廖科人 彭斌 鄭紅梅 劉一帆 沈吟,2

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心,武漢 430060;2武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院,武漢 430071

食蟹猴為非人靈長類動物,其生物學(xué)特性與人類相近,是研究人類疾病的最佳動物模型之一,常用于臨床前試驗研究。食蟹猴的眼球大小、結(jié)構(gòu)與人類眼球相近,視網(wǎng)膜有黃斑中心凹,還具有立體視覺、色覺等視覺生理功能,是理想的眼科實驗動物模型。食蟹猴常應(yīng)用于眼科的藥物研究領(lǐng)域、眼科細胞或基因治療的療效與安全性觀察[1-2];其在青光眼、糖尿病、黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病的研究中發(fā)揮了重要作用[3-4]。食蟹猴價格昂貴,動物倫理也要求盡量減少其使用。因此,本研究通過規(guī)范化的流程對成年食蟹猴視網(wǎng)膜進行光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)和視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)等測量,并探討其與正常人視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)的相似度,以期為新藥臨床前研究和毒理藥理安全評價中心的食蟹猴視網(wǎng)膜相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 成年雄性食蟹猴3只購自廣州相觀生物科技有限公司(動物合格證號:448183000000899),5歲,體質(zhì)量4～5 kg,無全身及眼部疾患。動物均單獨飼養(yǎng)于湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司動物房[SYXK(鄂)2016-0090)],在60 cm×68 cm×75 cm的鐵籠中,并置于室溫22～24 ℃、相對濕度50%～60%、12 h明-暗光交替光照環(huán)境中。本研究中對動物的實驗操作均遵守實驗動物福利倫理,研究方案經(jīng)湖北天勤生物科技有限公司實驗動物福利倫理委員會批準(批文號:IACUC準-2019-012)。

1.1.2主要試劑及儀器 舒眠寧[5](替來他明、賽拉嗪和咪達唑侖混合制劑,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)小動物疾病研究室研制);復(fù)方托吡卡胺滴眼液(沈陽興齊眼藥股份有限公司);玻璃酸鈉滴眼液(日本參天制藥株式會社);鹽酸丙美卡因滴眼液[愛爾康(中國)眼科產(chǎn)品有限公司];鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠(湖北遠大天明制藥有限公司)。Horus手持式眼底照相機(DEC100,中國臺灣晉弘科技有限公司);OCT儀(iVUE-100,美國OPTOVUE公司);RETeval手持式電生理儀器(美國LKC公司);Jet角膜接觸電極(ERG-jet,瑞士Fabrinal公司)。

1.2 方法

1.2.1麻醉方法 本實驗均在動物操作全身麻醉狀態(tài)下進行,檢測前12 h禁食,麻醉前稱體重,并按照0.5 ml/kg的劑量肌肉注射舒眠寧進行全身麻醉;麻醉后使其仰臥,將舌拉出口腔防止窒息。實驗操作過程中若出現(xiàn)眼瞼活動、肌肉緊張等麻醉變淺狀態(tài),立即按之前麻醉劑量的1/3追加麻醉1次。

1.2.2眼底照相 麻醉前將動物固定于猴椅,復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分擴瞳。行全身麻醉后將其呈仰臥位置于檢測臺,開瞼器撐開眼瞼后,使用Horus手持式眼底照相機于暗室中對其雙眼進行眼底拍攝。檢測過程中使用玻璃酸鈉滴眼液點眼預(yù)防角膜干燥。

1.2.3光譜域OCT 常規(guī)擴瞳后麻醉動物,使其處于俯臥位,使用OCT儀對雙眼進行掃描,掃描區(qū)域包括黃斑區(qū)和視盤,掃描速度為26 000次/s,軸向分辨率為5 μm,掃描深度為2 mm,掃描區(qū)域面積為6 mm×6 mm。由同一位經(jīng)驗豐富的檢查者完成掃描,至少重復(fù)測量2次。檢測過程中使用玻璃酸鈉滴眼液點眼預(yù)防角膜干燥,同時在眼表形成光滑且利于成像的光學(xué)表面。利用儀器自動檢測系統(tǒng)檢測黃斑中心凹及距中心凹1 000和2 000 μm處鼻側(cè)、顳側(cè)、上方、下方的視網(wǎng)膜全層及內(nèi)、外層視網(wǎng)膜厚度。各視盤參數(shù)使用視盤分析模式掃描并計算,視盤參數(shù)包括盤緣面積、視盤面積、視杯體積、杯/盤面積比、杯/盤垂直比、杯/盤水平比。視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)厚度參數(shù)包括總體、上方、下方平均RNFL厚度以及視盤周圍:顳側(cè)上方(temporal upper,TU)、顳側(cè)下方(temporal lower,TL)、上方顳側(cè)(superior temporal,ST)、上方鼻側(cè)(superior nasal,SN)、鼻側(cè)上方(nasal upper,NU)、鼻側(cè)下方(nasal lower,NL)、下方鼻側(cè)(inferior nasal,IN)、下方顳側(cè)(inferior temporal,IT)8個區(qū)域的平均RNFL厚度。

