鄭妍妍,王燕,李蓓
西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西西安 710002
杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一種X染色體連鎖的隱性遺傳病,由編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的基因突變所致。分裂的成肌細胞是肌肉生長和維持所必需的,而成肌細胞的有限生長能力與DMD的進行性肌肉退化特征直接相關(guān)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計顯示,全球新生男嬰DMD 患病率為1/3500[3],而目前臨床尚無有效療法。因此,研究DMD發(fā)生和發(fā)展的機制對實現(xiàn)該病的早期診斷、干預具有重要的臨床意義。DMD基因位于染色體Xp21,編碼含有3685個氨基酸的dystrophin(427 kD)。肌細胞膜表面存在抗肌萎縮-糖蛋白復合物(dystrophin-associated protein complex,DAPC),可維持細胞結(jié)構(gòu)的完整性和細胞膜內(nèi)外的傳遞運輸功能,而dystrophin 是DAPC 的重要組成部分[4]。N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物RNA 中最廣泛的內(nèi)部修飾,參與多個生物學過程。不同的閱讀蛋白(包括YTHDF、YTHDC 和IGFBP 等家族蛋白)可特異性識別m6A 修飾,并調(diào)節(jié)RNA 的穩(wěn)定性[5]。研究發(fā)現(xiàn),m6A 修飾在肌肉干細胞維持、肌細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[6]。Yes1 相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(Yes1 associated transcriptional regulator,YAP1)是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子,可促進細胞增殖以及調(diào)節(jié)器官發(fā)育和再生,最近研究發(fā)現(xiàn),在DMD 心臟組織中YAP1 活性明顯降低;而抑制YAP1 活性可明顯降低DMD 多能干細胞衍生的心肌細胞增殖,誘導DMD心肌病的發(fā)生[7],但YAP1 是否通過調(diào)節(jié)m6A 修飾水平調(diào)控肌細胞增殖尚不明確。本研究通過檢測DMD患者和健康人群肌肉組織中YTHDF1 和dystrophin 的表達水平,觀察過表達或干擾YTHDF1 對人骨骼肌成肌細胞增殖的影響,探究YTHDF1對DMD中成肌細胞生物學行為的影響及其潛在作用機制。
1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、Ham's F-10 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、慶大霉素購自美國Invitrogen 公司;人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)、地塞米松、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶-EDTA 溶液購自美國Sigma 公司;YTHDF1 過表達質(zhì)粒AAV-YTHDF1及YTHDF1 小干擾RNA(si-YTHDF1) 購自美國Addgene 公司;PrimeScript RT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司;BCA 蛋白含量測定試劑盒、EdU 試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司;磷酸肌酸激酶(creative phospho kinase,CPK) ELISA試劑盒購自上??祈樕锟萍加邢薰荆籥nti-YTHDF1 抗體、antidystrophin 抗體、anti-YAP1 抗體、anti-肌細胞生成素(myogenin,MyoG)抗體、anti-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)抗體、anti-m6A 抗體購自英國Abcam公司;Magna RIP RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒、Magna甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP) m6A試劑盒購自美國Millipore 公司;放線菌素D 購自武漢艾美捷科技有限公司。實時熒光定量PCR 儀購自德國Eppendorf 公司;Thermo Varioskan? LUX 多功能酶標儀、NanoDrop 2000 分光光度儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;Western blotting 轉(zhuǎn)膜儀購自北京凱元信瑞儀器有限公司;蛋白電泳儀及配套電泳槽購自美國Bio-Rad 公司;凝膠成像儀購自英國Uvitec Cambridge 公司;倒置普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2 標本收集 收集2016 年9 月-2017 年6 月于西安市兒童醫(yī)院確診并進行手術(shù)的38 例DMD 患者(設(shè)為DMD 組)和33 例接受骨科手術(shù)且與DMD 患者年齡匹配(2~3 歲)的患者(未患有其他干擾性疾病,設(shè)為對照組)的肌肉組織和血液樣本(入院時采集,于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。