孫潔 查秀芳 徐瑾 趙君寧 何偉 張楠楠

胃癌(GC)為僅次于肺癌和結(jié)直腸癌(死亡率分別為18.4%和9.3%)的第三大癌癥相關(guān)的死因[1]。大多數(shù)GC病人早期無特異性癥狀,因此確診時(shí)多已進(jìn)展至晚期GC。盡管目前早期GC治療的成功率有所提高,但晚期GC病人預(yù)后仍較差,其5年生存率<20%[2]。腫瘤微環(huán)境(TME)的結(jié)構(gòu)成分主要包括基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。AHNAK也稱橋粒蛋白,最初被認(rèn)為是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞類型中的一種大分子腫瘤相關(guān)核蛋白,在血腦屏障形成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遷移、心臟鈣通道調(diào)節(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種過程中發(fā)揮重要作用[3]。腫瘤免疫治療是繼靶向治療的另一種具有巨大潛力的治療策略,而TME是影響免疫治療反應(yīng)的重要因素,結(jié)合TME中多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的新型免疫療法將可能改善GC病人的預(yù)后[4]。然而,AHNAK在GC預(yù)后中的作用及與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系尚不明確。本研究通過生物信息數(shù)據(jù)庫,分析GC組織中AHNAK的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平之間的關(guān)系以及其對GC病人預(yù)后的預(yù)測作用,為GC的診斷、預(yù)后評估、腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1AHNAK表達(dá)水平分析 利用UALCAN[5](http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)比較AHNAK基因在GC組織與正常組織中的表達(dá)水平。UALCAN是一個(gè)基于TCGA數(shù)據(jù)庫的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析和挖掘的網(wǎng)站工具,可對研究的癌癥查看整體的基因表達(dá)情況,獲得基因表達(dá)熱圖,并且對相關(guān)基因進(jìn)行鑒定、表達(dá)譜分析、生存分析以及亞組分析等。

1.2 腫瘤免疫細(xì)胞浸潤評估 使用TIMER 2.0[6](http://timer.cistrome.org/)分析AHNAK的表達(dá)水平與GC免疫細(xì)胞浸潤水平及免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性。TIMER數(shù)據(jù)庫主要采用RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù),其中,免疫細(xì)胞主要包括以下6種細(xì)胞:B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。

1.3 GC病人的生存分析 根據(jù)AHNAK表達(dá)水平的中位數(shù)將GC病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用Kaplan-Meier Plotter[7](http://kmplot.com/analysis/)分析AHNAK不同表達(dá)水平對總生存期(OS)的影響。下載TCGA數(shù)據(jù)庫中GC病人的相關(guān)臨床資料,分析不同臨床特征對GC病人預(yù)后的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用log-rank檢驗(yàn)比較2組生存曲線間的差異;各指標(biāo)間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析;采用Cox回歸分析可能影響GC病人預(yù)后的因素。使用RMS包將影響預(yù)后的相關(guān)因素構(gòu)建預(yù)測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖,并進(jìn)行校準(zhǔn)分析與可視化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AHNAK在GC病人中的表達(dá)情況 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示,與正常組織相比,AHNAK在GC組織中低表達(dá)(P<0.05),見圖1A;進(jìn)一步對GC病人的年齡進(jìn)行分組,結(jié)果顯示,41～60歲、61～80歲、81～100歲GC病人的AHNAK表達(dá)量明顯低于正常組織(P<0.01),且41～60歲及61～80歲GC病人的AHNAK表達(dá)量高于81～100歲GC病人(P<0.05),見圖1B。

注:A:AHNAK在GC組織與正常組織的表達(dá)情況比較;B:AHNAK在不同年齡GC病人中的表達(dá)情況比較;TPM:transcript per million。圖1 AHNAK在GC病人中的表達(dá)情況

2.2AHNAK與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系以及二者對GC病人OS的影響 TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,AHNAK表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤水平均存在相關(guān)性(P<0.05),見圖2A;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),高巨噬細(xì)胞浸潤水平的GC病人的OS更短(P=0.004),其他免疫細(xì)胞浸潤水平對GC病人的OS無顯著影響(P均>0.05),見圖2B。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示,AHNAK低表達(dá)的GC病人的OS更短(P<0.01,圖2C)。

注:A:AHNAK與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)分析;B:不同免疫細(xì)胞浸潤水平與GC病人預(yù)后的Kaplan-Meier曲線(藍(lán)線為低浸潤水平,紅線為高浸潤水平);C:不同AHNAK表達(dá)水平病人預(yù)后的Kaplan-Meier曲線。圖2 AHNAK與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系及二者對GC預(yù)后的影響

