mg·kg-1）。小鼠平均體質(zhì)量（28±2）g，購(gòu)自北京維通利華公司[合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0001]。飼養(yǎng)溫度26 ～28℃，光照12 h，均自由采食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究符合倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：20210503096），并遵循了有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定[7]。

1.2 試劑及儀器

亮菌口服溶液，購(gòu)自四川先通藥業(yè)有限責(zé)任公司（口服，1 次10 ～20 mL，每日3 次，國(guó)家準(zhǔn)字號(hào)：H51023188，規(guī)格：10 mL，無(wú)糖型）。氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、半胱氨酸、木瓜蛋白酶、TRISHCl、EDTA （pH 7.4）、MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2-甲基）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116 細(xì)胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，酶標(biāo)儀（Biotek H1，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Leica DM4 B&DM6 B，德國(guó)），恒溫震蕩培養(yǎng)箱（SL- 222，SOLAB，巴西），高效液相色譜（島津，京都株式會(huì)社，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亮菌多糖的提取及結(jié)構(gòu)鑒定[8]取15 mL 亮菌口服液加入丙酮中，4℃下充分混合24 h。將析出物在60℃下干燥成干亮菌粉，懸浮析出物加入提取緩沖液（0.1 M 氫氧化鈉，5.0 mM 乙二胺四乙酸和5.0 mM 半胱氨酸，1.0 g 木瓜蛋白酶，pH 6.0）中，并在60℃下以200 rpm 攪拌孵育12 h。然后將培養(yǎng)混合物離心（2 500 g，室溫下20 min），并保存上清液。將殘余物重新懸浮在相同的提取緩沖液中，利用DMB 在 A525 條件下的異染特性進(jìn)行查驗(yàn)，直到上清液中沒(méi)有亮菌多糖為止。將對(duì)異染特性敏感的上清液合并，稱之為粗制物，并在乙醇存在下沉淀亮菌多糖（最終濃度分別為9%、23%、45%和75%）。將每種沉淀的多糖透析、冷凍干燥并在-20℃下儲(chǔ)存。在這些步驟后獲得約0.26 g（干重）的總粗多糖和0.19 g F9（產(chǎn)率分別為1.7%和1.3%），使用以下等式計(jì)算：產(chǎn)率（m/m，%）=總粗多糖重量（g） / 干亮菌粉重量（g）×100%。此外，F(xiàn)9 中存在的硫酸化多糖的含量為2.9%，使用以下等式計(jì)算：亮菌多糖的產(chǎn)率（%）=硫酸化多糖的生化劑量（g）/干亮菌粉的重量（g）×100%。

1.3.2 亮菌多糖的純化 將乙醇條件下沉淀的亮菌多糖溶解在5 mL 20 mM TRIS-HCl 和50 mM EDTA（pH 7.4）混合的緩沖液中，然后通過(guò)上述溶液平衡的DEAE-纖維素柱（10.0 cm×2.0 cm）純化，并用50 mL 上述緩沖液洗滌。柱的流速為0.5 m·min-1。收集1.0 mL 樣品后用DMB 和電導(dǎo)率異染分析法測(cè)定亮菌多糖。在平衡、洗脫、收集和餾分檢查相同的條件下，將DEAE-纖維素（亮菌多糖）獲得的峰應(yīng)用于高效液相色譜。

1.3.3 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT 116 細(xì)胞和鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10 細(xì)胞檢測(cè)亮菌多糖的細(xì)胞毒性。HCT 116 細(xì)胞在裝有RPMI-1640 培養(yǎng)基的塑料燒瓶中生長(zhǎng)，含有10%胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 g·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素，并在37℃和5% CO2條件下孵育。注射肉瘤細(xì)胞到小鼠的腹膜腔中以進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤檢測(cè)。從供體動(dòng)物的腹腔收集腹水，并制備含有5 mL乳酸林格氏液、0.2 mL 慶大霉素（5 mg·mL-1）和0.5 mL 腹水的懸浮液。受體動(dòng)物腹腔接種2×106cells/0.5 mL。該過(guò)程每10 d 進(jìn)行1 次。