納入標準:(1)經(jīng)病理和(或)基因檢測確診為DMD;(2)年齡<18 歲。排除標準:(1)不能配合完成檢查;(2)病理及影像資料不完整;(3)存在MRI檢查禁忌證。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(20160918-1F),所有受試者或監(jiān)護人均簽署知情同意書。
1.2.1 RT-qPCR 檢 測YTHDF1mRNA 水 平 使 用Trizol 試劑提取肌肉組織總RNA,并用Prime Script RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ在ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)中進行實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR。PCR反應體系(20 μl):cDNA 2 μl、Taq聚合酶0.4 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 6 μl、2×SYBR綠色PCR 混合液10 μl。PCR 反應條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s,35 個 循 環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計算YTHDF1mRNA相對表達水平。引物序列如表1所示。
表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR
1.2.2 Western blotting檢測YTHDF1、dystrophin蛋白表達水平 提取肌肉組織總蛋白,使用BCA 蛋白含量測定試劑盒進行蛋白定量。上樣行SDS-PAGE 電泳,并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上;加入5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST 清 洗;加 入YTHDF1、dystrophin 抗 體(1:1000)4 ℃孵育過夜;TBST清洗,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠/兔IgG 抗體(1:500)室溫孵育1 h。使用ECL Plus 化學發(fā)光試劑盒進行曝光,化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍片,以GAPDH為內(nèi)參照,ImageJ軟件進行定量分析。
1.2.3 血清CPK 含量檢測 取血液樣本,1000×g離心10 min,收集上清,按照CPK ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清CPK含量。
1.2.4 YTHDF1 蛋白表達水平與血清CPK 含量的相關(guān)性分析 采用Pearson 相關(guān)性分析YTHDF1 蛋白表達水平與血清CPK含量的相關(guān)性。
1.3 細胞培養(yǎng) 人類骨骼肌細胞系(SkMC)由中科院上海生命科學研究院細胞中心提供,置于含hEGF、地塞米松、L-谷氨酰胺和慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,補充10% FBS,于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)。
1.3.1 過表達載體構(gòu)建及siRNA 合成 根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中YTHDF1 編碼區(qū)(CDS)序列,設(shè)計上下游分別含有XhoI和BamHI酶切位點的PCR 引物擴增目的片段,雙酶切、膠回收純化后將其連接于進行相同雙酶切處理的腺病毒表達載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞,過夜培養(yǎng)。第2 天挑取單克隆搖菌,提取質(zhì)粒后經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切鑒定及測序后,確認載體構(gòu)建成功。參照腺病毒包裝規(guī)程進行病毒包裝,并進行滴度檢測。YTHDF1siRNA及其陰性對照(NC siRNA)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計、合成。
