賀 璐,馬 杰,傅 淋,肖才升,劉 芳,趙瑞元,李 庠

(1.湖南省棉花科學(xué)研究所,湖南 常德 415101;2. 湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院,湖南 常德 415100)

【研究意義】卷丹百合(Liliumlancifolium)為百合科植物[1],是《中國藥典》(2020版)規(guī)定的百合藥材基源植物之一,也是湖南省百合種植的主要品種之一,主要分布在湘西龍山,具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,卷丹百合含多糖、多酚、香豆酸、沒食子酸、皂苷、黃酮等多種成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強免疫等藥理作用[2-6]。卷丹百合兼具藥用、食用、觀賞等多種價值,綜合利用價值較高。目前市場上卷丹百合供給主要依靠人工種植,然而在種植過程中易受病害肆虐,嚴重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。百合根腐病又稱枯萎病、莖腐病,是由土傳真菌引發(fā)的一類嚴重土傳病害[7],主要由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和串珠鐮刀菌(Fusariummoniliform)3種病原菌侵染發(fā)病,也與連作、害蟲、土壤pH、栽培管理方法及其他環(huán)境因素等相關(guān)[8-10]。植物根際微生物在促進植物生長、參與營養(yǎng)轉(zhuǎn)化及抑制病害的發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。因此,研究健康百合與患根腐病百合根際真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成差異,對進一步探究百合根腐病與根際真菌之間的關(guān)系,篩選根腐病生防菌具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者,通常與環(huán)境中有機質(zhì)的分解和養(yǎng)分循環(huán)和能量傳遞有關(guān),其多樣性、群落結(jié)構(gòu)與功能被認為是評價生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和環(huán)境可持續(xù)性的重要指標之一。根際真菌在根際生態(tài)系統(tǒng)中的主要作用體現(xiàn)在兩個方面：一是作為致病菌引起作物土傳病害的發(fā)生,引起連作障礙,導(dǎo)致作物減產(chǎn);另一方面可作為生防菌對作物土傳病害的防治發(fā)揮著重要作用[11-12]。前人采用高通量技術(shù)對北蒼術(shù)[13]、枸杞[14]、烤煙[15]、黃精[16]等作物患根腐病植株根際土壤微生物多樣性進行分析,結(jié)果表明各作物患根腐病的植株根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性與健康植株相比存在較大差異,毛殼屬(Cheatomium)、Schizotheciumj在健康北蒼術(shù)根際土壤中豐度更高,致病菌鐮刀菌(Fusarium)在根腐病北蒼術(shù)、枸杞根際土壤中豐度更高;茄鐮刀菌(F.solani)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)和青霉菌(Penicilliumraperi)在根腐病烤煙植株根際土壤中比健康煙株根際土壤中豐度高。目前,針對百合病害的研究主要集中在病原菌分離與鑒定、拮抗菌篩選、發(fā)病機理及防治技術(shù)等方面,但都是針對龍牙百合、蘭州百合等品種。如李潤根等[17]首次報道層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)能夠引發(fā)龍牙百合枯萎病,楊謝斌[18]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對百合枯萎病病原菌有較好的抑制作用,張銘順[19]發(fā)現(xiàn)康寧霉素可以有效地防治百合根腐病,低濃度的康寧霉素對百合植株具有較好促生作用?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有關(guān)于卷丹百合病害的研究主要是灰霉病、黑斑病的病原菌篩選以及綜合防治技術(shù),根際微生物群落方面的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以湖南省龍山縣多年連作地塊的健康與患根腐病卷丹百合為對象,研究兩者之間根際土壤中真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異,為進一步探明卷丹百合根腐病的微生態(tài)發(fā)病機理和生防菌的篩選及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

