朱永莉，沈永寶

(1.上海商學(xué)院藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院， 上海 201400；2.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京210037；4.國(guó)家林業(yè)局南方林木種子檢驗(yàn)中心，江蘇 南京 210037；5.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

激素作為植物自身代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類特殊的微量小分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段起著重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用[1-2]。許多研究表明，生長(zhǎng)素（IAA）[3]、細(xì)胞分裂素（CTK）[4]、赤霉素（GA）[5]、脫落酸（ABA）[6]、乙烯[7]、油菜素內(nèi)酯（BR）[8]等植物激素對(duì)種子發(fā)育具有重要作用。種子發(fā)育過(guò)程不僅與植物內(nèi)源激素的絕對(duì)含量有關(guān)，而且還與各類激素之間的比值密切相關(guān)，各激素間的動(dòng)態(tài)平衡可能對(duì)種子的發(fā)育影響更大[9]，特別是促進(jìn)生長(zhǎng)與抑制生長(zhǎng)的激素之間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系[10]。

桂花（Osmanthus fragransLour.）作為著名的庭院觀賞樹(shù)木，在我國(guó)已有2 500 多年的栽培歷史，相關(guān)研究及推廣應(yīng)用非常廣泛，但與桂花繁殖生物學(xué)相關(guān)的研究?jī)H限于胚胎學(xué)[11-13]、傳粉生物學(xué)[14-15]及少量的種子生物學(xué)（種子休眠及解除）[16-19]，目前尚未見(jiàn)桂花種子發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源激素含量變化的相關(guān)研究。本研究選取種子結(jié)實(shí)量大且具有休眠特性的重要桂花品種紫梗籽銀桂為研究材料，通過(guò)對(duì)桂花種子發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸等激素含量變化的分析，揭示內(nèi)源激素在桂花種子發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用，分析桂花種子不同發(fā)育期內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)種子發(fā)育的影響，旨在為了解內(nèi)源激素對(duì)桂花種子發(fā)育的調(diào)控規(guī)律提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紫 梗 籽 銀 桂 （Osmanthus fragrans‘Zigengziyin’）種子采于南京市八卦洲街道院內(nèi)。紫梗籽銀桂花期9—10 月，果實(shí)成熟于次年4—5 月。胚乳于花后80 d 開(kāi)始取樣，胚自花后180 d 開(kāi)始大量形成并進(jìn)行取樣，至翌年果實(shí)成熟每隔15～20 d 進(jìn)行取樣，胚乳共取樣10 次，胚4 次（如圖1 所示）。采集的材料用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后立即去除果皮取出種子，分別剝離胚和胚乳，放入-76 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 紫梗籽銀桂種實(shí)發(fā)育過(guò)程的形態(tài)變化Fig.1 The change during fruit development of Osmanthus fragrans ‘Zigengziyin’

1.2 試驗(yàn)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別對(duì)胚和胚乳進(jìn)行內(nèi)源激素含量的測(cè)定，激素含量使用鮮質(zhì)量表示，單位為ng·g-1，3 次重復(fù)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用MicrosoftExcel 2013 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理和圖表制作，方差分析采用SPSS20.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚的內(nèi)源激素含量變化

2.1.1 生長(zhǎng)素（IAA）含量變化 胚中IAA 的含量呈先上升后下降再快速上升的趨勢(shì)（圖2A）?；ê?80 d，胚中IAA 含量為31.34 ng·g-1，至花后195 d，隨著種子的發(fā)育IAA 含量上升，達(dá)到37.62 ng·g-1，之后至花后210 d，隨著種子逐漸成熟，胚中IAA 含量有所下降，為33.16 ng·g-1，之后隨著種子發(fā)育成熟IAA 含量快速上升，至花后225 d，胚中IAA 含量達(dá)到59.26 ng·g-1，上升了26.11 ng·g-1。

圖2 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚的IAA、ZR、GA3、ABA 含量變化Fig.2 The change of IAA、ZR、GA3、ABA content in the embryo during seed development of O.fragrans‘Zigengziyin’

2.1.2 玉米素核苷（ZR）含量變化 胚中ZR 的含量在種子發(fā)育過(guò)程中呈先上升后下降再快速上升的趨勢(shì)（圖2B），變化趨勢(shì)同IAA?；ê?80 d胚中ZR 含量為3.17 ng·g-1，至花后195 d 達(dá)到4.56 ng·g-1，之后隨著種子發(fā)育的進(jìn)一步成熟，胚中ZR 含量有所下降，為3.75 ng·g-1（花后210 d），至花后225 d，胚中ZR 含量達(dá)到7.81 ng·g-1，上升了4.06 ng·g-1。

2.1.3 赤霉素（GA3）含量變化 胚中GA3的含量表現(xiàn)出先略有上升后逐漸下降并保持平穩(wěn)（圖2C）?；ê?80 d 胚中GA3含量為6.14 ng·g-1，至花后195 d，GA3含量略有上升（6.25 ng·g-1），之后隨著種子發(fā)育的進(jìn)一步成熟，胚中GA3含量有所下降，至花后210 d 為4.86 ng·g-1，花后225 d GA3含量基本保持平穩(wěn)為4.93 ng·g-1，比花后180 d 僅下降了1.21 ng·g-1，總體上看，GA3呈下降的趨勢(shì)。

