王俊 綜述 陳亦棋 沈麗君 審校

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院眼科,杭州 310003;2浙江省人民醫(yī)院眼科,杭州 310014

視網(wǎng)膜退行性疾病,如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和以視網(wǎng)膜色素變性為代表的遺傳性視網(wǎng)膜疾病等,通常是由光感受器功能的障礙和喪失導(dǎo)致的[1]。盡管不同疾病之間光感受器受損的機(jī)制不同,但最終結(jié)局是相同的,即大量光感受器丟失,造成視力不可逆的損害[2]。目前,除了濕性AMD可以利用抗血管內(nèi)皮生長因子得到一定治療外,大多數(shù)視網(wǎng)膜退行性疾病還無法得到有效的控制。

光感受器移植是一種頗有前景的再生策略,旨在替換已丟失的光感受器,并重新與內(nèi)層視網(wǎng)膜剩余神經(jīng)元建立連接[3],在一定程度上恢復(fù)視網(wǎng)膜的光敏性。這一策略要求視網(wǎng)膜下間隙的移植細(xì)胞遷移入宿主外核層,與宿主雙極細(xì)胞形成突觸,同時發(fā)育出對光敏感的外段與宿主視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)層緊密接觸,通過不斷的膜盤脫落和更新,以及視色素再生來維持光感受器的結(jié)構(gòu)和功能[4-5]。

在2016年的3項(xiàng)研究中,研究人員通過分別標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),在光感受器移植后,主要發(fā)生物質(zhì)交換--即移植細(xì)胞將細(xì)胞質(zhì)所含蛋白質(zhì)/RNA等轉(zhuǎn)移至宿主殘余的光感受器內(nèi),實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的治療作用,而發(fā)生細(xì)胞整合的比例相對較低[6-8]。這種物質(zhì)交換的主要特點(diǎn)包括:宿主和移植細(xì)胞間的物質(zhì)交換雙向進(jìn)行;以一種短暫但頻繁的方式進(jìn)行,不需要持續(xù)的相互作用;與細(xì)胞外蛋白、核酸的攝取以及細(xì)胞的融合無關(guān);似乎僅限于光感受器間[6-8]。雖然物質(zhì)交換的發(fā)生機(jī)制尚不明確,但其功能發(fā)揮的前提是視網(wǎng)膜內(nèi)有足夠的剩余光感受器,因此這一機(jī)制更適合用于早期退行性疾病,在晚期顯然需要細(xì)胞整合才可發(fā)揮作用。

2018年,Waldron等[9]將視錐前體細(xì)胞分別移植入視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂且外界膜結(jié)構(gòu)受到破壞的Nrl-/-小鼠和引入保護(hù)基因后結(jié)構(gòu)紊亂較小的Nrl-/-RPE65R91W/R91W小鼠,結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)紊亂的視網(wǎng)膜整合事件發(fā)生的比例達(dá)到23%,而結(jié)構(gòu)完整的視網(wǎng)膜中該比例僅為6%。這證明了宿主環(huán)境影響2種機(jī)制的相對貢獻(xiàn),提示整合事件發(fā)生的比例可通過調(diào)控來提高[9]。

而除了整合事件比例不足外,移植光感受器還存在其他問題,包括細(xì)胞在移植后表現(xiàn)出取向(即光感受器外段朝向RPE層,突觸端朝向外核層)能力不完全,外段發(fā)育不成熟以及突觸形成不足等。為了提高光感受器的功能性整合,可選擇合適的移植細(xì)胞群、對宿主環(huán)境進(jìn)行一定程度的干預(yù)、改變細(xì)胞移植的形式以及優(yōu)化視網(wǎng)膜下注射等方式。下面分別從這些方面進(jìn)行介紹。

1 移植細(xì)胞群的選擇

有關(guān)移植細(xì)胞群選擇的相關(guān)小鼠研究已取得較為一致的結(jié)果?；镜膶?shí)驗(yàn)思路是通過觀察不同視網(wǎng)膜發(fā)育階段的特定細(xì)胞群移植至宿主小鼠的結(jié)果,來確定最佳的移植細(xì)胞群。對于小鼠視桿細(xì)胞的移植,產(chǎn)后第4～7天分離的視桿前體細(xì)胞群最適合移植,而對于視錐細(xì)胞的移植,胚胎第15.5天的細(xì)胞群最佳[10-12]。上述時間段分離的細(xì)胞代表了有絲分裂后的光感受器前體細(xì)胞,與宿主視網(wǎng)膜的相互作用最強(qiáng)。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)生物質(zhì)交換事件更多,但是證實(shí)了視網(wǎng)膜發(fā)育過程中確實(shí)存在著最適合的移植時間窗[1,12]。在這期間,未成熟光感受器可能會再現(xiàn)與視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞突觸形成的發(fā)育程序[2]。