樣品采集于湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣(卷丹百合主產(chǎn)區(qū))卷丹百合種植地(109°25′ E, 29°23′ N),海拔484.13 m,年平均氣溫15.8 ℃,年降雨量1400 mm。采集3組根際土壤樣品：健康卷丹百合根際土壤、患根腐病卷丹百合根際土壤、距離采集點約50 m未種過卷丹百合的土壤,每組各采集4份樣品,分別編號為LHS1～4、LDS1～4、NS1～4。百合植株取樣采用隨機取樣法,取附著于根系的土壤作為根際土壤;取距離采集點約50 m未種植過百合的空地15～20 cm土壤為空白土壤。將采集的土壤過80目篩,去除雜質(zhì),裝入無菌離心管,置于冰盒中帶回實驗室。

1.2 DNA提取、PCR擴增及檢測

使用德國Qiagen公司的DNeasy Power Soil Pro Kit試劑盒提取土壤基因組DNA,具體方法參照說明書。采用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。以合格的DNA為模板,ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、ITS1R(5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)為引物,擴增真菌ITS1序列。擴增體系(25 μL)：5×reaction buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL, Forward primer(10 μmol/L)1 μL, Reverse primer(10 μmol/L)1 μL, DNA Template 2 μL, dd H2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。擴增條件： 98 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25個循環(huán); 72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物回收純化后,由上海派森諾生物科技有限公司進行Illumina Miseq測序。

不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05.圖1 卷丹百合根腐病植株與健康植株根際土壤真菌α多樣性分析Fig.1 Alpha diversity of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

1.3 數(shù)據(jù)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)利用DADA2方法進行去引物,質(zhì)量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等處理,質(zhì)控后產(chǎn)生的每個去重序列稱為ASVs(Amplicon sequence variants)。采用R語言進行PCA分析,以量化展示樣本間物種組成的差異程度。利用LEfSe (LDA effect size)分析直接對屬水平進行差異分析并尋找分組之間的標志物種。用SPSS 21.0對多樣性指數(shù)及相對豐度進行統(tǒng)計分析,P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Excel作各分類水平菌群結(jié)構(gòu)組成圖及α多樣性分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹百合根腐病與健康植株根際土壤真菌α多樣性分析

利用Illumina平臺對真菌ITS-V1區(qū)進行測序,共獲得876 022條有效序列,經(jīng)過序列去噪和聚類后,每個樣本獲得的高質(zhì)量序列數(shù)超過60 000個reads,比例超過94%,且隨著抽平深度的增加,稀疏曲線趨于平緩,說明測序效果理想,測序深度足以支持后續(xù)分析。Chao1指數(shù)、Pielou’s evenness指數(shù)和Simpson指數(shù)用來反映卷丹百合根際土壤真菌豐富度、均勻度和多樣性。從圖1可知,根腐病百合根際真菌Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)與健康百合、空白土壤相比無顯著差異,Pielou’s evenness指數(shù)顯著低于空白土壤(P=0.02),與健康百合相比無顯著差異。綜上,患根腐病卷丹百合與健康百合根際真菌群落α多樣性無顯著差異。

2.2 卷丹百合根腐病與健康植株根際土壤真菌群落組成分析

門水平上(圖2-A),卷丹百合根際真菌共檢測到9個菌門：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、Mortierellomycota、毛霉門(Mucoromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、捕蟲霉門(Zoopagomycota)、梳霉門(Kickxellomycota);其中健康百合、患病百合根際及空白土壤優(yōu)勢菌門均為子囊菌門,相對豐度分別為54.35%、79.04%和38.80%,與空白土壤相比,健康百合與患病百合根際子囊菌門的相對豐度分別高15.55%、40.24%,且患病百合根際比健康百合根際高24.69%;油壺菌門(Olpidiomycota)只在空白土壤中檢測到。