1.2.4閃光ERG 應(yīng)用RETeval手持式電生理儀記錄動物的閃光ERG。常規(guī)擴瞳,并置于暗室中暗適應(yīng)至少40 min;行全身麻醉后取仰臥位置于檢測臺上,用開瞼器撐開動物眼瞼,鹽酸丙美卡因滴眼液進行表面麻醉,于暗紅光條件下安放電極,其中,角膜接觸鏡電極內(nèi)涂鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠后放置在動物角膜上,參考電極和接地電極涂上導(dǎo)電膏后分別置于外眥部和前額。按照ISCEV標準[6]順序記錄暗適應(yīng)0.01 ERG、暗適應(yīng)3.0 ERG、暗適應(yīng)3.0振蕩電位(oscillatory potentials,OPs)和暗適應(yīng)10.0 ERG各波的振幅與峰時。待暗適應(yīng)ERG記錄完成后,進行5 min的明適應(yīng)(30 cd·s/m2),記錄明適應(yīng)3.0 ERG和明適應(yīng)30 Hz閃爍ERG各波的振幅和峰時。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成年食蟹猴正常眼底圖像

成年食蟹猴正常眼底圖像與人類相似,視盤呈橢圓形,淺紅色,邊界清楚,中央有生理性凹陷,色澤稍淡,左右眼對稱;視網(wǎng)膜中央動脈顏色鮮紅,靜脈顏色暗紅,視網(wǎng)膜透明,可見下方的色素上皮及脈絡(luò)膜;黃斑部位于視盤顳側(cè)偏下方,此區(qū)域無血管,中心有一星樣反光點,黃斑周圍還可見一反光輪(圖1A,B)。

圖1 正常成年食蟹猴彩色眼底照相和視網(wǎng)膜OCT圖像 A:右眼彩色眼底照相 B:左眼彩色眼底照相 C:視盤OCT圖像 D:黃斑中心凹OCT圖像

2.2 成年食蟹猴正常的視網(wǎng)膜、視盤及RNFL參數(shù)

成年食蟹猴視網(wǎng)膜的黃斑中心凹處和視盤處的OCT圖像顯示,黃斑中心凹形態(tài)可見,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)層次清晰(圖1C,D)。食蟹猴黃斑中心凹處視網(wǎng)膜總厚度為(252.31±4.79)μm。黃斑中心凹周圍4個象限鼻側(cè)視網(wǎng)膜最厚,距中心凹2 000 μm處為(340.85±3.77)μm。視網(wǎng)膜平均RNFL厚度為(103.53±0.58)μm。左右眼間視網(wǎng)膜各層及各象限厚度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。

正常成年食蟹猴視盤面積為(1.89±0.05)mm2,杯盤面積比為0.14±0.01。不同眼別間盤沿面積、視盤面積、視杯面積、杯盤面積比、杯盤垂直比、杯盤水平比比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。在視盤周圍8個RNFL區(qū)域中,以ST和IT最厚,而鼻側(cè)(NU+NL)和顳側(cè)(TU+TL)較薄。不同眼別間各部位RNFL厚度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(圖2)。

圖2 正常成年食蟹猴各區(qū)域RNFL厚度比較 左右眼間各區(qū)域RNFL厚度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(配對樣本t檢驗) RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層;NU:鼻側(cè)上方;IN:下方鼻側(cè);NL:鼻側(cè)下方;IT:下方顳側(cè);TL:顳側(cè)下方;TU:顳側(cè)上方;ST:上方顳側(cè);SN:上方鼻側(cè)

2.3 成年食蟹猴正常ERG表現(xiàn)

