孔海軍,張 亮,熊 偉,諶曉安

《中國吸煙危害健康報(bào)告2020》顯示,我國吸煙人群已超過3億,每年由吸煙造成的死亡病例超過100萬以上,吸煙已成為危害公共健康的重大隱患[1]。尼古丁是煙草制品中的主要成分,具有較強(qiáng)的毒性和成癮性,長期吸煙或攝入尼古丁可能導(dǎo)致機(jī)體白細(xì)胞介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothlial growthfactor,VEGF)等血管生成因子,以及纖維化介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的增殖[2]。尼古丁能導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶系統(tǒng)的激活,抑制谷胱甘肽等抗氧化途徑,并誘導(dǎo)肝臟自由基脂質(zhì)過氧化、肝星狀細(xì)胞活化和系膜細(xì)胞活化[3]等。隊(duì)列研究顯示,與不吸煙者比較,長期吸煙者的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)等肝代謝酶水平明顯升高[4]。黃小溪等[5]的研究發(fā)現(xiàn),長期的香煙煙霧暴露會(huì)導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞變性、細(xì)胞浸潤、門周纖維化、肝實(shí)質(zhì)退化以及中央和門靜脈充血等。此外,亦有多項(xiàng)研究證實(shí)了尼古丁攝入或長期吸煙與肝細(xì)胞壞死、肝組織損傷有一定的關(guān)聯(lián)性[6]。

尼古丁通過炎癥和細(xì)胞凋亡途徑,如,NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)等的全身效應(yīng)作用于心血管系統(tǒng),從而形成多器官影響效應(yīng)[7]。有研究發(fā)現(xiàn),核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶1(Heme Oxygenase-1,HO-1)/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-1ike ECH-associated protein l,Keap1)通路通過轉(zhuǎn)導(dǎo)NLRP3和Caspase-3信號(hào)分子調(diào)節(jié)肝組織脂質(zhì)過氧化、自由基損傷和內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。Sudhir Chowdhry等的研究發(fā)現(xiàn),Nrf2活性受損可能是導(dǎo)致急、慢性肝損傷向肝纖維化演變的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。大量研究也報(bào)道了運(yùn)動(dòng)對(duì)非酒精性脂肪肝或化學(xué)物質(zhì)(如,CCl4、D-氨基半乳糖等)致肝損傷的保護(hù)效應(yīng),運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善肝臟損傷的機(jī)制主要是通過激活肝細(xì)胞自噬和清除過剩氧化物,進(jìn)而減輕肝細(xì)胞凋亡、組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[9]。但現(xiàn)階段,尚缺乏運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁致肝損傷保護(hù)作用的直接證據(jù)?；诖?本研究旨在構(gòu)建尼古丁脅迫(Nicotine stress,NS)模型,通過游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù),驗(yàn)證Nrf2/HO-1/Keap1通路在NS大鼠肝代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化蛋白中的具體作用,為運(yùn)動(dòng)干預(yù)在NS致肝損傷的康復(fù)治療中提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

40只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SYXK(新)2016-0002。實(shí)驗(yàn)室條件適應(yīng)性飼養(yǎng)3 day后隨機(jī)分組,分別為假手術(shù)組(Sham組,n=10)、游泳運(yùn)動(dòng)組(Ex組,n=10)、尼古丁脅迫組(NS組,n=10)及尼古丁脅迫+游泳運(yùn)動(dòng)組(NS+Ex組,n=10)。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器有大鼠恒溫泳池(上海軟隆科技公司)、KH-Q330全自動(dòng)組織切片機(jī)(湖北闊海醫(yī)療科技公司)、TE2000-U顯微圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)、imark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)、5424R高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司)、AlphaImager EP凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)、Gene Pulser Xcell電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、170-3930蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、Eppendorf紫外分光光度計(jì)(德國艾本德公司)、SCIEX Triple TOF?4600 AB ACQUITY液相色譜系統(tǒng)(美國AB公司)和Micromass Quattro Micro API質(zhì)譜儀(美國AB公司)。

試劑方面,尼古丁購自美國Sigma公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司;Trizol總RNA抽提試劑、cDNA合成試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒、dNTP Mixture、Taq PCR MasterMix、免疫組織化學(xué)染色及DAB試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;cDNA引物Oligo購自上海生工生物工程股份有限公司;α-SMA、SMAD3、Caspase-3和NLRP3抗體購自Proteintech公司;Nrf2、NQO-1、HO-1、Keap-1和β-Actin抗體購自Abcam公司;Bax、Bcl-2和NF-kB抗體購自Thermo Fisher公司。

