劉 鑫,向 陽, 2,央金措,秦保亮,肖晨冬,潘 瑤,袁東波,郝力力

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院,成都 610041;2.鹽亭縣高端人才服務中心,四川 鹽亭 621600;3.爐霍縣動物疾病預防控制中心,四川 爐霍 626500;4.新鄉(xiāng)市動物疫病預防控制中心,河南 新鄉(xiāng) 453000;5.鄉(xiāng)城縣動物疾病預防控制中心,四川 鄉(xiāng)城 627850;6.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學研究所,四川 康定 626000;7.四川省動物疫病預防控制中心,成都 610041)

【研究意義】蜱是一類重要的醫(yī)學媒介生物,主要以吸取宿主的血液和淋巴液為食,能寄生于多種脊椎動物,呈全球性分布。作為僅次于蚊的第二大媒介生物,蜱不僅可引起宿主貧血、消瘦和過敏,還可攜帶或傳播多種病原。斑點熱群立克次體(Spotted fever groupRickettsia,SFGR)和無形體(Anaplasma)均屬于專性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌,主要通過蜱、蚤、螨等媒介生物傳播,在公共衛(wèi)生學上具有重要意義[1]?！厩叭搜芯窟M展】目前,從蜱中分離出的病原已超過200種,其中在中國報道的蜱傳病原已超過35種[2-4]。1940—2004年期間報道的人類傳染病中,60.0%以上都是人獸共患病。在這些人獸共患病中,有71.8%來源于野生動物,其中22.8%通過媒介生物傳播,導致全球人獸共患病的發(fā)病率、死亡率和治療成本顯著增加[5]。研究表明,在過去10年中,經(jīng)媒介生物傳播的人獸共患病數(shù)量呈現(xiàn)增長態(tài)勢[4]?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)外屢有蜱傳SFGR和無形體感染人和動物的報道,本研究前期從四川省石渠縣[6]、若爾蓋縣[7]、九龍縣[8]等多個地區(qū)采集的蜱中均檢出SFGR和無形體。爐霍縣位于青藏高原東南緣,平均海拔3860 m,養(yǎng)殖業(yè)是當?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)之一。爐霍縣牦牛的養(yǎng)殖方式粗放,蜱在當?shù)仞B(yǎng)殖的牦牛中廣泛存在。截止目前,有關(guān)爐霍縣蜱的種類、分布及其攜帶病原的研究資料匱乏。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以爐霍縣牦牛源寄生蜱為研究對象開展調(diào)查,以期初步掌握爐霍縣蜱的種類及其攜帶SFGR和無形體的情況,為當?shù)仳鐐魅双F共患病防控和牦牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021年3—8月,分別在四川省爐霍縣雅德鄉(xiāng)、斯木鄉(xiāng)、仁達鄉(xiāng)、旦都鄉(xiāng)、泥巴鄉(xiāng)和宜木鄉(xiāng)6個鄉(xiāng)的416頭牦牛體表采集蜱,采樣點見圖1。在各鄉(xiāng)選3～4村,各村選2～4個農(nóng)場,從每頭牦牛的體表采集5～6只蜱。按照地點分別裝入采集管中,塞入潮濕脫脂棉,經(jīng)形態(tài)學鑒定后將蜱浸于75%乙醇溶液,置4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要試劑及儀器

組織基因組DNA提取試劑盒(Easypure Genomic DNA Kit)、Trans 2K DNA marker、1 × TAE溶液和瓊脂糖購自北京全式金公司,1.1 × T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物有限公司;引物合成與測序均由生工生物工程技術(shù)服務有限公司(成都公司)完成。主要儀器包括：德國徠卡體式顯微鏡(Leica S9D)、多功能生物樣品均質(zhì)器(Bertin Precelly 24)、賽默飛微量離心機(Pico 17)、德國耶拿Biometra TRIO三槽PCR儀(Biometra TRIO 48)、北京六一儀器廠電泳儀(DYY-6C)、全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200 Multi)。

圖1 爐霍縣樣本采集點Fig.1 Sampling locations in Luhuo county

1.3 蜱形態(tài)學鑒定

根據(jù)《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》[9],在體視顯微鏡下觀察蜱形態(tài)特征并拍照保存。