成年食蟹猴暗適應(yīng)0.01 ERG波形表現(xiàn)為緩慢上升的正向b波,a波不明顯,而在暗適應(yīng)3.0 ERG和暗適應(yīng)10.0 ERG中波形由開始向下的負向a波和隨后向上的正向b波組成,且b波的上升支存在不明顯的節(jié)律性振蕩。暗適應(yīng)3.0 OPs由4～5個波形為一組的節(jié)律性波形組成。成年食蟹猴明適應(yīng)3.0 ERG波形也為a、b波的組合,明適應(yīng)3.0閃光ERG則為一組類似正弦波的周期性變化波形(圖3)。正常成年食蟹猴ERG暗適應(yīng)0.01 ERG b波振幅為(66.75±7.29)μV,暗適應(yīng)3.0 ERG a、b波振幅分別為(57.15±15.01)、(122.10±25.51)μV,暗適應(yīng)10.0 ERG a、b波振幅分別為(72.98±20.14)、(131.67±13.78)μV,OPs振幅為(49.98±10.08)μV,峰時為(30.02±5.76)ms,明適應(yīng)3.0 ERG a、b波振幅分別為(9.16±2.75)、(40.43±5.57)μV,明適應(yīng)閃爍光反應(yīng)峰時為(26.61±1.19)ms,振幅為(24.72±5.10)μV。正常成年食蟹猴不同眼別間ERG各參數(shù)的振幅和峰時比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

表1 正常成年食蟹猴不同眼別各區(qū)域視網(wǎng)膜厚度比較(x±s,μm)Table 1 Comparison of retinal thickness in different regions of normal adult Macaca fascicularis between both eyes (x±s,μm)眼別樣本量不同區(qū)域全視網(wǎng)膜厚度 中心凹鼻側(cè)距中心凹1 000 μm鼻側(cè)距中心凹2 000 μm顳側(cè)距中心凹1 000 μm顳側(cè)距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼3254.83±7.12334.17±6.50348.50±4.55320.67±7.93309.83±7.11329.00±9.29323.50±6.91328.50±7.19326.00±4.50左眼3250.14±6.89330.14±2.81334.29±4.75313.00±5.99292.71±8.00321.57±4.39309.57±4.70314.43±3.38312.43±4.95t值0.4730.5692.1600.7721.6000.7231.6671.7712.028P值0.6610.6000.0970.4830.1850.5100.1710.1510.112眼別樣本量不同區(qū)域內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度中心凹鼻側(cè)距中心凹1 000 μm鼻側(cè)距中心凹2 000 μm顳側(cè)距中心凹1 000 μm顳側(cè)距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼345.00±2.21117.40±1.72122.60±1.29114.60±1.75109.04±0.68116.20±2.37113.20±1.91120.80±0.86115.40±0.98左眼342.14±1.74115.29±1.73121.71±1.66111.00±1.02107.86±1.37117.71±2.54113.00±1.95117.71±1.27109.86±2.91t值1.0170.8650.4230.1780.7720.4350.0732.0151.804P值0.3670.4360.6940.1500.4840.6860.9450.1140.146眼別樣本量不同區(qū)域外層視網(wǎng)膜厚度 中心凹鼻側(cè)距中心凹1 000 μm鼻側(cè)距中心凹2 000 μm顳側(cè)距中心凹1 000 μm顳側(cè)距中心凹2 000 μm上方距中心凹1 000 μm上方距中心凹2 000 μm下方距中心凹1 000 μm下方距中心凹2 000 μm右眼3210.00±8.07219.60±7.19226.80±4.65207.60±8.48195.60±6.85217.60±10.85209.20±10.08210.00±8.73212.20±5.09左眼3207.86±5.88214.86±3.46212.71±5.15201.86±5.83185.00±7.61203.86±4.22196.57±4.61203.00±2.91202.57±4.95t值0.2140.5940.2030.5581.0351.1801.1390.7611.356P值0.8410.5840.1120.6070.3590.3030.3180.4890.246 注:(配對樣本t檢驗) Note:(Paired samples t-test)

表2 正常成年食蟹猴不同眼別視盤相關(guān)參數(shù)測量值比較(x±s)Table 2 Comparison of optic disk parameters of normal adult Macaca fascicularis between both eyes (x±s)眼別樣本量盤沿面積(mm2)視盤面積(mm2)視杯體積(mm3)杯盤面積比杯盤垂直比杯盤水平比右眼31.56±0.071.79±0.090.010±0.0020.13±0.010.30±0.020.38±0.03左眼31.66±0.081.97±0.060.010±0.0040.16±0.020.28±0.020.47±0.04t值0.9410.166<0.0011.3420.7071.800P值0.4000.171>1.0000.2510.5180.146 注:(配對樣本t檢驗) Note:(Paired samples t-test)