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞毒性 通過(guò)MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2-甲基）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。HCT116 和B16-F10 細(xì)胞以每孔4×104的密度接種在96 孔板上，培養(yǎng)基為200 μL。加入亮菌多糖的濃度分別為10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和250 μg·mL-1。 以二甲基亞砜（DMSO，0.05%）為陰性對(duì)照，以抗腫瘤化合物阿霉素（0.016 ～50 μM）為陽(yáng)性對(duì)照。處理后，將培養(yǎng)基重新放入含有MTT 溶液（0.5 mg·mL-1）的新鮮培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)3 h。然后，取出MTT 溶液，將平板在35℃條件下干燥30 min。將甲瓚產(chǎn)物溶解在150 μL 二甲基亞砜中，在570 nm 讀取吸光度。使用GraphPad Prism 6.1 軟件，通過(guò)非線性回歸的算法將標(biāo)準(zhǔn)化吸光度數(shù)值轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)抑制百分比，計(jì)算抑制濃度均值（IC50）及其95%置信區(qū)間（CI 95%）。

1.3.5 肉瘤動(dòng)物模型構(gòu)建 將8 日齡肉瘤腹水腫瘤細(xì)胞稀釋在乳酸林格氏液中，經(jīng)皮下植入小鼠左腋窩（2×106cells/500 μL）。腫瘤移植后24 h，腹腔注射溶于鹽水或無(wú)菌鹽水的亮菌多糖（25 mg·kg-1或50 mg·kg-1）。腹腔注射7 d 后，從小鼠眼眶后叢收集外周血樣本。并對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，切除腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟，稱重并固定在10%甲醛中。腫瘤生長(zhǎng)抑制率由下式計(jì)算：抑制率（%）=[（A-B）/A]×100%，其中A 為陰性對(duì)照的腫瘤重量平均值，B 為治療組的腫瘤重量平均值。在腫瘤移植當(dāng)天和治療的最后1 d 測(cè)量體質(zhì)量。血樣用于血液和生化分析。

1.3.6 生化分析 血液2 500 rpm·min-1離心15 min后，對(duì)所獲得的血清樣品進(jìn)行生化分析。測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和尿素水平（UREA）的含量。

1.3.7 血液分析 每只小鼠取外周血500 μL 置于乙二胺四乙酸中，在光學(xué)顯微鏡下通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)手動(dòng)程序進(jìn)行各種血液學(xué)參數(shù)（血小板、總白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)）的記錄。

1.3.8 組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)分析 用甲醛固定后，大體檢查腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟的大小、顏色變化以及出血情況。然后，將腫瘤、肝、脾和腎切成5 μm 厚度的切片，對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木精和伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步2 組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亮菌多糖對(duì)離體條件下腫瘤細(xì)胞增殖的影響

在體外檢測(cè)亮菌多糖對(duì)結(jié)腸癌B16-F10 細(xì)胞和黑色素轉(zhuǎn)移瘤HCT116 細(xì)胞的抗增殖作用，不同濃度（10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和250 μg·mL-1）的硫酸化亮菌多糖均未發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，均未能顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)（P＞0. 05）。見(jiàn)圖1。

2.2 亮菌多糖對(duì)在體條件下腫瘤細(xì)胞增殖和器官重量的影響

在給予亮菌多糖治療后，小鼠肉瘤的生長(zhǎng)顯著延遲。對(duì)照組的肉瘤重量為（2.09±0.42）g，而劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖治療組的小鼠的肉瘤重量分別為（1.15±0.27）g 和（1.01±0.19）g。與對(duì)照相比，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制百分比分別為42.32%（P＜0.05）和51.26%（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。與對(duì)照組相比，亮菌多糖劑量依賴性地增加小鼠的相對(duì)脾臟重量，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1劑量的亮菌多糖分別誘導(dǎo)脾臟重量增加39.70%（P＜0.05）和70.51%（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。亮菌多糖處理后的小鼠腎臟重量與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2C。但亮菌多糖處理后小鼠肝臟重量與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（P＞0.05），見(jiàn)圖2D。

圖2 亮菌多糖對(duì)在體條件下腫瘤細(xì)胞增殖和器官重量的影響

2.3 亮菌多糖對(duì)荷瘤小鼠外周血和生化參數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖處理組外周血的血小板計(jì)數(shù)均顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖3A；而總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3B-E。與對(duì)照組相比，劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的亮菌多糖處理組的血漿尿素水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），但丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 亮菌多糖對(duì)小鼠外周血中血小板計(jì)數(shù)、總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的影響