1.3 尼古丁脅迫模型及運(yùn)動(dòng)方案

首先,NS組和NS+Ex組大鼠接受尼古丁腹腔注射(2.5 mg/kg·bw/d),連續(xù)4周,滅菌注射用水配置尼古丁所需濃度;Sham組和Ex組不接受腹腔藥物給藥,正常飼養(yǎng)。其次,尼古丁脅迫模型建立后,Ex組和NS+Ex組大鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,3 d,1次/d,15 min/次;Sham組和NS組不接受運(yùn)動(dòng)干預(yù),正常飼養(yǎng)。再者,適應(yīng)性游泳訓(xùn)練后,Ex組和NS+Ex組進(jìn)行連續(xù)8周的自由游泳運(yùn)動(dòng):(1)1～2周:2次/d,20 min/次;(2)3～4周:2次/d,25 min/次;(3)5～8周:2次/d,30 min/次。Sham組及NS組大鼠保持正常飼養(yǎng)及自由活動(dòng),不參與游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案。

1.4 樣本采集

末次游泳運(yùn)動(dòng)后的次日,麻醉、尾靜脈取血,全血室溫自凝45 min,4 ℃、2 000 r/min離心10 min,取上清即為血清;迅速取肝臟,稱取1 g肝臟加入PBS勻漿介質(zhì),1 500 r/min勻漿30 s,勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管,4 ℃、6 000 r/min,離心10 min,取上清于-80 ℃保存。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

分別取肝組織勻漿液和血清,采用試劑盒法檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.6 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色

取大鼠肝組織,制作切片并脫蠟、復(fù)水,蘇木素-伊紅染色后,鏡下觀察,切片中心視野采集圖像。經(jīng)抗原修復(fù),分別加抗α-SMA抗體(1∶300)和抗SMAD3抗體(1∶400),4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液清洗,二抗孵育,按照DAB顯色試劑盒流程進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.7 LC-MS法檢驗(yàn)

1.8 RT-PCR法檢測

取200 μL肝組織勻漿液,采用Trizol法提取組織液總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測mRNA相對(duì)表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系(20 μL)分別為cDNA模板1 μL、ddH2O 7 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix10 μL,條件為95 ℃初始變性55 s;然后在95 ℃變性10 s,57 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 目標(biāo)基因引物序列表

1.9 Western Blot檢測蛋白表達(dá)量

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示,兩樣本平均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)分析,多樣本平均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),組間比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝重、肝系數(shù)及肝功能

與Sham組比較,NS組和NS+Ex組大鼠肝系數(shù)和肝組織ALT、AST和ALP水平顯著上升(P<0.05);Ex組ALT水平顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝系數(shù)和肝組織ALT、AST和ALP水平顯著降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肝重、肝系數(shù)及肝功能指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Liver weight, liver coefficient and liver function indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠血清和肝組織氧化應(yīng)激

與Sham組比較,NS組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著上升,SOD和GSH-px水平顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著上升,肝組織SOD顯著降低(P<0.05);Ex組血清、肝組織GSH-px和肝組織MDA、SOD水平顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠血清和肝組織MDA水平顯著降低,SOD和GSH-px水平顯著上升(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠血清和肝組織氧化應(yīng)激統(tǒng)計(jì)表

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NS大鼠血清和肝組織炎癥因子的影響

與Sham組比較,NS組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平統(tǒng)計(jì)表

2.4 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)特征

圖1 各組大鼠肝組織HE染色圖(200×)Figure 1 HE staining of rat liver tissues in each group (200×)

Sham組和Ex組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列整齊,肝竇清晰連續(xù)且無壞死區(qū)域。其中,NS組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)深染,肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)不清晰,出現(xiàn)大量壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤,肝損傷明顯;NS+Ex組大鼠肝組織壞死灶減少,炎性細(xì)胞浸潤減輕,肝結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常,肝組織損傷減輕(見圖1)。

2.5 各組大鼠肝組織代謝組學(xué)

通過Met PA通路富集分析各組大鼠肝組織代謝通路,結(jié)果表明,游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)NS大鼠肝組織代謝影響度較高的通路包括甘氨酸和蘇氨酸代謝通路、抗壞血酸和藻酸鹽代謝通路、花生四烯酸代謝通路、α-亞油酸代謝通路和甘油酯代謝通路等(見表5)。