1.4 DNA提取

取出保存在75%乙醇溶液中的蜱,用無菌去離子水沖洗3次。待干燥后延蜱縱向中軸線將其切為兩半,分別裝入1.5 mL EP管。半只置于-80 ℃冰箱凍存,另外半只加入500 μL無菌水于Bertin Precelly 24研磨器進行充分研磨,研磨程序：每管加入陶瓷珠(直徑0.5 mm的20珠和2 mm的5珠),5500 r/min研磨2次;4000 r/min研磨1次。取研磨液200 μL,根據(jù)Easypure Genomic DNA Kit試劑盒使用說明書提取蜱基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR檢測

蜱的分子鑒定采用Muhanguzi等[10]報道的方法,SFGR OmpB基因的PCR檢測采用Oteo等[11]報道的方法,無形體16S rRNA基因的PCR檢測采用Han等[12]報道的方法,引物信息見表1。4對引物擴增的總體積均為25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板1 μL混勻。蜱鑒定、SFGR和無形體的PCR擴增均設(shè)有陰性對照(ddH2O)和陽性對照,陽性對照分別為青海血蜱(Haemaphysalisqinghaiensisus)、勞氏立克次體(Rickettsiaraoultii)和綿羊無形體(Anaplasmaovis)DNA,均由實驗室保存。蜱ITS-2基因的擴增程序為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸96 s,35個循環(huán);72 ℃延伸8 min,16 ℃保溫。立克次體OmpB基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán);72 ℃延伸8 min,16 ℃保溫。無形體16S rRNA基因擴增程序為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性15 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸95 s/35 s,35個循環(huán);72 ℃延伸8 min,16 ℃保溫。

1.6 序列分析及統(tǒng)計分析

將所得PCR產(chǎn)物陽性產(chǎn)物全部送至生工生物工程(成都)有限公司進行測序。使用DNA Star V.7.1.0對所得序列進行拼接與分析,在NCBI中使用BLAST對序列進行比對,再使用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining(bootstrap值為1000)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,并以Kimura 2-parameter模型計算序列間的遺傳距離。使用卡方檢驗比較不同鄉(xiāng)和不同蜱種2類病原感染率之間的差異,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱采集數(shù)量及形態(tài)鑒定

在爐霍縣6個半農(nóng)半牧鄉(xiāng)共采集成蜱820只,具體信息見表2。其中青海血蜱29只,占3.5%(29/820);微小扇頭蜱791只,占96.5%(791/820)。微小扇頭蜱為爐霍縣半農(nóng)半牧地區(qū)的優(yōu)勢蜱種,在采樣點的6個鄉(xiāng)均有分布,青海血蜱僅存在于雅德鄉(xiāng)和旦都鄉(xiāng)。青海血蜱形態(tài)特征見圖2,微小扇頭蜱形態(tài)特征見圖3。

2.2 蜱的分子鑒定與遺傳進化分析

2.2.1ITS-2基因擴增 以1.4中提取的DNA為模板,擴增蜱ITS-2基因片段,部分樣本PCR產(chǎn)物電泳圖如圖4所示,片段大小為1200～1600 bp,與預期片段大小相符。

2.2.2ITS-2基因遺傳進化分析 將所得ITS-2基因PCR陽性產(chǎn)物全部進行測序,使用DNA Star軟件對所得序列進行拼接、兩兩比對后得到4條unique序列并提交到GenBank,分別命名為R.microplusSM11(OP542465)、H.qinghaiensisYD13(OP542466)、R.microplusSM19(OP542467)和H.qinghaiensisDd11(OP542468)。如圖5所示,OP542465和OP542467與R.microplus(JQ737124、KX450290)親緣關(guān)系最近,相似性分別為99.9%和100.0%;OP542466和OP542468的相似性為99.9%,與甘肅株H.qinghaiensis(HQ005302、JQ737119、JQ737115)親緣關(guān)系最近,聚于1支,相似性分別為97.9%和98.0%。

表1 PCR引物

表2 蜱采集信息

A： 雌蜱背面; B： 雌蜱腹面; C： 雄蜱背面; D： 雄蜱腹面。A： Female, dorsal view; B： Female, ventral view; C： Male, dorsal view; D： Male, ventral view.圖2 青海血蜱形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of H.qinghaiensis