綱水平上(圖2-B),卷丹百合根際土壤和空白土壤中相對豐度最高的為子囊菌綱(Sordariomycetes),健康百合(P=0.035)和患病百合(P=0.007)根際中子囊菌綱的相對豐度顯著高于空白土壤,且患病百合比健康百合高8.3%;患病百合根際土壤中散囊菌綱(Eurotiomycetes)的相對豐度顯著高于健康百合根際土壤(P=0.005)和空白土壤(P=0.002),健康百合根際土壤和空白土壤無顯著差異;百合根際土壤中座囊菌綱(Dothideomycetes)的相對豐度顯著低于空白土壤(P=0.001);健康百合根際土壤中銀耳綱(Tremellomycetes)的相對豐度顯著低于患病百合(P=0.025)和空白土壤(P=0.004)。毛霉綱(Mucoromycetes)在空白土壤、健康百合根際土壤和患病百合根際土壤中的相對豐度分別為1.66%、6.24%、0.17%。

目水平上(圖2-C),百合根際土壤和空白土壤中豐度最高的為肉座菌目(Hypocreales),在空白土壤、健康百合根際土壤和患病百合根際土壤中的相對豐度分別為17.70%、27.25%、27.79%;刺盾炱目(Chaetothyriales)在健康百合和患病百合根際土壤中的相對豐度顯著高于空白土壤,且在患病百合根際土壤中顯著高于健康百合根際土壤(P=0.000);銀耳目(Tremellales)在健康百合根際土壤中的相對豐度顯著低于患病百合根際(P=0.026)和空白土壤(P=0.002);雞油菌目(Cantharellales)在健康百合根際土壤和患病百合根際土壤中比空白土壤分別高2.64%、5.24%,患病百合根際土壤比健康百合根際土壤高2.60%;未分類真菌在空白土壤中的相對豐度顯著高于患病百合根際土壤(P=0.02)。

科水平上(圖2-D),透孢黑團殼科(Massarinaceae)、毛霉菌科(Mucoraceae)只在健康百合和患病百合根際土壤中被檢測出;在空白土壤中,肉座菌科(Hypocreaceae)(P=0.043)的相對豐度顯著高于健康百合根際土壤,Trimorphomycetaceae(P=0.000,P=0.002)的相對豐度顯著高于健康百合和患病百合根際土壤,未分類真菌(P=0.006)的相對豐度顯著高于患病百合根際土壤,小皰毛殼科(Her-potrichiellaceae)的相對豐度顯著低于健康百合和患病百合根際土壤(P=0.031,P=0.000);患病百合根際土壤中小皰毛殼科的相對豐度顯著高于健康百合根際土壤(P=0.031),未分類真菌的相對豐度顯著低于健康百合根際土壤(P=0.031)。叢赤殼科(Nectriaceae)、透孢黑團殼科、發(fā)菌科(Trichocomaceae)的相對豐度在患病百合根際土壤中比健康百合根際土壤分別高12.87%、10.54%、4.60%。

屬水平上(圖2-E),豐度前10的真菌屬類中,節(jié)菱孢屬(Saccharicola)、Saitozyma、Thozetella只在健康百合和患病百合根際土壤中檢測到;外瓶霉屬(Exophiala)的相對豐度在健康百合根際土壤中顯著低于患病百合根際土壤(P=0.001),顯著高于空白土壤(P=0.019);在空白土壤中,木霉屬(Trichoderma,P=0.043)、籃狀菌屬(Talaromyces,P= 0.04)的相對豐度顯著高于健康百合根際土壤,未分類真菌顯著高于患病百合根際土壤(P=0.022),Ilyonectria的相對豐度顯著低于健康百合根際土壤(P=0.039),Saitozyma的相對豐度顯著高于健康百合和患病百合根際土壤(P=0.002)。

綜上,卷丹百合根際土壤中子囊菌門、散囊菌綱、外瓶霉屬等真菌相對豐度的變化可能與其根腐病的發(fā)生有密切關(guān)系,毛霉綱在健康卷丹百合根際土壤中富集可能與抗病性相關(guān)。