2.3AHNAK與不同分化類型巨噬細(xì)胞浸潤及其標(biāo)記物之間的關(guān)系 TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,AHNAK的表達(dá)水平與M2型巨噬細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)(P<0.001)與M1型巨噬細(xì)胞浸潤水平無關(guān)(P=0.204),見圖3A;進(jìn)一步分析AHNAK與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,AHNAK表達(dá)水平與RAI14、PCOLCE2、CTSK、MS4A4A、CD163、VSIG4基因表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.001),見圖3B。

注：A:AHNAK與不同分化類型巨噬細(xì)胞浸潤的相關(guān)分析;B:AHNAK與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的相關(guān)分析。

2.4 Cox回歸分析不同臨床病理特征對GC病人預(yù)后的影響 將TCGA數(shù)據(jù)庫中GC病人的相關(guān)資料與預(yù)后情況先進(jìn)行單因素Cox回歸分析,再將單因素Cox回歸分析中P<0.1的因素納入多因素回歸分析,結(jié)果顯示,N分期、M分期、AHNAK表達(dá)水平、年齡是GC病人預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表1。

表1 Cox回歸分析不同臨床病理特征對GC病人預(yù)后的影響

2.5 預(yù)測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖及校準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 將N分期、M分期、年齡、AHNAK表達(dá)水平納入RMS包構(gòu)建預(yù)測GC病人1年、3年、5年生存概率的列線圖,見圖4A。圖4B為列線圖的校準(zhǔn)曲線,圖中的偏差修正線接近理想曲線,表明預(yù)測值與觀測值之間具有良好的一致性。

注：A:預(yù)測GC病人1、3、5年生存概率的列線圖;B:預(yù)后校準(zhǔn)圖驗(yàn)證列線圖的預(yù)測效果。

3 討論

GC是我國最常見的癌癥之一,早期診斷GC有治愈可能,但晚期GC多已表現(xiàn)為廣泛浸潤和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[8]。TME是圍繞腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)復(fù)雜環(huán)境,包括各種免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、信號分子和血管。腫瘤免疫細(xì)胞浸潤是影響癌癥發(fā)展和治療的關(guān)鍵因素,其中,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,其與癌癥轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后有關(guān)[9]。研究表明,M2型巨噬細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移方面具有不同的功能[10]。因此,深入了解不同巨噬細(xì)胞分化類型在TME中的潛在分子機(jī)制及其對腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響,對探索新的診斷方法和治療靶點(diǎn)非常重要。

近年來,多項(xiàng)研究表明,AHNAK在不同類型的癌癥中發(fā)揮不同的作用。有研究發(fā)現(xiàn),AHNAK2基因在肺腺癌腫瘤組織中顯著過表達(dá),是肺腺癌病人的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。本研究通過對權(quán)威數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,AHNAK在GC組織中低表達(dá),且41～60歲及61～80歲GC病人的AHNAK表達(dá)量高于81～100歲GC病人(P<0.05),提示年齡與GC病人AHNAK的表達(dá)密切相關(guān),且高齡老年人的AHNAK表達(dá)量較低。

研究表明,AHNAK的表達(dá)與活化B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān),與CD4+T細(xì)胞、TAM、M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)[11]。本研究免疫浸潤分析結(jié)果顯示,AHNAK的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤水平均存在相關(guān)性,其中高巨噬細(xì)胞浸潤水平與GC病人較差的預(yù)后相關(guān);此外,AHNAK表達(dá)水平與M2型巨噬細(xì)胞中的RAI14、PCOLCE2、CTSK、MS4A4A、CD163、VSIG4標(biāo)記性基因的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.001),從而進(jìn)一步提示AHNAK可能通過影響M2型巨噬細(xì)胞浸潤改變TAM,并影響GC進(jìn)展。

本研究多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,年齡>65歲、AHNAK低表達(dá)、高NM分期為GC病人預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,此外,利用上述危險(xiǎn)因素構(gòu)建的預(yù)測GC病人預(yù)后的列線圖,其預(yù)后校準(zhǔn)圖提示預(yù)測值與觀測值具有較好的一致性。綜合以上數(shù)據(jù)表明,AHNAK可作為預(yù)測GC病人OS有價(jià)值的生物標(biāo)志物,且在>65歲的老年病人中具有重要的預(yù)后價(jià)值,可作為輔助臨床診療的參考依據(jù)。

本研究存在一定的局限性。首先,本文是通過使用公共數(shù)據(jù)庫的回顧性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和驗(yàn)證的,因此,未來仍需要前瞻性的臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證其臨床實(shí)用性。其次,由于數(shù)據(jù)信息有限,未能進(jìn)行更為詳細(xì)的亞組分析,將來需收集更為詳細(xì)的數(shù)據(jù)以便進(jìn)行深入分析?？傊?AHNAK的表達(dá)水平與GC病人預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān),AHNAK可能在免疫細(xì)胞浸潤中發(fā)揮重要作用,可作為預(yù)測老年GC病人預(yù)后的候選標(biāo)志物。