彭云 溫美玲 呂云霞 陳萬(wàn)志 何春 俞建平 丁振羅

1贛州市人民醫(yī)院甲狀腺外科（江西贛州 341000）；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院甲狀腺外科（南昌 330000）

甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)［1-2］。目前手術(shù)、放射性核素和內(nèi)分泌治療，雖然顯著提高患者生存率，但仍有部分患者會(huì)復(fù)發(fā)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。此外，TC 發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明，因此，深入研究TC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可能有助于發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善患者生存具有重要意義。lncRNA 對(duì)多種癌癥的生物學(xué)進(jìn)程具有調(diào)控作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，DSCAM-AS1 在肝細(xì)胞癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］和骨肉瘤組織和細(xì)胞［7］中異常高表達(dá)，并能促進(jìn)這些癌癥的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示，LncRNA DSCAM-AS1、BRAF 與miR-150-5p 存在靶向關(guān)系，miR-150-5p 在多數(shù)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。研究［8］顯示，miR-150-5p 通過(guò)靶向調(diào)控EZH2 表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡，減弱TC的進(jìn)展。BRAF 參與TC 的發(fā)展，其基因突變與TC患者的甲狀腺外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［9］。推測(cè)LncRNA DSCAM-AS1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150-5p/BRAF 軸影響TC 的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究在體內(nèi)體外驗(yàn)證LncRNA DSCAM-AS1 對(duì)TC 發(fā)生發(fā)展的影響，以期為T(mén)C 的靶向治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 人正常甲狀腺上皮細(xì)胞TEC 及人TC 細(xì)胞系SW579、TPC-1、BCPAP 購(gòu)于美國(guó)ATCC。6 周齡SPF 級(jí)BALB/c 裸鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（豫）2022-0001，體質(zhì)量15 ～ 20 g。

1.2 主要試劑與儀器 MTT 試劑盒購(gòu)于江蘇麥格公司；RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、EdU apollo 488 in vitro 試劑盒購(gòu)于北京Solarbio；qRT-PCR 試劑盒購(gòu)于江西艾博公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（RG029S）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源一抗vimentin、E-cadherin、BRAF、Ki67、GAPDH 及HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；多功能酶標(biāo)儀（LD-96A）山東萊恩德智能科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX96 Touch）上海艾研生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（CX31）日本奧林巴斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將TEC、TPC-1、SW579、BCPAP 接種至DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后，檢測(cè)細(xì)胞DSCAM-AS1 表達(dá)水平。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW579 細(xì)胞，按照1.2 × 106個(gè)接種于6 孔板中，使用轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)質(zhì)粒將細(xì)胞分為si-NC 組、si-DSCAM-AS1 組、si-DSCAM-AS1+NC inhibitor 組、si-DSCAM-AS1+miR-150-5p inhibitor 組、miR-NC 組、miR-150-5p mimics組、miR-150-5p mimics+pcDNA 組、miR-150-5p mim?ics+BRAF 組，轉(zhuǎn)染48 h 后檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DSCAM?AS1 在SW579 細(xì)胞定位檢測(cè) 使用細(xì)胞核/胞漿分離試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，收集大約5 × 106個(gè)SW579 細(xì)胞，500×g離心5 min，取細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷的PBS洗滌2次、離心棄上清、在細(xì)胞沉淀加入預(yù)冷的提取液，冰上靜置30 min、1 200 ×g離心5 min，上清為胞漿組分、沉淀為細(xì)胞核組分。qRT-PCR 法檢測(cè)DSCAM-AS1 表達(dá)。

1.3.3 FISH 與pull down 實(shí)驗(yàn) SW579 細(xì)胞經(jīng)組織固定液固定15 min、脫水后，加入10 μL 雜交緩沖液與1 μL 的Cy3 標(biāo)記的DSCAM-AS1 熒光探針，46 ℃恒溫箱，雜交1.5 h，DAPI 溶液復(fù)染細(xì)胞核15 min，PBS 清洗、晾干后，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

