余烯宇,吳 闊,張麗珍,郝佳波,呼延麗,杜春花,陸 斌,陳永對(duì),董家紅

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院/中藥材栽培研究所/云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650205;3.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院,昆明 650204)

【研究意義】花椒為蕓香科花椒屬植物,世界上有250種,中國(guó)有45種以及13個(gè)變種,是具較高商業(yè)價(jià)值的藥食同源作物,日常多用于風(fēng)味調(diào)料品使用,其在化妝品市場(chǎng)也有較大發(fā)展空間,栽培品種有大紅袍、漢源花椒、粵西貢椒等[1-2]。藥用部位為干燥成熟果皮,花椒常見功效為溫中止痛、殺蟲止癢[3]。對(duì)花椒的功效深入研究發(fā)現(xiàn)其所含生物堿、木脂素、香豆素、甾萜類等成分有抗腫瘤、心腦保護(hù)、抗血小板凝聚、降壓等功效[4]。隨著花椒種植規(guī)模擴(kuò)大,多地建立了花椒種植基地,花椒病害成為危害花椒產(chǎn)業(yè)的重要因素,花椒葉、根、枝部都極易受不同病蟲害影響,如花椒蚜蟲、花椒窄吉丁、花椒鞘銹菌、花椒生理性病害等[5]。近年花椒黃花病在四川、重慶、云南等地發(fā)生流行,其主要癥狀為花朵雄蕊泛黃、雌蕊敗育,葉片黃化、斑點(diǎn),果實(shí)產(chǎn)量降低[6],利用高通量測(cè)序分析花椒黃花病病原,對(duì)后續(xù)解決花椒黃花病并保證花椒經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究對(duì)產(chǎn)于重慶的九葉青花椒(Zanthoxylumarmatumvar.novemfolius)測(cè)序發(fā)現(xiàn),花椒中5種新病毒,分別為伴生豇豆病毒科(Secoviridae)線蟲多面體病毒屬(Nepovirus)的四川青花椒線蟲多面體病毒(Green Sichuan pepper-nepovirus,GSPNeV),梅奧病毒科(Mayoviridae)懸鉤子病毒屬(Idaeovirus)的四川青花椒懸鉤子病毒(Green Sichuanpepper-idaeovirus,GSPIV),黃癥病毒科(Luteoviridae)耳突花葉病毒屬(Enamovirus)的四川青花椒耳突花葉病毒(Green Sichuan pepper-enamovirus,GSPEV),彈狀病毒科(Rhabdoviridae)胞核彈狀病毒屬(Nucleorhabdovirus)的四川青花椒發(fā)現(xiàn)彈狀病毒(Green Sichuan pepper-nucleorhabdovirus,GSPNuV),在青花椒(Z.schinifolium)花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)的四川青花椒脈明相關(guān)病毒(Green Sichuan pepper vein clearing-associated virus,GSPVCaV)病毒[7-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)四川花椒(Z.bungeanuminSichuan)黃花病中有植原體感染[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為明確云南昭通竹葉花椒永青1號(hào)黃花病的病原,本研究用高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing,HTS)對(duì)4個(gè)感病樣品與2個(gè)無癥樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析,得到花椒病毒序列,對(duì)相關(guān)病毒進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析花椒宏基因組測(cè)序所得的病毒基因組,結(jié)合前人的研究分析,篩選與黃花病癥關(guān)系較為緊密的病毒,為明確花椒黃花病病原提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花椒樣品

于2021年7月取自云南昭通花椒基地,品種為竹葉花椒永青1號(hào)(Zanthoxylumarmatumvar. yongqing 1)。

1.2 花椒RNA提取及花椒轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

取自云南昭通竹葉花椒永青1號(hào)花椒種植基地的無病癥花椒共2組,標(biāo)記為H-1、H-2。選擇感病花椒4組,標(biāo)記為D-1、D-2、D-3、D-4,挑選花椒葉片和花部分,分別用Eastep Super總RNA提取試劑盒(動(dòng)植物兩用型,上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試RNA,保證RNA提取質(zhì)量較好,將提取的RNA送至上海歐億生物醫(yī)藥科技有限公司使用SPAdes對(duì)質(zhì)控后數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝,最小contigs片段大小設(shè)置為50,通過NR注釋選取比對(duì)上數(shù)據(jù)庫(kù)中病毒序列的contigs,使用PRodigal對(duì)virus序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。