A： 雌蜱背面; B： 雌蜱腹面; C： 雄蜱背面; D： 雄蜱腹面。A： Female, dorsal view; B： Female, ventral view; C： Male, dorsal view; D： Male, ventral view.圖3 微小扇頭蜱形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of R.microplus

M： DL 2000 marker; 1： 陽性對照; 2～5： 蜱樣本; 6： 陰性對照。M： DL2000 marker; 1： Positive control; 2-5： Tick samples; 6： Negative control.圖4 部分蜱樣本ITS-2基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR products of ITS-2 gene fragments in some tick samples

2.3 SFGR OmpB和無形體16S rRNA基因PCR擴增

以1.4中提取的蜱組織DNA為模板,分別擴增SFGROmpB和無形體16S rRNA基因片段,部分樣本PCR產(chǎn)物電泳圖如圖6所示,片段大小分別為618和426 bp,與預期片段大小相符。

2.4 SFGR OmpB基因遺傳進化分析

將所得OmpB基因PCR陽性產(chǎn)物全部進行測序,兩兩比對后得1條unique序列并提交到GenBank,將其命名為CandidatusR.longicorniiSM11(OP572258)。選取不同種的立克次體和BLAST比對后相似性最高的OmpB基因序列作為參考序列,以R.heilongjiangensis(MG545009)基因序列作為外群,使用MEGA 7.0軟件以Neighbor-Joining構(gòu)建進化樹。如圖7所示,OP572258與CandidatusR.longicornii(MN026546)親緣關(guān)系最近,相似性為100.0%。

2.5 無形體16S rRNA基因遺傳進化分析

將所得16S rRNA基因PCR陽性產(chǎn)物全部測序后得6條unique序列,上傳GenBank后得到序列號為OP550213～OP550218。如圖8所示,OP550213和OP550214與A.marginale(MK680807、MH020 201)親緣關(guān)系最近,相似性為100.0%;OP550218與A.phagocytophilum(KU321304、KJ782388)親緣關(guān)系最近,相似性均為99.2%;OP550215和OP550217與A.platys(MF289478)親緣關(guān)系最近,相似性均為100.0%;OP550216與A.bovis(JX092092、AY144 729)的相似性均為100.0%,與陜西分離株A.bovis(MH255938)的相似性為99.7%。

圖5 基于蜱ITS-2基因系統(tǒng)進化樹Fig.5 Neighbor joining (NJ) phylogenetic trees based on ITS-2 gene of ticks

M： DL2000 marker; 1： 陽性對照; 2～5： 蜱樣本; 6： 陰性對照。M： DL2000 marker; 1： Positive control; 2-5： Tick samples; 6： Negative control.圖6 部分樣本SFGR OmpB(A)和無形體16S rRNA(B)基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis of PCR products of SFGR OmpB (A) and amorphous 16S rRNA (B) genes in some samples

2.6 PCR檢測結(jié)果

在820份蜱樣本中,有408份被檢出SFGR,總陽性率為49.8%(408/820)(表3)。在本次調(diào)查的6個鄉(xiāng)均檢出了SFGR,感染率為15.9%～65.0%。其中泥巴鄉(xiāng)的感染率最高,為65.0%(65/100);旦都鄉(xiāng)的感染率最低,為15.9%(10/63)。經(jīng)χ2檢驗,不同鄉(xiāng)的蜱樣本SFGR感染率之間的差異極顯著(χ2=111.524,P=0.000<0.01)。青海血蜱和微小扇頭蜱的SFGR感染率分別為44.8%(13/29)和49.9%(395/791)(表4)。經(jīng)χ2檢驗,不同蜱種SFGR感染率之間的差異不顯著(χ2=0.292,P=0.589>0.5)。

本次調(diào)查共有253只蜱被檢出無形體,總感染率為30.9%(253/820)(表3)。本次調(diào)查的6個鄉(xiāng)中有5個鄉(xiāng)檢出無形體,感染率為0%～60.0%。其中泥巴鄉(xiāng)的感染率最高,為60.0%(60/100);雅德鄉(xiāng)的感染率最低,為0%(0/114)。經(jīng)χ2檢驗,不同鄉(xiāng)的蜱樣本無形體感染率之間的差異極顯著(χ2=139.825,P=0.000<0.01)。青海血蜱和微小扇頭蜱的無形體感染率分別為6.9%(2/29)和31.7%(251/791)(表4)。經(jīng)χ2檢驗,不同蜱種無形體感染率之間的差異極顯著(χ2=8.087,P=0.004<0.01)。