2.3 卷丹百合根腐病與健康植株根際土壤真菌群落差異分析

由圖3可知,健康百合與空白土壤主要分布在第一主成分軸的負端,距離較近,患病百合主要分布在第一主成分軸的正端,表明健康健康植株根際與空白土壤真菌的物種組成趨于相似,而患根腐病百合與健康百合根際土壤真菌群落物種組成有一定的差異性。

2.4 卷丹百合根腐病與健康植株根際土壤真菌屬水平LEfSe物種差異分析

如圖4所示,患根腐病百合根際土壤真菌中子囊菌門、Cystobasidiiomycetes、散囊菌綱、Chaetothyriales、小叢殼目(Glomerellales)、錘舌菌科(Leotiaceae)、小皰毛殼科、暗色孢科(Dermateaceae)、小叢殼科(Glomerellaceae)、Tremellales_fam_Incertae_sedis、Gladophialophora、外瓶霉屬、刺孢殼屬(Chaetomella)、軟盤菌屬(Mollisia)、Colletotrichunm、Viridispora、Cuniculitrema相對豐度顯著高于健康百合根際土壤,且子囊菌門豐度最高。大團囊菌科(Elaphomycetaceae)、糞盤菌科(Ascobolaceae)、糞殼菌科(Sordariaceae)、隔孢假殼科(Didymosphaeriaceae)、Ilyonectria、Thozetella、Rhexodenticula、Arcopilus、角菌根菌屬(Ceratobasidium)、Mariannaea、大團囊菌屬(Elaphomyces)、糞盤菌屬(Ascobolus)、脈孢菌屬(Neurospora)、Paraphaeosphaeria14類菌群在健康百合根際土壤中顯著高于患根腐病百合土壤,Ilyonectria豐度最高。說明子囊菌門與Ilyonectria在患根腐病與健康百合根際土壤中差異最大。

圖3 卷丹百合根腐病植株與健康植株根際土壤真菌物種豐度差異PCA分析Fig.3 PCA analysis of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

LDA閾值為2;圖中節(jié)點大小對應(yīng)于該分類單元的平均相對豐度;空心節(jié)點代表組間差異不顯著的分類單元,而其它顏色的節(jié)點則表明這些分類單元體現(xiàn)出顯著的組間差異。The current LDA threshold is 2.The size of nodes in the figure corresponds to the average relative abundance of the taxon; Hollow nodes represent taxa that do not differ significantly between groups, while nodes of other colors indicate that these taxa exhibit significant differences between groups.圖4 卷丹百合根腐病植株與健康植株根際土壤真菌差異標志物種LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of rhizosphere soil fungi between root rot plants and healthy plants of L.lancifolium

3 討 論

本研究利用Illumina Miseq平臺對連作多年地塊患根腐病和健康百合的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異進行分析,共獲得876 022條有效序列,經(jīng)過序列去噪和聚類后高質(zhì)量序列比例超過94%。在未種植卷丹百合的空白土壤中,真菌Pielou’s evenness指數(shù)顯著高于患病百合根際土壤,油壺菌門只在空白土壤中檢測到,透孢黑團殼科、毛霉菌科、節(jié)菱孢屬、毛霉屬、Thozetella只在健康百合和患病百合根際土壤中檢測到,子囊菌門在健康百合根際土壤中的相對豐度顯著低于患病百合根際土壤;在空白土壤中,Ilyonectria的相對豐度顯著低于健康百合根際土壤,子囊菌綱、刺盾炱目、小皰毛殼科的相對豐度顯著低于健康百合和患病百合根際土壤,肉座菌科(Hypocreaceae)、籃狀菌屬、木霉屬的相對豐度顯著高于健康百合根際土壤;座囊菌綱、Trimorphomycetaceae、Saitozyma的相對豐度顯著高于健康百合和患病百合根際土壤,說明種植百合改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成和豐度。