在人類胎兒視網(wǎng)膜中,視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的發(fā)生分別從妊娠第8周和第10周開始[13]。然而,由于獲取胎兒視網(wǎng)膜的資源有限且不符合倫理要求,近幾年的研究使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)和人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)來源的視網(wǎng)膜類器官獲得移植光感受器。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜類器官與胎兒視網(wǎng)膜發(fā)育的時程及細(xì)胞組成大體相似[13-15]。近年來,人源性細(xì)胞移植的部分研究顯示,供體細(xì)胞群主要來源于分化第60～90天的視網(wǎng)膜類器官,大多通過綠色熒光蛋白分離并富集[4,16-19];也有研究選取分化第120天的類器官并通過細(xì)胞標(biāo)志CD73+來富集[20];最新的一項(xiàng)研究顯示,來源于視網(wǎng)膜類器官的光感受器僅在早期存在短的發(fā)育時間窗,能發(fā)生典型的軸突延伸,而到了類器官分化第80天,只有極少數(shù)細(xì)胞能夠自主生長軸突[21]。這些細(xì)胞的共同特征是均為光感受器前體細(xì)胞。移植結(jié)果顯示,雖然遷移至外核層的細(xì)胞數(shù)量少,但以整合的形式為主,細(xì)胞表現(xiàn)出一定的取向,同時有突觸蛋白的表達(dá)、原始膜盤的形成等,主要以組織學(xué)的改善為主[4,17,18,20];也有研究顯示視功能的恢復(fù)[16]。使用比較成熟的細(xì)胞群移植,整合細(xì)胞的數(shù)量會減少,移植比較不成熟的細(xì)胞群,物質(zhì)交換似乎更頻繁[22-24]。這些研究所選擇的宿主不同,但宿主環(huán)境同樣會影響移植結(jié)果,因此結(jié)果的解釋需綜合考慮?？傊?無論是動物源性還是人源性移植細(xì)胞,與宿主的相互作用均受供體細(xì)胞發(fā)育階段調(diào)節(jié),人類最佳的移植細(xì)胞群還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

與通過干細(xì)胞得到光感受器不同,最新的研究顯示使用5種化合物:丙戊酸、CHIR99021、RepSox、Forskolin以及STR(Sonic hedgehog,taurine and retinoic acid),可繞過誘導(dǎo)生成多能干細(xì)胞的步驟,直接使小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為化學(xué)誘導(dǎo)的光感受器樣細(xì)胞[25]。將上述細(xì)胞移植入視網(wǎng)膜退行性變小鼠(rd1)模型,顯示出功能學(xué)及組織學(xué)的改善[25]。該過程極大地縮短了獲得移植光感受器所需時間,具有很大潛力,但是未來需要克服增生能力及轉(zhuǎn)換效率低的缺點(diǎn)。

2 宿主環(huán)境的干預(yù)

影響供體光感受器在宿主環(huán)境中遷移的主要屏障包括外界膜,反應(yīng)性膠質(zhì)增生和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。此外,對宿主環(huán)境進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),也可提高整合的發(fā)生。

外界膜構(gòu)成外核層與視網(wǎng)膜下間隙的天然屏障[1,22]。有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究顯示,動物模型中外界膜的破壞與移植光感受器整合提高相關(guān)[9,12,26]。利用膠質(zhì)毒素α-氨基己二酸[27-28]或靶向外界膜成分的小干擾RNA[29],可破壞外界膜。然而其在人體內(nèi)使用需考慮毒性影響及脫靶效應(yīng)[1]。Ripolles-Garcia等[30]研究者將人光感受器前體細(xì)胞移植入遺傳性視網(wǎng)膜疾病犬模型視網(wǎng)膜下,發(fā)現(xiàn)接受免疫抑制劑治療突變?nèi)耐饨缒ぐl(fā)生局部破壞,移植細(xì)胞軸突延長并形成類似于突觸終端結(jié)構(gòu)。因此外界膜可作為未來研究的一個靶點(diǎn),以期提高移植效果。