表5 肝組織代謝通路Met PA分析表

2.6 各組大鼠肝組織纖維化蛋白表達(dá)

與Sham組比較,NS組和NS+Ex組大鼠肝組織α-SMA和SMAD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織α-SMA陽性細(xì)胞顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織α-SMA和SMAD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織α-SMA、SMAD3免疫組織化學(xué)染色圖Figure 2 Immunohistochemical staining of α-SMA and SMAD3 in liver tissue of rats in each group

2.7 各組大鼠肝組織炎癥反應(yīng)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3和NF-кB蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);NS組大鼠肝組織Bax和NLRP3蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3和NF-кB蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3和NF-кB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)(見圖3)。

2.8 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1和Keap-1 mRNA表達(dá)

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),Keap-1 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05),Keap-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Keap-1 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),Keap-1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖4)。

圖4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1和Keap-1 mRNA表達(dá)圖Figure 4 mRNA expression of Nrf2,HO-1 and Keap-1 in liver tissues of rats in each group

2.9 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與Sham組比較,NS組大鼠肝組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Keap-1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);Ex組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),Keap-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Keap-1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。與NS組比較,NS+Ex組大鼠肝組織Nrf2、NQO-1和HO-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),Keap-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖5)。

圖5 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路相關(guān)蛋白表達(dá)圖Figure 5 Expression of Nrf2/HO-1/Keap1 pathway related proteins in liver tissue of rats in each group

3 討 論

3.1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁脅迫大鼠炎癥反應(yīng)和肝功能的影響

肝臟是負(fù)責(zé)清除或轉(zhuǎn)化藥物、酒精和其他有害物質(zhì)的重要器官。流行病學(xué)證據(jù)顯示,吸煙或尼古丁攝入會(huì)增加慢性乙型、丙型肝炎病毒患者肝纖維化和原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)的風(fēng)險(xiǎn),并降低抗病毒藥物的治療效果[10]。隊(duì)列研究顯示,長期吸煙者罹患上呼吸道感染的幾率顯著高于非吸煙者[11]。尼古丁通過抑制核糖核苷酸還原酶和T細(xì)胞抗原信號(hào)干擾抗體的形成,從而阻礙T淋巴細(xì)胞的分化和增殖。此外,尼古丁通過增強(qiáng)Fas/CD95死亡受體表達(dá)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1)表達(dá)上升,并造成NK細(xì)胞活性受損[12]。體育運(yùn)動(dòng)尤其是有氧運(yùn)動(dòng)可以參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié),有研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)通過激活T細(xì)胞抗原介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和核糖核苷酸還原酶,促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化[13]。此外,有氧運(yùn)動(dòng)被證實(shí)可以下調(diào)Fas/CD95死亡受體表達(dá)抑制淋巴細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制TNF-α、IL-6和IL-1等促炎細(xì)胞因子的生成[14]。本研究也觀察到類似的現(xiàn)象,游泳運(yùn)動(dòng)有效抑制了NS造成的肝臟氧化應(yīng)激激活和炎癥反應(yīng)。

肝功能是反映機(jī)體肝損傷的金標(biāo)準(zhǔn),常采用肝臟代謝酶水平進(jìn)行評(píng)估。Wannamethee等[15]的研究表明,在調(diào)整年齡、性別、BMI、酒精和咖啡飲用量等多變量風(fēng)險(xiǎn)后,吸煙者的血清總蛋白和白蛋白水平顯著降低,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)水平顯著上升。因此,吸煙或尼古丁攝入無疑是肝損傷進(jìn)展中未被充分認(rèn)識(shí)的病理學(xué)因素。肝系數(shù)上升是肝損傷或纖維化的早中期特征,這可能與肝組織水腫、充血或增生肥大等病理現(xiàn)象有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),4周高劑量尼古丁注射后,大鼠肝系數(shù)顯著上升,提示肝組織可能出現(xiàn)水腫或纖維化增生,病理學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)肝組織出現(xiàn)大量壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤。分析認(rèn)為,可能是高劑量尼古丁提高了肝組織工作負(fù)擔(dān)、尼古丁的直接毒性作用合并誘發(fā)了肝組織損傷和結(jié)構(gòu)性增生。目前,尚缺乏運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁誘導(dǎo)肝損傷的干預(yù)研究,但部分間接證據(jù)顯示,運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效改善心肌梗死、高強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)和糖尿病等誘導(dǎo)的肝功能異常[16]。有研究發(fā)現(xiàn),7周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以顯著降低酒精性肝損傷小鼠血清和肝組織AST、ALT和MDA水平[17]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),有氧運(yùn)動(dòng)顯著降低了心肌梗死小鼠血清AST、ALP和ALT活性[18]。本研究也發(fā)現(xiàn),8周游泳運(yùn)動(dòng)可以顯著降低NS大鼠肝組織ALT、AST和ALP水平,說明有氧運(yùn)動(dòng)可以有效緩解NS誘導(dǎo)的肝損傷進(jìn)程。