1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期SkMC 細胞,接種于6孔板中(接種密度105個/cm2)。設(shè)置空載體組(轉(zhuǎn)染 對 照 空 載 體)、 AAV-YTHDF1 組( 轉(zhuǎn) 染AAVYTHDF1 過表達載體)與Scrambled 組(轉(zhuǎn)染NC siRNA)、si-YTHDF1 組(轉(zhuǎn)染YTHDF1siRNA),待細胞融合至70%時,使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后于37 ℃培養(yǎng)48 h,收集細胞。
1.3.2.1 Western blotting 檢測YTHDF1過表達或敲低效率 提取各組SkMC 細胞總蛋白,采用Western blotting 檢測YTHDF1 蛋白表達水平,一抗YTHDF1抗體稀釋比例為1∶1000。操作步驟同1.2.2。
1.3.2.2 EdU 法檢測細胞增殖情況 根據(jù)EdU 試劑盒說明書步驟,使用5-乙基-2-脫氧尿苷(EdU)摻入法檢測各組細胞增殖情況。加入EdU 孵育細胞約2 h,4%多聚甲醛溶液固定30 min,0.5% Triton X-100 孵育15 min,染色反應液孵育30 min。細胞核用Hoechst染色。隨機選取5個區(qū)域于顯微鏡下觀察拍片。
1.3.2.3 Western blotting 檢 測dystrophin、 YAP1、MyoG、MHC 蛋白表達水平 提取SkMC 細胞總蛋白,采用Western blotting 檢測dystrophin、YAP1、MyoG、MHC 蛋白表達水平,操作步驟同1.2.2。一抗dystrophin 抗體、YAP1 抗體、MyoG 抗體和MHC抗體稀釋比例為1∶1000。
1.3.2.4 RT-qPCR檢測YTHDF1、YAP1mRNA表達水平 使用Trizol 試劑提取SkMC 細胞總RNA,采用RT-qPCR 檢測YTHDF1、YAP1mRNA 表達水平,操作步驟同1.2.1。
1.3.3 SRAMP在線數(shù)據(jù)庫預測 采用SRAMP在線數(shù)據(jù)庫預測YAP1mRNA序列中的m6A修飾位點。
1.3.4 RNA免疫沉淀反應(RIP)檢測YTHDF1與YAP1mRNA的結(jié)合情況 根據(jù)Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒說明書步驟進行RIP 測定。用補充有蛋白酶和RNase抑制劑的RNA裂解緩沖液裂解SkMC細胞,并在4 ℃下用涂有anti-YTHDF1 抗體、antim6A 抗體或IgG 的蛋白A/G 磁珠培養(yǎng)細胞裂解物過夜。洗滌后,純化免疫沉淀RNA,然后采用RTqPCR進行定量分析。
1.3.5 mRNA 穩(wěn)定性檢測 轉(zhuǎn)染YTHDF1siRNA 16 h后,使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D 干預,收取干預0、2、4、8及16 h的細胞,提取總RNA,用酶標儀檢測RNA 濃度,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過RT-qPCR 檢測YAP1mRNA表達水平,分析降解速率。
1.4 動物實驗 30 只雄性SPF 清潔級Mdx 小鼠,4 周齡,體重10~18 g,購自西安交通大學實驗動物中心[實驗動物許可證號:SYXK(陜)2016-005],飼養(yǎng)于12 h 光照/12 h 黑暗交替、溫度(22±3) ℃、濕度45%~60%環(huán)境下,自由攝食飲水。本動物實驗經(jīng)西安市兒童醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會批準(20160918-1F)。
1.4.1 DMD小鼠模型構(gòu)建 將30只Mdx小鼠隨機分為空載體組與AAV-YTHDF1組,每組15只??蛰d體組腹腔注射200 μl 空載體,AAV-YTHDF1 組腹腔注射200 μl AVV-YTHDF1。注射時間為第1 天、第1 次注射后48 h、第1次注射后15 d。每天監(jiān)測小鼠的飲食、呼吸、精神狀態(tài)和體重。距第1 次注射20 周處死小鼠,采集肌肉組織和器官,檢測肌肉組織和器官濕重、纖維直徑及纖維類型。
1.4.2 Western blotting檢測YTHDF1、dystrophin蛋白表達水平 將肌肉組織制備為組織勻漿液,采用Western blotting檢測YTHDF1、dystrophin蛋白表達水平,具體操作同1.2.2。
1.4.3 HE染色 小鼠處死后立即取后肢腓腸肌和股四頭肌,組織塊大小不超過0.5 cm3。用0.9%生理鹽水漂洗血液與污漬,將組織放入包埋盒中,迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)切片后行HE 染色,于顯微鏡下觀察。
1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 YTHDF1在DMD患者肌肉組織中的表達情況RT-qPCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,DMD 組患者肌肉組織中YTHDF1mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01或P<0.001,圖1A、B)。ELISA 檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,DMD 組患者血清CPK含量明顯增加(P<0.001,圖1C)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,DMD患者YTHDF1蛋白表達水平與血清CPK 含量呈負相關(guān)(r2=0.8658,P<0.0001,圖1D)。Western blotting 檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,DMD 組患者肌肉組織中dystrophin 蛋白表達水平明顯降低(P<0.01,圖1E)。