將生物素化的miR-150-5p-wt/mut探針與SW579細(xì)胞裂解物4 ℃下孵育過(guò)夜，以生物素標(biāo)記的無(wú)意義RNA 序列作為陰性對(duì)照（NC），加入裂解液提取RNA，qRT-PCR 檢測(cè)相對(duì)RNA 富集。

1.3.4 雙熒光素酶活性檢測(cè) 分別構(gòu)建含有DSCAM-AS1 與BRAF 野生型（wt）、突變型（mut）表達(dá)載體，將突變位點(diǎn)克隆至PmirGLO 載體，將DSCAM-AS1-wt、DSCAM-AS1-mut、BRAF-wt、BRAFmut 分別與miR-NC、miR-150-5p mimics 共轉(zhuǎn)染SW579 細(xì)胞48 h，熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.5 DSCAM?AS1、miR?150?5p 表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR 法檢測(cè)DSCAM-AS1、miR-150-5p 表達(dá)水平，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以GAPDH、U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算DSCAM-AS1、miR-150-5p 相對(duì)表達(dá)。DSCAM-AS1 上游引物：5′-GT?GACAGCAAGACTCCCT-3′和下游引物5′-GATCC?GTCGTCCATCTGT-3′；miR-150-5p上游引物5′-ACT?GTCTCCCAACCCTTGTA-3′和下游引物5′-GTG?CAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT-3′和下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 細(xì)胞增殖檢測(cè) 各組轉(zhuǎn)染后的SW579 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 的EdU 溶液，孵育2 h，PBS 洗滌，經(jīng)固定通透后，加入100 μL的1×Apollo 染液反應(yīng)，染色30 min，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算Edu 陽(yáng)性細(xì)胞率。

另取轉(zhuǎn)染后的各組SW579 細(xì)胞按照800 ～1 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，連續(xù)培養(yǎng)14 d，固定后用0.5%結(jié)晶紫溶液染色觀察集落形成數(shù)。

1.3.7 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的SW579 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，使用涂有Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell 小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)未涂有Matrigel 基質(zhì)膠，各組細(xì)胞取200 μL（2 × 105）細(xì)胞懸液加入上室，下室加入600 μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，固定染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.8 Western blot法BRAF、E?cadherin、vimentin蛋白檢測(cè) BRAF、E?cadherin、vimentin 及GAPDH一抗稀釋液按照1∶1 500 稀釋?zhuān)琀RP 標(biāo)記的二抗按照1∶1 000 稀釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)結(jié)束后，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析各蛋白表達(dá)。

1.3.9 體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn) 6 周齡BALB/c 裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為si-DSCAM-AS1 組、si-NC 組，每組8 只，通過(guò)皮下注射200 μL（5 × 106）si-DSCAM-AS1 或si-NC 轉(zhuǎn)染的SW579 細(xì)胞，每周測(cè)量移植瘤體積，28 d 后，處死小鼠分離腫瘤，測(cè)量腫瘤質(zhì)量與體積，qRT-PCR 檢測(cè)移植瘤組織中LncRNA DSCAM-AS1、miR-150-5p 表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)移植瘤組織BRAF、Ki-67 蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)。P< 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DSCAM?AS1 在細(xì)胞中的表達(dá) 與TEC 細(xì)胞比較，DSCAM-AS1 在SW579、TPC-1、BCPAP 表達(dá)水平顯著升高（F= 123.50，P< 0.05），且DSCAM-AS1在SW579 細(xì)胞中表達(dá)水平最高，選擇SW579 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 DSCAM-AS1 在細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of DSCAM-AS1 in cells