3.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁脅迫大鼠肝臟代謝功能的影響

肝損傷中常常會(huì)觀察到肝功能異常和相關(guān)代謝紊亂,為了確定NS誘導(dǎo)肝損傷的代謝學(xué)特征,本研究對(duì)其肝組織代謝組學(xué)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,NS導(dǎo)致大鼠肝組織差異代謝物出現(xiàn)顯著擾動(dòng)現(xiàn)象,甘氨酸和蘇氨酸、抗壞血酸和藻酸鹽、花生四烯酸等肝損傷標(biāo)志物表達(dá)下降;而游泳運(yùn)動(dòng)通過逆轉(zhuǎn)差異代謝物擾動(dòng)并上調(diào)甘氨酸和蘇氨酸、抗壞血酸和藻酸鹽、花生四烯酸等肝損傷標(biāo)志物,從而減輕了NS誘導(dǎo)的肝損傷。有研究認(rèn)為,甘氨酸和蘇氨酸代謝受損與諸多肝臟疾病誘導(dǎo)的肝損傷密切相關(guān)[19]。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者和小鼠肝組織甘氨酸生物合成基因丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶1(Alanine-glyoxylate aminotransferase 1,AGXT1)被顯著抑制[20]。甘氨酸參與構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鏈,同時(shí)調(diào)控谷胱甘肽合成和單碳代謝,在肥胖、2型糖尿病和NAFLD相關(guān)的代謝紊亂中,肝組織甘氨酸水平呈下降趨勢。臨床研究表明,補(bǔ)充甘氨酸可以對(duì)肝臟代謝產(chǎn)生有益效果[21]。尼古丁可能通過腸道—肝臟代謝軸影響體內(nèi)甘氨酸代謝,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示,尼古丁注射小鼠腸道、肝組織內(nèi)甘氨酸、絲氨酸和天冬氨酸水平降低[22]。有學(xué)者認(rèn)為[23],尼古丁誘導(dǎo)肝臟甘氨酸代謝失衡的機(jī)制包括:(1)尼古丁的毒性作用造成腸道微循環(huán)障礙,腸道甘氨酸吸收效率降低;(2)體內(nèi)甘氨酸生物合成效率下降;(3)甘氨酸分解代謝或尿液排泄速率上升。本研究游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,NS誘導(dǎo)肝損傷甘氨酸和蘇氨酸代謝效率顯著上升,表明游泳運(yùn)動(dòng)可以顯著改善大鼠NS誘導(dǎo)肝損傷甘氨酸和蘇氨酸代謝的能力。

3.3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁脅迫大鼠肝組織纖維化和細(xì)胞凋亡的影響

研究認(rèn)為,長期吸煙、煙霧暴露或尼古丁攝入可以誘導(dǎo)肝組織纖維化[24]。肌成纖維細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié),α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3(Mothers against decapentaplegic homolog 3,SMAD3)的激活與轉(zhuǎn)化是肌成纖維細(xì)胞活化的主要來源,因而成為纖維化診斷和治療的靶點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)作為細(xì)胞的重要保護(hù)機(jī)制,參與調(diào)節(jié)Nrf2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、核因子NF-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和c/EBP同源蛋白等多種細(xì)胞因子,在炎癥過程、細(xì)胞防御性氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著調(diào)控作用[25]。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)作為Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者,其激活在很大程度上依賴于NLRP3的釋放,而B淋巴細(xì)胞瘤(B-cell lymphoma,Bcl)家族中的Bcl-2和Bax基因是目前已知的細(xì)胞凋亡中最重要的調(diào)控基因,可以通過線粒體途徑介導(dǎo)NLRP3等物質(zhì)的釋放[26]。Bax不僅作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制參與對(duì)Caspase-3活性的調(diào)節(jié),還可作為Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3下游,二者在細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)過程中既相互聯(lián)系又相互制約。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁腹腔注射4周后,大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、NF-кB蛋白表達(dá)和α-SMA、SMAD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低,表明NS導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡反應(yīng)激活,肝組織纖維化水平上升,且NS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡反應(yīng)可能是肝損傷的內(nèi)源性因素。有研究證實(shí),有氧運(yùn)動(dòng)可以發(fā)揮損傷組織凋亡調(diào)控的作用。如,有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)均可以有效地抑制糖尿病脂肪肝大鼠肝臟ERS及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27]。亦有部分研究證實(shí),有氧運(yùn)動(dòng)可以有效抑制煙霧刺激和低氧暴露誘導(dǎo)的ERS和肝組織凋亡反應(yīng)[28]。本研究發(fā)現(xiàn),游泳運(yùn)動(dòng)顯著降低了NS大鼠肝組織Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、NF-кB蛋白表達(dá)和α-SMA、SMAD3陽性細(xì)胞數(shù)量,顯著提高了Bax蛋白表達(dá)。提示游泳運(yùn)動(dòng)可能通過抑制ERS調(diào)控的炎癥過程和細(xì)胞凋亡,減輕NS大鼠肝組織損傷。