圖3 正常成年食蟹猴ERG各反應(yīng)波形 A:暗適應(yīng)0.01 ERG B:暗適應(yīng)3.0 ERG C:暗適應(yīng)10.0 ERG D:暗適應(yīng)3.0 OPs E:明適應(yīng)3.0 ERG F:明適應(yīng)3.0閃光ERG 1號波和2號波為同一眼的2次重復(fù)

2.4 食蟹猴與人類和兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和ERG比較

本研究實測結(jié)果與既往文獻研究結(jié)果比較,食蟹猴視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)參數(shù)和ERG與人相近,但與兔差別較大(表4)。

表4 食蟹猴與人類、兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和ERG測量值對比Table 4 Comparison of structural parameters and ERG measruements of retina among Macaca fascicularis,human and rabbit參數(shù)食蟹猴人兔中心凹視網(wǎng)膜厚度(μm)252.31±4.79248.9±12.9[7]/RNFL厚度(μm)103.53±0.58103.2±12.6[8]109.6±23.8[9]視盤面積(mm2)1.89±0.052.01±0.32[10]6.41±1.23[11]盤沿面積(mm2)1.61±0.061.40±0.19[10]1.37±0.90[11]暗適應(yīng)3.0 ERG a波振幅(μV)57.15±15.0158.7(35.4-85.4)[12]?10.07±8.35[13]暗適應(yīng)3.0 ERG b波振幅(μV)122.10±25.5187.6(54.5-132.5)[12]?172.80±36.86[13]明適應(yīng)3.0 ERG a波振幅(μV)9.16±2.757.9(4.8-11.9)[12]?20.66±17.12[13]明適應(yīng)3.0 ERG b波振幅(μV)40.43±5.5733.5(21.8-54.5)[12]?124.2±11.1[13] 注:計量資料以x±s表示,n≥3;?:該計量資料以M(P5-P95)表示 ERG:視網(wǎng)膜電圖;RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層 Note:Data were expressed as the x±s of measurement,n≥3;?:this data was expressed as the M(P5-P95) ERG:electroretinogram;RNFL:retinal nerve fi-ber layer

3 討論

食蟹猴的生理特征、生化指標、眼的結(jié)構(gòu)和功能與人類相似,常用于視網(wǎng)膜疾病治療藥物的安全性或有效性評估。本研究對正常成年食蟹猴的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能進行了觀察和檢測,提供了彩色眼底照相、OCT、ERG等視網(wǎng)膜相關(guān)研究指標的實測結(jié)果,為食蟹猴在視網(wǎng)膜相關(guān)的研究應(yīng)用提供了參考和理論基礎(chǔ)。

食蟹猴視網(wǎng)膜擁有黃斑區(qū)和中心凹結(jié)構(gòu),較小鼠、大鼠和兔等常用實驗動物更接近人視網(wǎng)膜,視網(wǎng)膜血管形態(tài)和分布也與人類最為接近,更適合作為人類藥物研究的眼底疾病模型和藥物的視網(wǎng)膜安全性研究[14-16]。本研究應(yīng)用OPTOUVE iVUE-100 OCT測定食蟹猴中心凹區(qū)視網(wǎng)膜厚度為(252.31±4.79)μm,對比Mitkova-Hristova等[7]使用同一儀器測量84名健康人的平均黃斑中心凹區(qū)視網(wǎng)膜厚度(248.9±12.9)μm相近。同時本研究結(jié)果顯示,食蟹猴和人類均為鼻側(cè)視網(wǎng)膜最厚,說明猴和人一樣存在視盤至黃斑區(qū)域密集的神經(jīng)纖維[17]。

本研究測量的食蟹猴平均RNFL厚度為(103.53±0.58)μm,與Wang等[8]采用OPTOUVE iVUE-100測得的北京地區(qū)1 654名健康人的平均RNFL厚度(103.2±12.6)μm接近,與Choi等[18]測量11只食蟹猴的平均RNFL厚度(100.20±5.89)μm也基本一致。此外,各區(qū)域RNFL厚度與Niklaus等[19]的測量值相近。本研究對成年食蟹猴各區(qū)域RNFL的厚度檢測發(fā)現(xiàn),顳上和顳下象限的RNFL最厚,而鼻側(cè)和顳側(cè)較薄,這與已報道的人RNFL厚度的“雙駝峰”形態(tài)一致[20]。RNFL主要由神經(jīng)節(jié)細胞軸突組成,節(jié)細胞軸突以一定排列方式走向視盤,視盤和顳側(cè)的上下方均有節(jié)細胞軸突走行,黃斑顳側(cè)的軸突經(jīng)黃斑上下弓形區(qū)分別進入視盤的顳側(cè),黃斑鼻側(cè)的軸突則直接進入視盤鼻側(cè),因此,視盤上下方含有較多的神經(jīng)纖維,尤其是顳上和顳下象限。