圖1 兩組患者肌肉組織中YTHDF1、dystrophin表達水平及血清CPK含量比較Fig.1 Comparison of YTHDF1 and dystrophin expression levels in muscle tissue and serum CPK content between DMD patients and control peoples
2.2 過表達YTHDF1對肌細胞增殖和dystrophin表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1組SkMC細胞中YTHDF1蛋白表達水平明顯升高(P<0.01,圖2A),表明YTHDF1 過表達實驗成功。與空載體組比較,AAV-YTHDF1 組SkMC 細胞中dystrophin、MyoG 和MHC 蛋白表達水平明顯升高(P<0.01,圖2B)。EdU檢測結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1 組EdU 陽性細胞率明顯增高(P<0.01,圖2C)。
圖2 過表達YTHDF1對肌細胞增殖及dystrophin、MyoG和MHC蛋白表達的影響Fig.2 Effects of overexpression of YTHDF1 on myocyte proliferation and expression levels of dystrophin, MyoG and MHC
2.3 敲低YTHDF1對肌細胞增殖和dystrophin表達的影響 Western blotting 檢測結(jié)果顯示,與Scrambled組比較,si-YTHDF1 組SkMC 細胞中YTHDF1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01,圖3A),表明YTHDF1 敲低實驗成功。與Scrambled 組比較,si-YTHDF1 組SkMC 細胞中dystrophin、MyoG 和MHC 蛋白表達水平明顯降低(P<0.01,圖3B)。EdU檢測結(jié)果顯示,與Scrambled 組 比 較,si-YTHDF1 組EdU 陽 性 細 胞 率 明顯降低(P<0.05,圖3C)。
圖3 敲低YTHDF1對肌細胞增殖和dystrophin、MyoG和MHC蛋白表達的影響Fig.3 Effects of YTHDF1 knockdown on myocyte proliferation and expression levels of dystrophin, MyoG and MHC
2.4 YTHDF1與YAP1mRNA的相互作用 SRAMP在線數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果顯示,YAP1mRNA 上存在多個m6A 修飾位點(圖4A);RIP 檢測結(jié)果顯示,Anti-YTHDF1 抗 體 組 中YAP1mRNA 富 集, 而Anti-YTHDF1抗體組與IgG抗體組中dystrophinmRNA含量無明顯差異(圖4B);anti-m6A 抗體組中YAP1mRNA富集(圖4C),表明YTHDF1通過識別YAP1mRNA 的m6A修飾與YAP1mRNA相互作用。
圖4 YTHDF1蛋白與YAP1 mRNA的相互作用Fig.4 The interaction between YTHDF1 protein and YAP1 mRNA
2.5 YTHDF1 對YAP1 表達和YAP1mRNA 穩(wěn)定性的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1 組YAP1 蛋白表達水平明顯升高(P<0.01);與Scrambled 組比較,si-YTHDF1 組YAP1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01,圖5A)。放線菌素D干預實驗結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1組YAP1mRNA半衰期延長,同一時間點YAP1mRNA降解減少(P<0.001,圖5B)。
2.6 YTHDF1對DMD小鼠肌肉生長和肌肉質(zhì)量的影響 AAV-YTHDF1 組與空載體組小鼠初次注射時體重無明顯差異(P>0.05),但20 周時,AAV-YTHDF1組小鼠體重較空載體組增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖6A)。Western blotting 檢測結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1 組小鼠肌肉組織中YTHDF1 和dystrophin 蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01,圖6B)。與空載體組比較,AAV-YTHDF1組小鼠腓腸肌、股四頭肌、三頭肌肌肉重量增加(P<0.05);但兩組腹股溝、性腺或腹膜后脂肪墊重量無明顯差異(P>0.05,圖6C)。HE 染色結(jié)果顯示,與空載體組比較,AAV-YTHDF1 組小鼠炎性細胞浸潤減少,壞死面積縮小,組織病理學改變明顯得到改善(P<0.05);此外,與空載體組比較,AAV-YTHDF1組小鼠腓腸肌和股四頭肌纖維面積明顯增大(P<0.05,圖6D)。