視網(wǎng)膜發(fā)生退行性變后,進(jìn)入視網(wǎng)膜重塑階段。Müller細(xì)胞首先發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)增生,表現(xiàn)為膠質(zhì)纖維酸性蛋白及波形蛋白的表達(dá)上調(diào),細(xì)胞肥大及突起數(shù)量增加,形成可能會阻礙細(xì)胞遷移和整合的屏障[22,25,31]。移植C-Kit+祖細(xì)胞群至退行性變視網(wǎng)膜中可觀察到膠質(zhì)增生受抑制,提示可選擇或培養(yǎng)同時具有再生光感受器及改善移植微環(huán)境能力的供體細(xì)胞群[24]。

此外,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Müller細(xì)胞會上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌。硫酸軟骨素蛋白多糖作為主要的分泌蛋白,其沉積可能會抑制宿主雙極細(xì)胞樹突再生以及供體細(xì)胞軸突延長[32],與外核層中整合細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[26]。利用軟骨素酶ABC可切割硫酸軟骨素蛋白多糖的糖胺聚糖側(cè)鏈來提高整合結(jié)果[33];此外,利用基質(zhì)金屬蛋白酶2也可通過消化細(xì)胞外基質(zhì)提高細(xì)胞遷移[34]。

Zhu等[16]指出退行性疾病環(huán)境中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤,可能影響組織修復(fù)。巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞有2種激活形態(tài):與導(dǎo)致組織損傷、炎癥發(fā)生有關(guān)的M1型;與炎癥消退及組織修復(fù)有關(guān)的M2型[35]。因此,通過免疫調(diào)節(jié),使M1型轉(zhuǎn)化為M2型,則可能改善免疫微環(huán)境,促進(jìn)細(xì)胞整合。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進(jìn)巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型,作用于退行性變視網(wǎng)膜后,改善了移植細(xì)胞的整合及視覺功能的恢復(fù)效果[36]。此外,部分研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素、干擾素β、轉(zhuǎn)位蛋白及合成孕酮[35,37-39]等藥物具有抑制視網(wǎng)膜內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移或激活的作用,然而目前尚無利用這些物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞移植的相關(guān)研究。最近有一項(xiàng)研究指出小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜下間隙的浸潤反而有利于延緩?fù)诵行约膊∵M(jìn)展[40]。因此,未來還需要進(jìn)一步闡明調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞與改善宿主移植環(huán)境之間的關(guān)系。

3 視網(wǎng)膜片的移植

移植含光感受器的視網(wǎng)膜片,相較于細(xì)胞懸液的形式,具有以下優(yōu)勢:(1)改善了細(xì)胞的生理微環(huán)境[2];(2)提高了移植細(xì)胞的組織性、存活率及整合效率[1];(3)提高了視網(wǎng)膜片外段的成熟能力[4]。然而,視網(wǎng)膜片移植后普遍形成“玫瑰花結(jié)”,影響光感受器的外段與RPE層接觸[41]。此外,移植片中其他視網(wǎng)膜細(xì)胞的存在可能會限制突觸連接的形成。

隨著視網(wǎng)膜類器官技術(shù)的不斷成熟,利用人源性類器官進(jìn)行視網(wǎng)膜片移植的研究開始逐漸增多。與細(xì)胞懸液移植不同,視網(wǎng)膜片大多數(shù)細(xì)胞為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞時表現(xiàn)最佳[23]。近年來,高橋政代團(tuán)隊(duì)將視網(wǎng)膜祖細(xì)胞時期的hESC源性視網(wǎng)膜片,移植至免疫缺陷rd1小鼠模型(NOG-rd1-2J)后,發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜片表現(xiàn)出成熟的內(nèi)、外段形成和突觸接觸的跡象,且記錄到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)[42]。此外,該團(tuán)隊(duì)將分化第50～60天hiPSC源性視網(wǎng)膜片移植到視網(wǎng)膜退行性變的免疫缺陷大鼠模型[SD-Foxn1 Tg(S334ter)3LavRrrc]和激光誘導(dǎo)退行性變、低劑量環(huán)孢素免疫抑制的猴模型內(nèi),結(jié)果顯示移植物在大鼠中存活10個月,在猴眼內(nèi)存活超過2年。移植區(qū)的組織學(xué)顯示,光感受器發(fā)育成熟,極性正確,突觸形成;在功能方面觀察到大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)改善,猴眼中與移植區(qū)相關(guān)的視野試驗(yàn)輕度恢復(fù)[43]。類似地,McLelland等[44]將分化第30～65天hESC源性視網(wǎng)膜片移植至同種大鼠模型,觀察到光感受器明顯發(fā)育,宿主視網(wǎng)膜與移植片之間建立了活躍的突觸,視動測試及上丘電生理記錄顯示出功能改善。