2.2 DSCAM?AS1靶向調(diào)控miR?150?5p表達(dá) 核/細(xì)胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)與FISH 實(shí)驗(yàn)表明，DSCAM-AS1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖2A、B）。經(jīng)starBase 在線分析顯示，DSCAM-AS1 與miR-150-5p 有結(jié)合位點(diǎn)（圖2C），下拉實(shí)驗(yàn)證明，生物素標(biāo)記的miR-150-5p-wt 比NC 及miR-150-5p-mut 探針捕獲更多的DSCAM-AS1（圖2D）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，DSCAMAS-wt 與miR-150-5p mimics 共轉(zhuǎn)染SW579 細(xì)胞后，與miR-NC 比較，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）（圖2E）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，在SW579 細(xì)胞中抑制DSCAM-AS1 表達(dá)可顯著升高miR-150-5p 表達(dá)水平（F= 116.437，P< 0.05），而抑制miR-150-5p表達(dá)對(duì)DSCAM-AS1 表達(dá)無(wú)顯著影響（P> 0.05）（圖2F）。

圖2 DSCAM-AS1 靶向調(diào)控miR-150-5p 表達(dá)Fig.2 DSCAM-AS1 targeted regulation of miR-150-5p expression

2.3 DSCAM?AS1靶向調(diào)節(jié)miR?150?5p對(duì)SW579細(xì)胞惡性行為的影響 與si-NC組比較，si-DSCAMAS1 組SW579 細(xì)胞Edu 陽(yáng)性率、集落形成數(shù)、遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)及vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高，與si-DSCAMAS1+NC inhibitor 組比較，si-DSCAM-AS1+miR-150-5p inhibitor 組SW579 細(xì)胞Edu 陽(yáng)性率、集落形成數(shù)、遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)及vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（F=171.543、39.669、59.968、41.767、169.227、158.783，P< 0.05）（圖3）。

圖3 DSCAM-AS1 靶向調(diào)節(jié)miR-150-5p 對(duì)SW579 細(xì)胞惡性行為的影響Fig.3 The effect of DSCAM-AS1 on the malignant behavior of SW579 cells by targeting miR-150-5p

2.4 miR?150?5p 與BRAF 靶向關(guān)系驗(yàn)證 經(jīng)star?Base 在線分析顯示，miR-150-5p 與BRAF 基因有靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）；下拉實(shí)驗(yàn)證明，miR-150-5p 與BRAF 結(jié)合（圖4B）；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與BRAF-wt+miR-NC 共轉(zhuǎn)染比較，BRAF-wt+miR-150-5p mimics 共轉(zhuǎn)染SW579 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P< 0.05）（圖4C）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，在SW579細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-150-5p可顯著下調(diào)BRAF表達(dá)水平（t= 16.267，P< 0.05）（圖4D、E）。

圖4 miR-150-5p 與BRAF 靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.4 Verification of the targeting relationship between miR-150-5p and BRAF

2.5 miR-150-5p 靶向調(diào)節(jié)BRAF 對(duì)SW579 細(xì)胞惡性行為的影響 與miR-NC 組比較，miR-150-5p mimics 組SW579 細(xì)胞Edu 陽(yáng)性率、集落形成數(shù)、遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)及vimentin 表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin 表達(dá)水平顯著升高，與miR-150-5p mim?ics+pcDNA 組比較，miR-150-5p mimics+BRAF 組SW579 細(xì)胞Edu 陽(yáng)性率、集落形成數(shù)、遷移與侵襲細(xì)胞及vimentin表達(dá)水平數(shù)顯著升高（P< 0.05），E-cadherin表達(dá)水平顯著降低（F= 176.776、58.926、32.248、39.609、122.911、182.620，P< 0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 體內(nèi)抑制LncRNA DSCAM?AS1 表達(dá)抑制TC 腫瘤生長(zhǎng) si-DSCAM-AS1 組小鼠移植瘤體積與重量顯著低于si-NC 組（t= 12.912，P< 0.05）；si-DSCAM-AS1 移植瘤中LncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)水平顯著降低，miR-150-5p 表達(dá)水平顯著升高（t= 17.379、12.211，P< 0.05）；si-DSCAM-AS1 組移植瘤中，BRAF、Ki-67 陽(yáng)性率顯著降低（t=14.933、20.252，P< 0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 LncRNA DSCAM-AS1 對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of LncRNA DSCAM-AS1 on the growth of transplanted tumor in nude mice