2.1.4 脫落酸（ABA）含量變化 胚中ABA 的含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)（圖2D）?；ê?80 d 胚中ABA 含量為43.93 ng·g-1，至胚大量形成并進(jìn)入快速發(fā)育階段（花后195 d），其內(nèi)ABA 含量快速上升（上升了41.15 ng·g-1，達(dá)85.08 ng·g-1），之后ABA 含量持續(xù)上升，種子發(fā)育成熟（花后225 d），胚中ABA 含量達(dá)到111.73 ng·g-1，比花后180 d 上升了67.80 ng·g-1。

2.1.5 GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA 比值變化

隨著紫梗籽銀桂種子的不斷發(fā)育，胚中GA3/ABA的比值呈持續(xù)下降趨勢(shì)，由花后180 d 的0.14 至花后225 d 種子發(fā)育成熟下降至0.04，下降了0.10，下降幅度達(dá)71.43%；IAA/ABA、ZR/ABA的比值則呈現(xiàn)先下降、自花后210 d 開(kāi)始上升的趨勢(shì)，IAA/ABA 的比值在花后180 d 為0.71，至花后210 d 下降到0.36，比值下降了0.35，之后開(kāi)始上升，至花后225 d 種子發(fā)育成熟IAA/ABA 的比值上升至0.53，比花后210 d 上升了0.17；ZR/ABA 的比值由花后180 d 的0.07 至花后210 d 下降到0.04，比值下降了0.03，之后開(kāi)始上升，至花后225 d 種子發(fā)育成熟ZR/ABA 的比值上升至0.07，比花后210 d 上升了0.03。由此可以看出，隨著紫梗籽銀桂種子的發(fā)育成熟，胚中GA3/ABA 比值的變化幅度大于IAA/ABA、ZR/ABA的比值變化（圖3）。

2.2 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚乳的內(nèi)源激素含量變化

2.2.1 生長(zhǎng)素（IAA）含量變化 胚乳中IAA 的含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4A）。花后80 d，胚乳中IAA 含量為99.33 ng·g-1，至花后180 d，隨著胚陸續(xù)出現(xiàn)，種子發(fā)育趨于成熟，IAA 含量下降至40.49 ng·g-1，至花后195 d 略有上升，之后隨著種子發(fā)育成熟IAA 含量繼續(xù)下降，至花后225 d，胚乳中IAA 含量達(dá)到43.96 ng·g-1，比花后80 d 下降了55.37 ng·g-1，下降幅度達(dá)55.74%。

圖4 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚乳的IAA、ZR、GA3、ABA 含量變化Fig.4 The change of IAA、ZR、GA3、ABA content in the endosperm during seed development of O.fragrans ‘Zigengziyin’

2.2.2 玉米素核苷（ZR）含量變化 胚乳中ZR 的含量在種子發(fā)育過(guò)程中總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4B）。花后80 d，胚乳中ZR 含量為19.36 ng·g-1，至花后150 d， 隨著種子的發(fā)育ZR 含量下降至8.24 ng·g-1，花后165 d，胚乳中ZR 含量略有上升，花后195 d，隨著種子發(fā)育的逐漸成熟，胚大量出現(xiàn)，胚乳中ZR 含量有所下降，至花后225 d 種子發(fā)育成熟，胚乳中ZR 含量基本保持平穩(wěn)狀態(tài)為8.30 ng·g-1。

2.2.3 赤霉素（GA3）含量變化 胚乳中GA3的含量整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖4C）。花后80 d，胚乳中GA3含量為18.25 ng·g-1，之后隨著種子的發(fā)育GA3含量快速下降，花后120 d，胚乳中GA3含量下降至6.86 ng·g-1，至花后195 d，隨著種子的發(fā)育不斷成熟，胚乳中GA3含量一直保持比較平穩(wěn)的狀態(tài)，至花后225 d 種子發(fā)育成熟GA3含量為5.66 ng·g-1，基本保持平穩(wěn)，比花后80 d 下降了12.59 ng·g-1。

2.2.4 脫落酸（ABA）含量變化 胚乳中ABA 的含量總體呈先下降后上升的趨勢(shì)（圖4D）。花后80 d，胚乳中ABA 含量為88.83 ng·g-1，之后隨著種子的發(fā)育，至花后120 d，胚乳中ABA 含量下降至56.43 ng·g-1，隨著種子不斷發(fā)育成熟，胚乳中ABA 含量不斷上升，至花后150 d，胚開(kāi)始出現(xiàn)，胚乳中ABA 含量上升至83.77 ng·g-1，之后至花后225 d 種子發(fā)育成熟，胚乳中ABA 含量基本保持平穩(wěn)為88.02 ng·g-1。