與利用類器官作為供體不同,Lorach等[45]將健康成年大鼠包括RPE層在內(nèi)的全層視網(wǎng)膜作為供體,分別移植入RCS及S334ter-3大鼠視網(wǎng)膜下,結(jié)果顯示移植區(qū)域光感受器的內(nèi)外段保存完好,移植物與宿主間形成突觸,同時RPE層互相融合。因而該研究提出將患者周邊視網(wǎng)膜移植入中央視網(wǎng)膜下,可治療AMD等疾病。然而,視網(wǎng)膜不同區(qū)域細(xì)胞組成及結(jié)構(gòu)存在較大的差異,且患者自身細(xì)胞可能存在缺陷,因此該研究治療方案的有效性尚待證實(shí)。另一項(xiàng)視網(wǎng)膜外植體研究也顯示活性RPE層可增強(qiáng)光感受器的有效整合,而受損的RPE層在一定程度上會限制整合[46]。上述研究結(jié)果提示可發(fā)展光感受器與RPE層的共同移植,以及視網(wǎng)膜下手術(shù)時盡量避免損傷RPE層。

4 生物材料的支持

利用生物支架可將純化的光感受器前體細(xì)胞有序地進(jìn)行排列,保持細(xì)胞的正確取向及組織,同時支架更利于移植手術(shù)時精確定位于靶點(diǎn),兼具細(xì)胞懸液及視網(wǎng)膜片的優(yōu)勢。

基于此,Jung等[47]通過微模塑技術(shù),利用聚二甲基硅氧烷及聚(丙三醇-癸二酸)材料,得到大量“高腳杯”狀支架緊密排列形成的高分子膜。“高腳杯”的“杯身”用于容納1～3個光感受器的細(xì)胞體,“杯柄”用于延伸軸突,透射電鏡顯示內(nèi)段富含線粒體。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用可生物降解的聚癸二酸甘油酯(poly glycerol sebacate,PGS)制作了“冰格狀光感受器托盤”,將移植細(xì)胞種植的密度提升了3倍,同時在底部設(shè)計(jì)了圓柱狀的孔隙,以便與受體的視網(wǎng)膜組織相連并逐漸成熟,該生物支架能提供光感受器發(fā)育初期必要的機(jī)械強(qiáng)度,且能夠?qū)崿F(xiàn)移植后材料的代謝[48]。在后續(xù)研究中,此團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一款蜂窩狀,可生物降解的PGS視網(wǎng)膜微支架,能有效地支持高密度的RPE和光感受器細(xì)胞層在支架上的生長,從而形成排列緊密且規(guī)則的雙層視網(wǎng)膜細(xì)胞[48]。然而,這些研究未將所開發(fā)的支架植入動物模型中,因此其有效性待進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外,利用雙光子光刻技術(shù)可實(shí)現(xiàn)生物支架精細(xì)結(jié)構(gòu)的3D打印,分辨率可達(dá)50 nm[49-50],完全滿足光感受器植入的需要。該技術(shù)制作的支架可成功支持hiPSC源性視網(wǎng)膜祖細(xì)胞生長,將空支架置入Pro23His視紫紅質(zhì)突變豬模型后一個月,未引起炎癥、感染或局部及全身毒性[50]。除了利用生物支架提高移植光感受器的組織性外,也有研究通過模擬視網(wǎng)膜細(xì)胞外基質(zhì)的支架促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化[51],或是利用生物材料提高供體細(xì)胞的遷移能力[52],或優(yōu)化細(xì)胞移植的載體提高細(xì)胞的存活率及整合效率[27,53]。最近一項(xiàng)關(guān)于視網(wǎng)膜下間隙注射的研究發(fā)現(xiàn),將不同大小的微膠珠注射至視網(wǎng)膜下間隙,6小時后1 μm微膠珠在此間隙內(nèi)數(shù)量減少,而在鞏膜外腔內(nèi)增多;而1～2周后視網(wǎng)膜下間隙仍有較多4 μm微膠珠存在[54]。該研究提示使用生物材料作為輸送細(xì)胞的載體,除了某些成分本身可提高細(xì)胞存活率外,使用這些載體可能通過增加移植物體積來減少細(xì)胞被排出視網(wǎng)膜。