3.4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)尼古丁脅迫大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路的影響

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),在氧化還原平衡、代謝和炎癥反應(yīng)應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[29]。有研究表明,在氧化應(yīng)激及其他有害刺激作用下,腦、肝臟和腎臟等器官Nrf2表達(dá)上升[30]。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)、表觀遺傳學(xué)和磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)是調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)的三個(gè)關(guān)鍵途徑。Keap1在生理?xiàng)l件下通過E3連接酶誘導(dǎo)Nrf2泛素化,導(dǎo)致Nrf2被26S蛋白酶體分解,Nrf2從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的易位被抑制[31]。血紅素氧合酶1(HO-1)和醌NADH脫氫酶1(Recombinant NADH Dehydrogenase, Quinone 1,NQO-1)是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶,具有抗炎和抗氧化作用,同時(shí)參與調(diào)節(jié)Nrf2-ARE抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)[32]。然而,Nrf2與HO-1和NQO-1相互作用的機(jī)制仍不清楚。但多項(xiàng)研究證實(shí),長期煙霧暴露或尼古丁攝入導(dǎo)致動(dòng)物肝組織Nrf2、HO-1、NQO-1基因和蛋白表達(dá)降低,繼而調(diào)節(jié)多個(gè)下游靶基因表達(dá),因此,可以認(rèn)為Nrf2是多種肝臟疾病肝組織損傷的生物靶點(diǎn)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),NAFLD大鼠肝組織Nrf2基因表達(dá)下調(diào)顯著加劇了其纖維化進(jìn)程,相反,特異性敲除Keap1基因后,大鼠Nrf2的表達(dá)增強(qiáng),蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的脂肪肝癥狀減輕[33]。本研究結(jié)果表明,NS誘導(dǎo)大鼠肝組織Nrf2、NQO-1、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Keap-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升,表明尼古丁注射導(dǎo)致大鼠肝組織Nrf2/HO-1/Keap1通路活性被抑制。有證據(jù)表明,運(yùn)動(dòng)參與了肝組織Nrf2調(diào)節(jié),即,有氧運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)肝臟纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Nrf2表達(dá)[34]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),8周跑臺(tái)訓(xùn)練方案后,NAFLD大鼠肝臟Nrf2轉(zhuǎn)錄活性增加,HO-1蛋白表達(dá)上升,肝組織凋亡介質(zhì)表達(dá)顯著降低[35]。Nrf2激活誘導(dǎo)HO-1活化也可以在抗炎機(jī)制中發(fā)揮作用,HO-1可以顯著降低肝臟、腦和腎臟等多個(gè)器官中NF-κB和NLRP3活性,同時(shí)降解炎癥介質(zhì)。說明規(guī)律運(yùn)動(dòng)可以通過激活Nrf2/HO-1通路活性減輕肝臟炎癥損傷和細(xì)胞凋亡,但遺憾的是,運(yùn)動(dòng)激活Nrf2/HO-1的具體機(jī)制尚不清楚。因此,可以認(rèn)為游泳運(yùn)動(dòng)通過激活Nrf2/HO-1/Keap1通路活性,抑制NS誘導(dǎo)的肝組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

4周尼古丁腹腔注射(2.5 mg/kg·bw/d)可以誘導(dǎo)大鼠肝組織損傷;游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能通過調(diào)控尼古丁脅迫大鼠肝組織纖維化和Nrf2/HO-1/Keap1通路活性抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)肝組織代謝,進(jìn)而減輕大鼠肝組織損傷。