圖7 基于OmpB基因立克次體系統(tǒng)進化樹Fig.7 Neighbor joining (NJ) phylogenetic trees based on OmpB gene of Rickettsia

圖8 基于16S rRNA基因無形體系統(tǒng)進化樹Fig.8 Neighbor joining (NJ) phylogenetic trees based on 16S rRNA gene of Anaplasma

表3 爐霍縣蜱攜帶SFGR和無形體的感染率

續(xù)表3 Continued table 3

表4 不同蜱種感染SFGR和無形體情況

3 討 論

蜱屬于不完全變態(tài)發(fā)育,生活史的不同階段形態(tài)差異大,不同生境下同一種蜱的形態(tài)也可能存在差異。形態(tài)學鑒定方法在鑒定飽血蜱、殘缺蜱以及某些隱蔽種時存在一定的限制。此外,形態(tài)學鑒定對鑒定者的知識儲備和經(jīng)驗積累要求高,因此僅通過形態(tài)學鑒定難以在種的水平上對蜱做出準確的鑒定[13]。2003年,Hebert等[14]首次提出DNA條形碼技術(shù)可被用于動植物的物種鑒定,隨后這項技術(shù)被廣泛用于蜱種鑒定。通過對特定的DNA序列進行擴增、測序和比對,可準確并快速地鑒定出蜱種。目前,用于蜱鑒定的靶基因主要有ITS-2、COI和16S rRNA。其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(Internal transcribed spacer-2,ITS-2)屬于非編碼區(qū),具有種內(nèi)變異小、種間差異大等特點,是蜱鑒定和系統(tǒng)進化分析的重要靶標,也是本研究將ITS-2作為靶基因鑒定蜱的依據(jù)[15]。本研究通過對ITS-2基因的擴增成功鑒定出2種蜱,形態(tài)鑒定與分子鑒定的結(jié)果相符。

SFGR鑒定采用Fournier等[16]建立的方法,以O(shè)mpB基因作為靶基因檢測爐霍縣牦牛源寄生蜱SFGR感染情況。結(jié)果顯示采集自爐霍縣6個鄉(xiāng)的蜱存在不同程度的SFGR感染,感染率最高的鄉(xiāng)是泥巴鄉(xiāng)65.0%(65/100)。參照葉曉東等[17]報道的鑒定標準：OmpB序列相似性 ≥ 99.2% 即可判定為同一種立克次體,這也是本研究將OmpB作為靶基因鑒定SFGR的依據(jù)。目前國際上將立克次體分為4個群,其中SFGR是已知的立克次體中種類最多和分布最廣的群,至少存在16種以上的SFGR對人類有致病性[18]。SFGR在全球分布廣泛,近年來不斷有新的對人有致病性的SFGR被發(fā)現(xiàn)[19-20]。目前,研究人員已從中國的多種媒介生物、家畜及野生動物中檢出14種以上的立克次體[21]。本研究首次在分子水平上證實爐霍縣牦牛源蜱存在SFGR感染,進化分析結(jié)果顯示CandidatusR.longicorniiSM11與CandidatusR.longicornii親緣關(guān)系最近。2018年,Jiang等[22]從采集自韓國的長角血蜱中首次檢出CandidatusR.longicornii,進化分析顯示CandidatusR.longicornii與采自中國病人血液及韓國嚙齒動物脾臟中分離到的Rickettsiasp.親緣關(guān)系最近,提示CandidatusR.longicornii可能對哺乳動物有感染性。隨后,CandidatusR.longicornii在韓國和中國等地被廣泛報道[23-24]。值得關(guān)注的是2019年和2021年分別在甘孜州石渠縣[25]和九龍縣[8]牦牛源寄生蜱中也檢出CandidatusR.longicornii,可推測CandidatusR.longicornii在甘孜州廣泛存在。后期可對甘孜州多種家畜(馬、藏綿羊等)、小型嚙齒類動物(高原鼠兔、高原鼢鼠等)和媒介生物(跳蚤、羊蜱蠅等)攜帶CandidatusR.longicornii的情況開展范圍更廣的調(diào)查,并對CandidatusR.longicornii的潛在致病性做進一步研究。