1.3 病毒序列分析

用Origin Pro 2021對(duì)contigs在12種病毒科組內(nèi)的占比進(jìn)行可視化聚類分析,將所有NR注釋的FYD花椒與健康花椒所有contigs通過NCBI BLAST匹配到不同的病毒序列,用本地注釋文件定位不同contigs于病毒的位點(diǎn),用DNAMAN將匹配到相同序列號(hào)的同類型病毒調(diào)整為堿基5′→3′的順序,按匹配點(diǎn)位進(jìn)行拼接,得到較完整序列,使用MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)分析RNA保守位點(diǎn),通過 ORF預(yù)測(cè)蛋白開放閱讀框,使用CDD(Conserved domains database)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 感黃花病花椒樣品中病毒種類分析

在Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)上對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序獲得總長(zhǎng)351 139 315 nt,并拼接獲得707 122個(gè)基因片段,GC平均占比44.42%,平均contigs長(zhǎng)度為335.99 nt,保證拼接數(shù)據(jù)高質(zhì)量。對(duì)6個(gè)花椒樣品進(jìn)行病毒NR注釋,發(fā)現(xiàn)484個(gè)contigs可匹配到12個(gè)病毒科15種病毒。在6個(gè)樣品中均檢測(cè)出在九葉青花椒上已報(bào)道的4種病毒：四川青花椒線蟲多面體病毒(GSPNeV)、四川青花椒懸鉤子病毒(GSPIV)、四川青花椒耳突花葉病毒(GSPEV)、四川花椒彈狀病毒(GSPNuV),contigs占比25.82%;同時(shí)發(fā)現(xiàn)2種未報(bào)道的新病毒,分別命名為永青花椒相關(guān)幽影病毒(Yongqing green pepper-associated umbravirus)和永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒(Yongqing green pepper-associated ssRNA negative-strand virus),contigs占比2.52%。從感病樣品D-2、D-3、D-4發(fā)現(xiàn)乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)馬鈴薯M病毒(Potato virus M,PVM)、馬鈴薯H病毒(Potato virus H,PVH)和馬鈴薯S病毒(Potato virus S,PVS),同時(shí)在D-1樣品中發(fā)現(xiàn)葡萄莖痘相關(guān)病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPAV)。從圖1可知,Betaflexiviridae病毒僅存在于顯病組,且為獨(dú)立類別。整理不同測(cè)序組樣品中已報(bào)道的4種新病毒及未報(bào)道的2種新病毒及乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)的病毒contigs范圍,通過NCBI BLAST確定病毒種類(表1)。已被報(bào)道的GSPNeV、GSPIV、GSPEV、GSPNuV病毒在每組花椒中均有發(fā)現(xiàn),contigs范圍大且氨基酸相似性在86.16%～100%;其中未報(bào)道的2種新病毒也能從所有測(cè)序花椒樣品中檢測(cè)到。依據(jù)NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果以其最相近病毒為參考將2種新病毒初步命名為永青花椒相關(guān)幽影病毒(Yongqing green pepper-associated umbravirus)和永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒(Yongqing green pepper-associated ssRNA negative-strand virus),而上述6種病毒contig長(zhǎng)度在無癥組與感病組無明顯差異。通過DNAMAN對(duì)病毒序列進(jìn)行拼接得到較長(zhǎng)的永青花椒相關(guān)幽影病毒和永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒序列,永青花椒相關(guān)幽影病毒序列長(zhǎng)2900～3080 nt,永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒序列長(zhǎng)7306 nt。通過BLAST發(fā)現(xiàn)FYD組花椒病毒39個(gè)contigs比對(duì)到乙型線形病毒科(表2),其中D-2、D-3、D-4中存在馬鈴薯M病毒(Potato virus M,PVM)、馬鈴薯H病毒(Potato virus H,PVH)、馬鈴薯S病毒(Potato virus S,PVS)3類病毒,此3種病毒均屬于乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)[10],而中D-1組僅有凹陷病毒屬(Foveavirus)的葡萄莖痘相關(guān)病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus)2個(gè)短片段contigs。