3 討論

TC 的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境和表觀遺傳改變等因素［10］。盡管在檢測(cè)和治療技術(shù)方面取得了進(jìn)步，但仍有部分TC 患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這凸顯了開(kāi)發(fā)更有效療法的重要性［11］。

據(jù)多項(xiàng)報(bào)道［12-13］顯示，LncRNAs 的異常表達(dá)可導(dǎo)致TC 的調(diào)節(jié)異常，與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，如LncRNA NORAD、LncRNA XIST 在TC 組織和細(xì)胞中異常高表達(dá)，通過(guò)調(diào)控miR-451、miR-34a/MET/PI3K/AKT調(diào)節(jié)TC細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。研究［5-7，14］發(fā)現(xiàn)，LncRNA DSCAM-AS1 在肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤和結(jié)腸癌等多種腫瘤中發(fā)揮致癌功能，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA DSCAM-AS1 在TC 組織和SW579、TPC-1、BCPAP 細(xì)胞中高表達(dá)，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)可顯著抑制TC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT，表明LncRNA DSCAM-AS1 在TC 中發(fā)揮癌基因的作用。

LncRNA 可作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA 或miRNA"海綿"來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤中關(guān)鍵基因，從而發(fā)揮腫瘤抑制或腫瘤促進(jìn)功能［15］。本研究顯示，LncRNA DSCAMAS1 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明LncRNA DSCAMAS1 在TC 細(xì)胞中發(fā)揮CeRNA 的作用。此外生物信息學(xué)分析、pull down 及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-150-5p 可與LncRNA DSCAM-AS1 靶向結(jié)合。miR-150-5p 被證明是一種腫瘤抑制因子，miR-150-5p 過(guò)表達(dá)抑制結(jié)直腸癌［16］、非小細(xì)胞肺癌［17］細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)。在TC中，miR-150-5p 作為L(zhǎng)ncRNA-MIAT 的下游分子，發(fā)揮抑癌基因的作用［8］。本研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-150-5p 可抑制TC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT，LncRNA DSCAM-AS1 負(fù)向調(diào)控miR-150-5p 表達(dá)，促進(jìn)TC 的惡性生物學(xué)行為。

miRNA 通過(guò)與靶mRNA 內(nèi)的互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對(duì)，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)BRAF 是miR-150-5p 的靶點(diǎn)基因，miR-150-5p 可靶向調(diào)節(jié)BRAF 表達(dá)影響SW579 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。BRAF 在包括TC 在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，BRAF 是MAPK 信號(hào)通路的一部分，在BRAF 基因第15 中外顯子的突變（BRAFV600），造成MAPK 通路持續(xù)活化，從而導(dǎo)致參與細(xì)胞增殖的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［19-21］。BRAFV600E突變與TC 復(fù)發(fā)及相關(guān)死亡率顯著相關(guān)，沉默BRAF 基因表達(dá)顯著抑制體外和體內(nèi)的癌細(xì)胞侵襲和腫瘤生長(zhǎng)［22-23］。然而，BRAF 如何影響TC 進(jìn)展的分子機(jī)制尚未完全闡明［24］。

本研究證實(shí)，miR-150-5p 與BRAF 存在靶向關(guān)系，且在SW579 細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-150-5p 可顯著降低BRAF 表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)BRAF 可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-150-5p 對(duì)SW579 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)可顯著抑制移植瘤生長(zhǎng)及BRAF表達(dá)，促進(jìn)miR-150-5p表達(dá)。LncRNA DSCAM-AS1/miR-150-5p/BRAF 軸可能成為治療TC 的一種新的靶點(diǎn)。

綜上所述，LncRNA DSCAM-AS1 在TC 細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150-5p/BRAF 信號(hào)軸，抑制TC 惡性進(jìn)展。

【Author contributions】PENG Yun performed the experiments and wrote the article.WEN Meiling，YU Jianping and DING Zhenluo per?formed the experiments.LV Yunxia and CHEN Wanzhi revised the article.HE Chun designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.