ERG是評估視網(wǎng)膜功能的重要手段[21],暗適應(yīng)ERG主要反映視桿系統(tǒng)的功能,明適應(yīng)ERG則主要反映視錐系統(tǒng)的功能。a波主要是由視網(wǎng)膜光感受器的對光活動形成,b波則主要反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層的電活動[22]。本研究所記錄的食蟹猴ERG波形與正常成人的ERG波形更相似[23]。而與小鼠ERG[24]相比,食蟹猴視桿反應(yīng)較低,而視錐反應(yīng)較高,可能與鼠科動物夜間活動的生活習(xí)性有關(guān),以夜視為主。本研究中手持ERG測量的食蟹猴OPs振幅為(49.98±10.08)μV,Asakawa等[12]使用同一儀器測量的人類OPs振幅為49.0(47.3～50.6)μV,研究結(jié)果相近。本研究結(jié)果顯示,食蟹猴ERG測量值更接近人類,尤其是視錐系統(tǒng)即黃斑中心的視網(wǎng)膜功能。劉聞一等[25]對比了獼猴與人的閃光ERG檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)獼猴明適應(yīng)3.0 ERG和明適應(yīng)30 Hz ERG OPs的波形和振幅與人相近,進一步說明了非靈長類動物的ERG數(shù)據(jù)可在同等條件下借鑒人的參考值。

本研究測量的食蟹猴左、右眼中心凹區(qū)視網(wǎng)膜厚度、平均RNFL厚度、ERG的波形與振幅等結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,因此,涉及這些檢測指標的實驗研究可采用食蟹猴單眼作為實驗組,對側(cè)眼作為對照組,以減少樣本量少的情況下個體差異對研究結(jié)果造成的影響。如前所述,本研究測量的食蟹猴中心凹區(qū)視網(wǎng)膜厚度、平均RNFL厚度、OPs振幅等數(shù)據(jù)與使用相同儀器測量的健康人群數(shù)據(jù)相近。但使用RETIcom測得的食蟹猴OPs振幅為(32.34±11.62)μV,使用Heidelberg Engineering GmbH OCT測得食蟹猴中心凹區(qū)視網(wǎng)膜厚度的結(jié)果為(286.27±18.43)μm[18],與本研究測量結(jié)果不一致,可能是測量儀器不同導(dǎo)致的。由于相同儀器測得食蟹猴視網(wǎng)膜形態(tài)和功能參數(shù)與健康人群的數(shù)值非常接近,考慮到食蟹猴價格昂貴、倫理受限、數(shù)量有限,在體研究中相同儀器所檢測的健康人群數(shù)據(jù)具有一定的參考價值。

本研究實測結(jié)果與既往文獻研究結(jié)果進行比較結(jié)果顯示,食蟹猴視網(wǎng)膜參數(shù)與人視網(wǎng)膜相近。雖然食蟹猴納入的樣本數(shù)量有限,但本研究結(jié)果顯示各食蟹猴個體之間的差異非常小,且測量結(jié)果與人的研究報道非常相近,說明采用非人靈長類視網(wǎng)膜的藥物研究有重要參考價值,可以節(jié)省大量動物的使用。本研究側(cè)重于對成年食蟹猴視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)的測量,而未對角膜及其他眼科參數(shù)進行測量。已有研究表明,非人靈長類動物的角膜水平和垂直直徑、中央角膜厚度、眼軸長度等測量值與人類有差異,但在角膜垂直和水平直徑的比率、角膜曲率半徑和眼軸長度的變化規(guī)律方面與人類相近[26-27]。

本研究為正常成年食蟹猴視網(wǎng)膜厚度、RNFL厚度、視盤參數(shù)和視覺電生理等視網(wǎng)膜生物學(xué)參數(shù)提供參考數(shù)據(jù),并發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)與正常人群視網(wǎng)膜實測值非常相近,證明食蟹猴是臨床前研究眼底疾病的理想實驗動物。應(yīng)用食蟹猴的實驗研究可以參考健康人群的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明廖科人:直接參與實驗和撰寫文章;彭斌、鄭紅梅、劉一帆:輔助分析;沈吟:醞釀、設(shè)計實驗和文章修改