圖1 依據(jù)12個(gè)病毒科contigs占比的熱圖聚類分析Fig.1 Heatmap cluster analysis based on the percentage of contings in 12 virus families

2.2 永青花椒相關(guān)幽影病毒分析

由表1可知,從6個(gè)樣品得到長(zhǎng)度為302～3080 nt的永青花椒相關(guān)幽影病毒(Yongqing green pepper-associated umbravirus)contigs,對(duì)不同核苷酸序列進(jìn)行兩兩比對(duì)發(fā)現(xiàn)相似性為88.1%～100.0%, 其中H-2、D-1、D-3、D-4分別得到長(zhǎng)為3025、3022、2900、3080 nt的病毒序列,4條序列的相似性在92.1%～97.8%,通過NCBI氨基酸BLAST發(fā)現(xiàn)與幽影病毒屬(Umbravirus)的仙人掌幽影病毒(Opuntia umbra-like virus, GenBank：AXG65483.1)最相似,覆蓋率為50%～53%,相似性為49.90%～50.56%,核酸序列相似性為51.9%～52.1%。開放閱讀框(ORF)搜索發(fā)現(xiàn)其含有3個(gè)ORF,ORF1長(zhǎng)594 nt并編碼197個(gè)氨基酸(2027～2620,197 aa),ORF2 長(zhǎng)1188 nt并編碼395個(gè)氨基酸(903～2090,395 aa),未獲得完整的ORF3。ORF1編碼蛋白與無花果幽影病毒(Fig umbra-like virus)的P3蛋白相似性最高,氨基酸序列覆蓋率為82%,相似性為36.97%,ORF2編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)與幽影病毒屬大多病毒覆蓋率在68%～99%,相似性42.47%～51.12%,與仙人掌幽影病毒(Opuntia umbra-like virus, GenBank：AXG65483.1)相似性最高,為51.12%。如圖2所示,使用最大似然法對(duì)ORF2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)永青花椒相關(guān)幽影病毒與仙人掌幽影病毒(Opuntia umbra-like virus)及玉米相關(guān)幽影病毒(Maize-associated umbra-like virus)等病毒進(jìn)化關(guān)系較近,幽影病毒屬大部分為正義陽(yáng)性單鏈RNA,有4個(gè)開放閱讀框,由于其基因組不編碼結(jié)構(gòu)蛋白,受幽影病毒屬感染的植物通常伴有對(duì)應(yīng)的某一種黃癥病毒(Iuteovirus)復(fù)合侵染,黃癥病毒對(duì)幽影病毒進(jìn)行基因組衣殼化并通過蚜蟲作為介體傳播[11-12],雖然序列不全,但對(duì)獲得的3個(gè)開放閱讀框分析發(fā)現(xiàn)該病毒與幽影病毒屬病毒關(guān)系密切,且6個(gè)樣品測(cè)序剛好檢測(cè)出屬于黃癥病毒科的四川青椒耳突花葉病毒,幽影病毒的輔助病毒為黃癥病毒科成員,兩者或有關(guān)聯(lián)。

表1 不同樣品中的主要病毒種類

續(xù)表1 Continued table 1

表2 感病樣品中Betaflexiviridae病毒種類

2.3 永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒分析

由表1可知,6個(gè)樣品中得到長(zhǎng)度為30～7306 nt的永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒(Yongqing green pepper-associated ssRNA negative-strand viruse)contigs,其中D-3得到最長(zhǎng)讀數(shù)片段長(zhǎng)為7306 nt,與其余短片段核酸進(jìn)行兩兩比對(duì)發(fā)現(xiàn)相似性為94.6%～100.0%,通過NCBI BLASTX發(fā)現(xiàn)與枝孢霉菌負(fù)鏈RNA病毒1(Cladosporium cladosporioides negative-stranded RNA virus 1,GenBank：QDB75017.1)最接近,覆蓋率為99%,相似性為66.58%,DNAMAN比對(duì)核酸序列相似性為42.2%。開放閱讀框檢索發(fā)現(xiàn)含有1個(gè)ORF,長(zhǎng)7041 nt,編碼2346個(gè)氨基酸,111～7151 nt, 2346 aa),主要為RNA依賴性RNA聚合酶,與其余未分類單鏈負(fù)義RNA病毒(Unclassified ssRNA negative-strand viruses)覆蓋率42%～99%,相似性23.25%～64.49%。如圖3所示,使用最大似然法對(duì)ORF進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒與枝孢霉菌負(fù)鏈RNA病毒1系統(tǒng)發(fā)育最為接近,其余相近病毒也皆為真菌傳播病毒,認(rèn)為該病毒或?yàn)橹︽呙咕嘟恼婢《?該菌種及病毒有待驗(yàn)證。