圖6 YTHDF1對DMD小鼠肌肉生長和肌肉質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of YTHDF1 on muscle growth and muscle mass in DMD mice
DMD是最常見的遺傳性神經(jīng)性肌肉病,起病隱匿且預后差,大多數(shù)患者早期無明顯臨床癥狀,導致診斷困難和誤診。在美國,DMD從癥狀開始到確診約有2.5年的延遲,而在全球其他地區(qū),延遲時間則更長[8]。DMD 是一種主要影響男孩的疾病,其特征是進行性肌肉退行性變和萎縮,導致心肌病和呼吸衰竭,最終導致患兒過早死亡[9]。
DMD 的分子遺傳學基礎(chǔ)是dystrophin基因突變[10]。Dystrophin基因突變導致dystrophin 蛋白突變,而dystrophin位于肌細胞膜內(nèi)側(cè)面,是一種大型支架蛋白,可與相關(guān)糖蛋白組成DAPC[10-11]。DAPC 將細胞外基質(zhì)錨定到細胞骨架上,使肌肉纖維抵抗損傷的能力明顯增強,是肌肉收縮過程中維持肌膜結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵蛋白[12]。雖然多數(shù)骨骼肌的初始形成在發(fā)育過程中不受阻礙,但由于與肌肉收縮相關(guān)的機械應力導致外周膜受損,肌肉纖維會隨著個體的成熟而迅速退化[13]。隨著疾病的加重,被稱為衛(wèi)星細胞的骨骼肌祖細胞無法充分增殖和分化以替代受損的肌肉纖維[14]。有報道顯示,可以利用內(nèi)源性機制促進肌細胞持續(xù)增殖來維持骨骼肌的再生能力,減輕DMD造成的損害[15]。
Dystroglycan 1 又稱為dystrophin 相關(guān)糖蛋白,通常與dystrophin 形成蛋白復合物發(fā)揮作用。Dystroglycan 1 可直接與Hippo 通路的效應因子YAP1結(jié)合,抑制小鼠心肌細胞的增殖,當編碼dystroglycan 1 的基因被敲除時,這種相互作用被破壞,而Hippo 誘導的YAP1 磷酸化增強了YAP1 與dystroglycan 1 的 相 互 作 用[12]。YAP1 作 為Hippo 信 號通路下游的關(guān)鍵效應因子,可調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和凋亡,控制器官發(fā)育和再生,以及維持正常組織的穩(wěn)態(tài),在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn),dystrophin 與Hippo 信號通路的關(guān)鍵激酶Wts 存在相互作用,并且dystrophin 能夠通過結(jié)合Wts 調(diào)控果蠅的器官發(fā)育[17]。本研究發(fā)現(xiàn),DMD 患者肌肉組織中dystrophin表達水平明顯降低;過表達YTHDF1 可促進肌細胞增殖,使dystrophin 蛋白表達水平升高;敲低YTHDF1 可抑制肌細胞增殖,使dystrophin蛋白表達水平降低。
YAP1作為潛在的致癌基因[18],目前研究主要集中于YAP1 上下游分子的篩選[19];然而,關(guān)于YAP1表達水平調(diào)控的機制尚未完全清楚。m6A 修飾是真核細胞中最豐富的RNA 內(nèi)部修飾,可被m6A 結(jié)合蛋白(reader)識別,包括YTHDF1-3、IGF2BP1-3 和YTHDC1-2[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常肌肉組織比較,m6A 識別蛋白YTHDF1 在DMD 肌肉組織中表達降低。既往研究發(fā)現(xiàn),YTHDFs 可識別YAP1mRNA 的m6A 修飾,其可通過與m6A 修飾的mRNA 結(jié)合來提高穩(wěn)定性,從而促進YAP1的表達[21-24]。本研究結(jié)果證實了這一現(xiàn)象,即過表達YTHDF1 通過延長YAP1mRNA的半衰期來穩(wěn)定YAP1mRNA表達。
MyoG和MHC是成肌細胞分化過程中骨骼肌特異性表達的關(guān)鍵基因。MyoG是骨骼肌分化的決定因子,調(diào)控成肌細胞融合和肌纖維形成[25],MyoG敲除小鼠因無肌肉形成,在胚胎期死亡[26];MHC是構(gòu)成骨骼肌纖維內(nèi)粗肌絲的主要成分。肌纖維類型主要由肌纖維內(nèi)表達的MHC 類型決定[27]。本研究發(fā)現(xiàn),過表達YTHDF1 可促進MyoG 和MHC 蛋白的表達;敲低YTHDF1可抑制MyoG和MHC蛋白的表達。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,YTHDF1 通過識別YAP1mRNA 的m6A 修飾促進YAP1mRNA 的穩(wěn)定性,進而促進YAP1/dystrophin 介導的肌細胞增殖,改善DMD 小鼠的肌肉萎縮。未來可進一步完善DMD 肌肉萎縮的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以為DMD 的診斷及治療提供理論依據(jù)和新的視角。