目前的研究表明無形體屬中主要有綿羊無形體(A.ovis)、噬吞噬細胞無形體(A.phagocytophilum)、山羊無形體(A.capra)、邊緣無形體(A.marginale)、血小板無形體(A.platys)、牛無形體(A.bovis)和中央無形體(A.centrale),其中A.phagocytophilum、A.ovis和A.capra已有感染人的報道[26-28]。16S rRNA基因具有高度的保守性和特異性,其高變區(qū)的序列具有細菌屬和種的特征,因此被廣泛應用于無形體的分類與鑒定[29]。湯麗等[30]報道無形體16S rRNA基因序列的相似性 ≥ 99.0%即可被認定為同一個種,相似性 ≥ 95.0%即可被認定為同一個屬。因此,本研究基于無形體16S rRNA基因?qū)t霍縣牦牛源寄生蜱進行檢測,共檢出A.phagocytophilum、A.marginale、A.platys和A.bovis4種無形體。其中在微小扇頭蜱中檢出A.marginale、A.bovis、A.platys和A.phagocytophilum,在青海血蜱中僅檢出A.marginale,造成這種差異的原因可能與樣本的采集方法、采集數(shù)量和無形體自身不完全的宿主特異性有關(guān)。爐霍縣平均海拔3860 m,樣本采集較困難。本研究僅對爐霍縣牦牛源寄生蜱進行采集,其中青海血蜱占樣本數(shù)量的3.5%(29/820,95% CI=2.4%～5.0%),微小扇頭蜱占96.5%(791/820,95% CI=95.0%～97.6%)。相關(guān)研究表明不同生境和不同時間段蜱的流行存在差異[31],因此可在不同時間段采集馬、藏綿羊等家畜及野生動物(如高原鼠兔等小型嚙齒類動物)源寄生蜱,并采用拖旗法等方法采集游離蜱對爐霍縣開展更廣范圍的調(diào)查,從而詳盡掌握當?shù)仳绲姆N類與分布,為相關(guān)蜱傳病的防控提供數(shù)據(jù)支撐。無形體具有不完全的宿主特異性,在不同地域間媒介蜱種存在差異。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)A.phagocytophilum在亞洲的主要媒介蜱是全溝硬蜱,在歐洲的主要媒介蜱是篦子硬蜱,在美國西部的主要媒介蜱是刺須硬蜱和太平洋硬蜱。而A.ovis在美洲及歐洲的主要媒介蜱為囊狀扇頭蜱,在中國的主要媒介蜱為草原革蜱和短小扇頭蜱[33]。本研究在微小扇頭蜱中檢出A.marginale、A.bovis、A.platys和A.phagocytophilum,在青海血蜱中僅檢出A.marginale,表明微小扇頭蜱很可能是多種無形體適宜的傳播媒介。本研究中A.marginale在無形體檢測中處優(yōu)勢地位,感染率為無形體感染總數(shù)的76.3%(193/253),其中微小扇頭蜱占75.5%(191/253),青海血蜱占0.8%(2/253)。目前,有超過20種蜱已被證實是無形體的生物學傳播媒介,其中微小扇頭蜱是A.marginale主要的傳播媒介[34],這與本次調(diào)查結(jié)果相符。A.marginale感染牛后可引起牛發(fā)生溶血性疾病,給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[35]。而A.phagocytophilum可經(jīng)蜱傳播引起人類的人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA),首次報道于蘇格蘭,隨后在世界各地被廣泛報道[7]。因此,應進一步加強對爐霍縣無形體的監(jiān)測與防控。

4 結(jié) 論

本研究首次對爐霍縣牦牛源寄生蜱的種類及攜帶SFGR和無形體的情況進行調(diào)查。爐霍縣存在青海血蜱和微小扇頭蜱,其還攜帶SFGR和多種無形體,應做好當?shù)仳鐐靼唿c熱群立克次體和無形體的防治工作。