α多樣性指數(shù)結(jié)果表明患根腐病百合與健康百合根際土壤真菌豐富度、均勻度和多樣性無明顯差異。PCA分析結(jié)果表明患根腐病百合與健康百合根際土壤真菌群落物種之間顯著差異。Yuan等[20]通過大數(shù)據(jù)整合判斷枯萎病準確發(fā)生的研究結(jié)果顯示,子囊菌門在枯萎病發(fā)病土壤中的相對豐度更高,而被孢霉門(Mortierellomycota)在健康土壤中相對豐度更高,本研究中通過LEfSe方法進行標志物種分析,子囊菌門和Ilyonectria分別為患根腐病百合和健康百合根際土壤中相對豐度最高的標志物種,門水平統(tǒng)計結(jié)果也表明被孢霉門的相對豐度在健康百合土壤中更高,這一結(jié)果與Yuan等[20]的研究結(jié)果一致。

從門、綱、目、科、屬5個不同分類水平對患病和健康百合根際土壤真菌群落物種組成及其相對豐度進行分析,在門水平,子囊菌門相對豐度最高,這與已有研究證實的忽地笑、丹參、獼猴桃以及干旱草原和灌叢等[11,21-23]多種植物根際真菌的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門的研究結(jié)果一致。研究表明,散囊菌綱的部分真菌能引起紅毛丹的莖潰瘍病[24];咖啡銹病相關(guān)的真菌群落集中在蟲草菌科和銀耳目[25];小皰毛殼科中一些真菌具有植物致病性[26];棕球藻科(Phaeosphaeriaceae)、黑角藻屬(Cladorrhinum)、鐮刀菌屬(Fusarium)、外瓶霉屬和黑瘤藻科(Melanommataceae)在患根腐病黃連植物內(nèi)生菌中顯著富集[27];叢赤殼科是包含重要植物病原體的一個真菌類群,對葡萄、牛油果、橄欖等作物均具有致病能力[28];說明可能是卷丹百合根際土壤中富集散囊菌綱、銀耳綱、刺盾炱目、銀耳目、小皰毛殼科、叢赤殼科、外瓶霉屬等真菌類群,從而導(dǎo)致植株易感根腐病。

LEfSe分析結(jié)果顯示,大團囊菌科、糞盤菌科、糞殼菌科、隔孢假殼科、Ilyonectria、Thozetella、Rhexodenticula、Arcopilus、角菌根菌屬、Mariannaea、大團囊菌屬、糞盤菌屬、脈孢菌屬、Paraphaeosphaeria為健康百合根際土壤的標志物種。已有研究表明,Arcopilus的一些真菌類群能產(chǎn)生白藜蘆醇,對人參、核桃黑斑病菌和楊樹煙炭病菌、穿孔病菌、瘍病菌等植物病原菌有較好的抑制效果[29-32];Ceratobasidiumspp.對水稻紋枯病菌和香蕉枯萎病病原菌均具有生防潛力[33-34],這可能是Arcopilus、角菌根菌屬在健康卷丹百合根際富集的原因之一。西瓜枯萎病的發(fā)生與土壤中糞盤菌屬等真菌屬的相對豐度呈負相關(guān)[35];Paraphaeosphaeria部分真菌能產(chǎn)生取代苯并吡喃衍生物、異喹啉類生物堿等代謝產(chǎn)物對多種植物病原菌有抑制活性,與鐵皮石斛共培養(yǎng)時能增強其抗病性,這可能與糞盤菌屬、Paraphaeosphaeria為健康百合根際土壤的標志物種有重要關(guān)系[36-37]。由此可見,在連作多年百合地塊,健康百合可能是由于根際土壤中富集Arcopilus、角菌根菌屬、糞盤菌屬、Paraphaeosphaeria等真菌,增強了其抗病性,其具體作用機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

卷丹百合根腐病的發(fā)生與根際真菌群落結(jié)構(gòu)的改變,尤其是散囊菌綱、銀耳綱、Arcopilus、角菌根菌屬等菌類豐度的變化有密切關(guān)系,具體機制可下一步深入研究,為湖南卷丹百合根腐病的綠色防治、連作障礙的修復(fù)技術(shù)研究提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支撐。