5 視網(wǎng)膜下注射的優(yōu)化

既往研究中經(jīng)視網(wǎng)膜下注射細(xì)胞或視網(wǎng)膜片多數(shù)采用經(jīng)玻璃體入路,少數(shù)研究經(jīng)脈絡(luò)膜上腔入路。經(jīng)玻璃體入路注射針頭必須穿透視網(wǎng)膜,可能會導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部膠質(zhì)增生[22],而且注射細(xì)胞容易反流至玻璃體,造成移植細(xì)胞的損失及潛在的風(fēng)險[55]。而經(jīng)脈絡(luò)膜上腔入路注射后玻璃體內(nèi)基本不會出現(xiàn)移植的細(xì)胞,但是技術(shù)相對復(fù)雜,容易損傷脈絡(luò)膜及血管,可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞進(jìn)入視網(wǎng)膜[22]。因此需要對手術(shù)入路選擇進(jìn)行權(quán)衡。此外可通過改良輸送工具來保護(hù)移植細(xì)胞或視網(wǎng)膜片,借助術(shù)中眼底成像技術(shù)及手術(shù)機(jī)器人實(shí)現(xiàn)精確定位,減少注射相關(guān)損傷。

另外,Scruggs等[56]發(fā)現(xiàn),注射前將細(xì)胞置于37 ℃孵育,注射時使用尺寸較大的針頭,可提高移植細(xì)胞的存活率。Wilson等[55]也發(fā)現(xiàn)使用尺寸較小的針頭會導(dǎo)致細(xì)胞死亡增多,移植入無效的細(xì)胞碎片。Scruggs等還發(fā)現(xiàn)注射時針頭尺寸增大會導(dǎo)致RPE細(xì)胞異常的增加,主要表現(xiàn)為脫色素及RPE65標(biāo)記表達(dá)丟失,而宿主RPE層損傷會減少光感受器的有效整合[45,56]。增加移植物粘滯度、控制注射速度在較低水平,可減少RPE異常的發(fā)生,這可能與湍流效應(yīng)的減輕有關(guān)[56]。評估及優(yōu)化注射相關(guān)流體動力學(xué)的參數(shù),將有助于減輕注射對宿主環(huán)境的影響;利用生物材料作為載體也可能通過增加移植物粘滯度,來改善細(xì)胞整合。

6 總結(jié)與展望

光感受器移植作為治療視網(wǎng)膜退行性疾病的有效方法,還面臨著許多未解決的難題。本文就移植后功能性整合效率低下的問題總結(jié)了部分有助于改善該現(xiàn)象的策略。此外,Garita-Hernandez等[4]將干細(xì)胞移植與光遺傳學(xué)的方法相結(jié)合,在供體光感受器內(nèi)導(dǎo)入視蛋白,人為地賦予其光敏性,再移植入退行性變小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)。在不形成外段及不依賴RPE的情況下,移植小鼠視功能得到明顯的提高。這種繞開對功能性外段生成以及視色素循環(huán)需求的研究方案也有巨大的潛力。

在未來,可繼續(xù)尋求改善移植的不同策略:利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)確立最佳的人源性細(xì)胞群;研究改善退行性變視網(wǎng)膜環(huán)境的干預(yù)方法及臨床轉(zhuǎn)化;評估及優(yōu)化視網(wǎng)膜下手術(shù)相關(guān)的不同參數(shù);探究含移植細(xì)胞的生物支架在不同動物模型內(nèi)的治療作用;發(fā)展更有競爭力的生物材料;將光遺傳學(xué)改造的光感受器植入生物支架進(jìn)行移植研究?？傊?提高移植光感受器與宿主視網(wǎng)膜間功能性整合具有廣闊的前景,卻也是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)難點(diǎn),多種學(xué)科之間的合作將有助于推動其發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突