圖4 亮菌多糖對(duì)小鼠的血漿尿素（UREA）水平和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平的影響

2.4 亮菌多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤、脾、肝和腎組織病理形態(tài)的影響

腫瘤的組織病理學(xué)分析顯示對(duì)照組和亮菌多糖治療組之間的荷瘤模式未見(jiàn)差異。各組均出現(xiàn)惡性腫瘤，并伴有強(qiáng)烈的細(xì)胞解體（圖5A-C）。各組腫瘤中伴有大量有絲分裂像、骨骼肌浸潤(rùn)和凝固性壞死。各組動(dòng)物脾臟的組織病理學(xué)分析顯示白髓增生、卵泡解體和巨核細(xì)胞的存在。劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠的脾臟均顯示出強(qiáng)烈的卵泡解體（圖5D-F）。各組的小鼠腎臟組織病理學(xué)分析顯示腎小球保存良好，并有輕度出血。劑量為25 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠腎臟呈現(xiàn)管狀上皮的小空泡化和壞死點(diǎn)，而劑量為50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠僅呈現(xiàn)管狀上皮的空泡化。各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞中度腫脹以及腎小球和腎小管出血（圖6D-F）。對(duì)小鼠肝臟的組織病理學(xué)評(píng)估顯示，各組均存在庫(kù)普弗細(xì)胞增生和細(xì)胞腫脹。對(duì)照組顯示肝細(xì)胞中度細(xì)胞腫脹。劑量為25 mg·kg-1和50 mg·kg-1亮菌多糖處理組小鼠肝臟均呈現(xiàn)局灶性炎性病灶和棕色色素沉積，提示上述劑量亮菌多糖處理都造成小鼠肝臟膽紅素的產(chǎn)生（圖6A-C）。

圖5 亮菌多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤和脾的影響

圖6 亮菌多糖對(duì)荷瘤小鼠腎臟和肝臟的影響

3 討論

CIUREA 等[9]報(bào)道，抗癌治療通常會(huì)伴發(fā)血小板減少癥，最終導(dǎo)致出血和死亡。本研究發(fā)現(xiàn)亮菌多糖治療會(huì)引起荷瘤小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)增加。這提示亮菌多糖在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，還能有效避免血小板減少癥的出現(xiàn)，進(jìn)而對(duì)腫瘤患者發(fā)揮保護(hù)作用。LIU 等[10]研究表明當(dāng)歸根多糖通過(guò)PI3K/AKT 途徑促進(jìn)小鼠造血和血小板生成。此外，荷瘤小鼠經(jīng)亮菌多糖處理后，沒(méi)有顯著的白細(xì)胞計(jì)數(shù)改變。而白細(xì)胞減少也是臨床使用的一些抗腫瘤藥物的常見(jiàn)副作用。

此外，通過(guò)對(duì)小鼠臟器的組織病理學(xué)和生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亮菌多糖處理的小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出生物學(xué)相關(guān)的肝或腎毒性。而RAMOS 等[11]報(bào)道，用松葉提取物處理后，荷瘤小鼠外周血的AST 水平增加2 ～3 倍，尤其是小鼠發(fā)生肝細(xì)胞空泡化和肝脂肪變性，雖然亮菌多糖處理的荷瘤小鼠血清AST 水平升高，但肝臟結(jié)構(gòu)未見(jiàn)顯著變化。而抗癌治療對(duì)健康組織毒性很大，過(guò)大的副作用會(huì)直接影響到療效。因此，亮菌多糖與化療的聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)改善化療的副作用。

本項(xiàng)研究中的所有小鼠都移植了腫瘤，也包括對(duì)照組，因此高劑量亮菌多糖對(duì)外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響與腫瘤的存在無(wú)關(guān)。先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)依賴于粒細(xì)胞穿過(guò)血管，髓樣細(xì)胞正是由于對(duì)腫瘤微環(huán)的境刺激十分敏感，才成為癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。所有降低腫瘤微環(huán)境的促瘤特征或激發(fā)免疫反應(yīng)是當(dāng)今主流的抑制腫瘤增殖的策略。在亮菌多糖處理的小鼠中觀察到的單核細(xì)胞數(shù)量減少以及腫瘤生長(zhǎng)延遲可能與單核細(xì)胞活化有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示高劑量亮菌多糖誘導(dǎo)有可能發(fā)揮宿主依賴性抗腫瘤作用。