2.4 乙型線形病毒科病毒分析

將測(cè)序文庫(kù)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得與FYD相關(guān)且僅在D組檢測(cè)的乙型線形病毒科的PVM、PVH、PVS的序列號(hào),使用NDAMAN拼接不同病毒序列,得到病毒近全長(zhǎng)序列。從表2可知,GRSPaV僅在D-1中發(fā)現(xiàn),其他感病樣品中均未發(fā)現(xiàn),所匹配的contigs片段僅為434 和294 nt,無法拼接出全長(zhǎng),NCBI BLASTX序列比對(duì)與GRSPaV isolate NV-57G 分離物的復(fù)制酶蛋白位點(diǎn)相似性為99.25%,可確定為該病毒。

D2～D4樣品中多為PVM、PVH、PVS 2種病毒或3種病毒復(fù)合侵染,通過DNAMAN序列拼接得到總長(zhǎng)分別為8436、8353、8510 nt的PVM、PVH、PVS病毒的近全長(zhǎng)序列,提交至NCBI進(jìn)行序列比對(duì),與PMV 分離物M57(GenBank： AY311395.1)、PVH 分離物YN(GenBank： JQ904630.10)、PVS 分離物BY(GenBank： MF033144.1)核苷酸相似性分別為96.5%、96.6%、97.9%以及98.6%。PVM、PVH、PVS均歸屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus),大多為蚜蟲非持久性傳播,在馬鈴薯上常表現(xiàn)為混合感染,其基因組特征為有6個(gè)ORF[13],PVM、PVH、PVS的ORF1(～5900 nt)編碼甲基轉(zhuǎn)移酶(321 aa,pfam01660)、C23肽酶(87 aa,pfam05379)、病毒解旋酶1(253 aa,pfam01443)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp,389 aa,pfam00978),重疊的ORF2、3、4(～1200 nt)為負(fù)責(zé)胞間運(yùn)動(dòng)的3個(gè)基塊(TGB)[14],ORF5、ORF6分別編碼香石竹潛隱病毒屬特異性CP蛋白(304 aa,pfam08358)、carlaviruses推定的核酸結(jié)合蛋白(114 aa,pfam01623),ORF序列比對(duì)分析表明本研究所獲得匹配到PVM、PVH、PVS的contigs與相應(yīng)代表性分離物具有較高相似性。

圖2 基于ORF2核苷酸序列的永青花椒相關(guān)幽影病毒系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Yongqing green pepper-associated umbravirus based on the nucleotide sequences of ORF2

圖3 基于全長(zhǎng)核苷酸序列的永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Yongqing green pepper-associated ssRNA negative-strand virus based on the complete nucleotide sequences