2.2.5 GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA 比值變化

如圖5 所示，紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚乳的GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA3 個(gè)比值總體均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GA3/ABA 的比值呈持續(xù)下降趨勢(shì)，由花后80 d 的0.21 至花后225 d 種子發(fā)育成熟下降至0.06，下降了0.15，下降幅度達(dá)71.43%；IAA/ABA 的比值自花后80 d 至花后180 d 不斷下降，由花后80 d 的1.12 至花后180 d 下降至0.47，之后略有小幅波動(dòng)，至花后225 d 種子發(fā)育成熟時(shí)為0.50，整體下降了0.62，下降幅度達(dá)55.36%；ZR/ABA 由花后80 d 的0.22 至花后225 d 種子發(fā)育成熟時(shí)降至0.09，下降了0.13，下降幅度達(dá)59.09%，胚乳中GA3/ABA 比值的變化幅度大于IAA/ABA、ZR/ABA 的比值變化。

圖5 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚乳的GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA 比值變化Fig.5 The change of GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA in the endosperm during seed development of O.fragrans ‘Zigengziyin’

3 討論

生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CTK）和脫落酸（ABA）等植物激素在種子的發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程中起著重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用[21]。通常高水平的IAA 通過(guò)細(xì)胞伸長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)種子的膨大[22-24]，且在種子發(fā)育過(guò)程中IAA 在前期的作用強(qiáng)于發(fā)育后期[20,25-26]。CTK 能促進(jìn)細(xì)胞分裂與膨大、誘導(dǎo)芽的增殖、促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)、延緩植物衰老過(guò)程[27]，其中高等植物中存在的細(xì)胞分裂素大多是玉米素（Z）或其衍生物玉米素核苷（ZR）。玉米素核苷（ZR）在種子發(fā)育過(guò)程中對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用[28]，調(diào)節(jié)種子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，同時(shí)促進(jìn)同化物質(zhì)運(yùn)至果實(shí)以利于幼果的發(fā)育。赤霉素（GA）在種子發(fā)育過(guò)程中可通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)素的合成而促進(jìn)種子的生長(zhǎng)發(fā)育[29]。通常ABA 在植物種子成熟過(guò)程中含量明顯提高[20,30]，但有研究表明ABA 在植物胚發(fā)育過(guò)程中具有雙重性，在胚形成早期可促進(jìn)胚生長(zhǎng)[31]，而在胚胎發(fā)育晚期通過(guò)拮抗GA 來(lái)阻止胚繼續(xù)生長(zhǎng)，促進(jìn)種子休眠[32]，如擬南芥和水稻在種子發(fā)育中期和后期出現(xiàn)兩個(gè)峰值，第二個(gè)峰值只有第一個(gè)的1/3[33]。

本研究的結(jié)果表明：在紫梗籽銀桂種子發(fā)育的整個(gè)階段，胚中IAA 和ZR 含量均呈先上升、后下降和再上升的 “波浪型”變化，說(shuō)明IAA 和ZR 的含量與胚的發(fā)育沒(méi)有很強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這也從另一方面表明IAA 和ZR 可能和其它激素共同作用調(diào)節(jié)種子的發(fā)育進(jìn)程，這一結(jié)果與北細(xì)辛（Asarum heterotropoidesvar.mandshuricum）種子發(fā)育基本一致[34]。紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中，胚中GA3含量整體呈下降趨勢(shì)，ABA 含量不斷上升；胚乳中GA3含量呈下降趨勢(shì)，ABA 含量呈先下降后上升并保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明ABA 在前期有促進(jìn)種胚發(fā)育，而在后期促進(jìn)紫梗籽銀桂種子的休眠，這與陳在新[35]、閆曉娜[36]和劉歡[37]等人的研究結(jié)果基本一致，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了GA 與ABA 在調(diào)節(jié)種子發(fā)育過(guò)程中二者具有拮抗作用。

種子的發(fā)育過(guò)程不僅與各激素的含量有關(guān)，還與各類激素之間的比例平衡有關(guān)[38-39]。本研究結(jié)果表明，紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程胚中GA3/ABA 比值不斷下降，IAA/ABA、ZR/ABA 的比值先下降后上升，胚中GA3/ABA 比值的變化幅度大于IAA/ABA、ZR/ABA 的比值變化；胚乳中GA3/ABA、IAA/ABA、ZR/ABA3 個(gè)比值總體均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與激素變化的趨勢(shì)相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了種子發(fā)育進(jìn)程是受各激素含量變化及其比值共同調(diào)控的。

4 結(jié)論

紫梗籽銀桂種子發(fā)育過(guò)程中胚和胚乳的內(nèi)源激素含量及其比值呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化：其中GA3和ABA 含量的變化趨勢(shì)相反，IAA 和ZR 的含量與胚的發(fā)育沒(méi)有很強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系；GA3/ABA 比值呈下降趨勢(shì)，變化幅度大于IAA/ABA、ZR/ABA 的比值，GA3和ABA 的含量及其比值變化共同調(diào)控種子的發(fā)育進(jìn)程，進(jìn)一步說(shuō)明種子發(fā)育過(guò)程不僅與植物內(nèi)源激素的絕對(duì)含量有關(guān)，還與各類激素之間的平衡有關(guān)，尤其是促進(jìn)生長(zhǎng)與抑制生長(zhǎng)的激素之間的平衡可能在種子發(fā)育過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。