3 討 論

植物病害已成為影響經(jīng)濟(jì)效應(yīng)最顯著因素之一,因此需要在最短的時(shí)間內(nèi)找到有效檢測(cè)工具對(duì)病原進(jìn)行快速且特異性的檢測(cè),而對(duì)植物病害的預(yù)防和管理在很大程度上取決于對(duì)病原的準(zhǔn)確識(shí)別。現(xiàn)階段HTS比起從前測(cè)定的方法更具有全面性,可作為常規(guī)病原體篩查的一部分,已成功應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)許多農(nóng)作物病毒、類病毒[15],如使用HTS對(duì)葡萄總RNA進(jìn)行測(cè)序鑒定出4種病毒和3種類病毒,揭示多重感染的病毒之間可能有復(fù)雜的相互作用[16]。Cao等[17]用HTS技術(shù)從九葉青花椒黃花病樣品中發(fā)現(xiàn)4種新病毒,這4種RNA病毒在同種植物混合感染中具有水平傳播的共性,線蟲多面體病毒屬病毒主要是長(zhǎng)線蟲非持久性傳播,種子/花粉傳播也是常見傳播方式。耳突花葉病毒屬通過花粉和種子傳播,未見生物媒介傳播的報(bào)道[18],懸鉤子病毒屬病毒由蚜蟲以持續(xù)循環(huán)和機(jī)械接種的方式傳播[19]。核型彈狀病毒屬由節(jié)肢動(dòng)物或壺菌傳播,有報(bào)道稱葉蟬或蚜蟲可傳播此類病毒[20 -21]。4個(gè)新病毒中,GSPNeV在宿主中具有高表達(dá)的特性且傳播更廣泛,且后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與FYD相關(guān)的是GSPNeV及satGSPNeV,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析證明兩者之間存在密切的共感染能力,又因其在患病植物有較高讀數(shù)占比,證明高病毒滴度對(duì)植物宿主正常生理活性可產(chǎn)生一定程度的影響,從感病花椒未顯癥枝條與顯癥枝條的HTS測(cè)序發(fā)現(xiàn)GSPNeV幾乎僅存在于顯癥枝條中,認(rèn)為GSPNeV及sat GSPNeV與FYD密切相關(guān),但從無癥狀樹也檢測(cè)到GSPNeV,預(yù)示此類病毒可能存在臨床潛伏期,又或跟病毒滴度含量低于植株出現(xiàn)感病癥狀的閾值而未顯癥有關(guān),不排除感染GSPNeV的無癥樹木可能是對(duì)病毒感染具有某方面抗性的栽培品種,在僅考慮感病花椒的前提下認(rèn)為GSPNeV可作為侵染植體的優(yōu)勢(shì)病毒[7,22],但仍然未完成病毒病原的柯赫氏法則檢驗(yàn)。本研究使用HTS對(duì)6個(gè)永青花椒樣品進(jìn)行了測(cè)序,在無癥、感病組花椒中均發(fā)現(xiàn)有Cao等[7]從九葉青花椒黃花病樣品中發(fā)現(xiàn)的4種新病毒,再一次證明了花椒黃花病與這4個(gè)病毒的相關(guān)性,也說明該類病害的普遍性。本研究還發(fā)現(xiàn)2種新病毒,暫命名為永青花椒相關(guān)幽影病毒和永青花椒相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒。另外,本研究的花椒黃花病樣品也發(fā)現(xiàn)乙型線型病毒科的幾種病毒。僅樣品D-1中檢測(cè)出與GRSPaV相似的contigs片段,可能該病毒在宿主內(nèi)濃度滴度較低,測(cè)序時(shí)未能測(cè)出完整的病毒序列,而 GRSPaV 被驗(yàn)證出在宿主植物葡萄藤的生長(zhǎng)發(fā)育中具有降低宿主光合作用率和防御機(jī)制的能力[23],受GRSPaV感染的花椒或可能會(huì)因該病毒使花椒防御機(jī)制減弱而引發(fā)黃花病癥狀。

從樣品D-2、D-3、D-4等感染黃花病花椒可以測(cè)得的PVM、PVH、PVS完整序列,并且contigs讀數(shù)較高,表明植物宿主內(nèi)病毒濃度滴度在較高水平。其中D-4檢測(cè)出的香石竹潛隱病毒屬病毒contigs讀數(shù)最多,病毒種類豐度最高,D-3、D-4同時(shí)受PVM、PVH、PVS 3種病毒混合感染。PVM被驗(yàn)證擁有“雙重策略”以抵抗宿主植物的抗病毒沉默,其編碼的富含蛋胱氨酸的CRP蛋白可在單細(xì)胞水平抑制RNA沉默和沉默擴(kuò)散,作用效應(yīng)發(fā)揮于局部,還會(huì)增加病毒RNA積累,而TGB1除促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)外僅在沉默擴(kuò)散時(shí)發(fā)揮抑制RNA沉默的效應(yīng)[24],除此之外,攜帶香石竹潛隱病毒屬CRP蛋白的馬鈴薯X病毒(PVX)發(fā)現(xiàn)可改變PVX侵染的癥狀表型,接種葉片原PVX感染表征從無癥感染及輕度花葉轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃赖木植繐p傷和頂端葉片壞死[25]。從測(cè)序花椒樣品中可以發(fā)現(xiàn),顯癥組D-2、D-3、D-4與正常組H-1、H-2最大的區(qū)別就是均遭受香石竹潛隱病毒屬病毒侵染, FYD或由協(xié)同侵染花椒宿主的香石竹潛隱病毒屬病毒通過抑制宿主花椒抗病毒沉默以及增強(qiáng)某些病毒毒性從而導(dǎo)致花椒宿主顯癥。同原理的現(xiàn)象有蠶豆萎蔫病毒2號(hào)(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)編碼的VP53,VP37和LCP抑制宿主基因沉默所產(chǎn)生的siRNAs的積累,使PVX致病性增強(qiáng)[26],但此推測(cè)有待通過對(duì)正?；ń分仓杲臃NPVM、PVS、PVH混合病毒加以驗(yàn)證。

在昭通花椒種植基地觀察發(fā)現(xiàn),FYD顯癥花椒植株受蚜蟲大面積覆蓋感染,研究表明Carlavirus屬病毒可通過蚜蟲以非持久方式傳播[10],蚜蟲也是幽影病毒的傳播介體,但花椒黃花病癥是否由蚜蟲傳播病毒引起,有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

隨機(jī)抽查FYD花椒樣品進(jìn)行植原體驗(yàn)證并未檢測(cè)到植原體侵染,無法解釋FYD與植原體感染有直接關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)了與真菌病毒——枝孢霉菌負(fù)鏈RNA病毒1序列相似的永青花椒負(fù)鏈RNA病毒,但該病毒的真菌寄主菌種有待確定,由于不同宿主對(duì)同類病原感染效應(yīng)不同,該真菌是否導(dǎo)致花椒產(chǎn)生黃花病也需要后續(xù)對(duì)正?；ń穯为?dú)接種該菌進(jìn)行驗(yàn)證分析。

本研究測(cè)序選擇的樣品相對(duì)少,對(duì)花椒FYD相關(guān)病原分析具有一定局限性,無法準(zhǔn)確說明FYD疾病爆發(fā)的因素是否與上述病毒具有潛伏期有關(guān),也無法排除測(cè)序樣品中包含個(gè)別對(duì)引發(fā)FYD直接相關(guān)病毒具有低敏感性而不顯癥的植株的可能,但從感病樣品中檢測(cè)出了高表達(dá)的香石竹潛隱病毒屬病毒,該結(jié)果或可視為引發(fā)FYD癥狀的因素之一。Cao等報(bào)道的4個(gè)病毒,通過田間現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、HTS分析、RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示GSPNeV在宿主中具有高表達(dá)特點(diǎn),GSPEV傳播更廣泛,但其并未表述直接導(dǎo)致病癥的病毒,且其余病毒是否相關(guān)仍需要開展嚴(yán)格的病毒鑒定(如柯赫氏法則分析等)才能明確其病原[7-8]。因此,初步分析PVM、PVS、PVH與FYD癥狀可能相關(guān),基于測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)未報(bào)道的永青花椒幽影病毒、永青花椒負(fù)鏈RNA病毒也需要后續(xù)研究其在單獨(dú)感染花椒時(shí)是否會(huì)造成黃花病癥,同時(shí)不排除病毒協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致花椒黃花病癥的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究利用HTS技術(shù)從昭通竹葉花椒永青1號(hào)中均發(fā)現(xiàn)已報(bào)到的四川青花椒病毒(GSPIV、GSPNeV、GSPEV、GSPNuV)和未報(bào)道的永青花椒幽影病毒、永青花椒負(fù)鏈RNA等多種病毒,其中PVM、PVS、PVH等乙型線形病毒科病毒僅從感病組中發(fā)現(xiàn),通過RT-PCR驗(yàn)證了GSPNeV、PVM等病毒與本研究樣品的相關(guān)性,推測(cè)高表達(dá)的香石竹潛隱病毒屬病毒或可誘發(fā)花椒FYD癥狀。本研究為后續(xù)明確花椒黃花病的病原奠定了理論基礎(chǔ)。