婁永峰，朱柯帆，宋曉琛，冷春暉，陳興彬，肖復(fù)明＊

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西省植物生物技術(shù)重點實驗室，江西 南昌 330032；2.信豐縣林木良種場，江西 信豐 341602)

林以種為本，種以質(zhì)為先。林木種質(zhì)資源是林業(yè)種業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，是林業(yè)生產(chǎn)力發(fā)展的基礎(chǔ)性資源和國家戰(zhàn)略性資源，隨著中國林業(yè)種業(yè)創(chuàng)新力度的不斷加大，愈發(fā)重視各類林木種質(zhì)資源的保護和利用[1]。然而數(shù)量龐大的種質(zhì)資源會影響種質(zhì)的保存、評價和利用，特別是多年生林木種質(zhì)，其樹體高大、個體占地面積廣、管理成本高，不便于種質(zhì)資源的有效管理和深入研究[2-4]。因此，F(xiàn)rankel 和Brown 等提出并逐步發(fā)展了核心種質(zhì)的概念，即運用一定的策略選取最小的種質(zhì)資源數(shù)量以最大程度地代表種質(zhì)資源的遺傳多樣性[5-6]。核心種質(zhì)的構(gòu)建主要基于表型性狀[7-8]或基于分子標(biāo)記[9-11]。對于樹體高大、多年生林木來說，以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記不易受林木生長期和環(huán)境的影響，較表型性狀更適合其核心種質(zhì)的構(gòu)建[3,12]。目前利用分子標(biāo)記的方法已在杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)[2]、核桃(Juglans sigillataDote)[3]、杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook)[4,13]、毛白楊(Populus tomentosaCarr.)[10]、美洲黑楊(P.deltoidesMarsh.)[14]、板栗(Castanea mollissimaBl.)[15]、 木 荷(Schima superbaGardn.et Champ.)[16]、紅錐(Castanopsis hystrixMiq.)[17]、刺槐(Robinia pseudoacaciaL.)[18]等林木上建立了核心種質(zhì)。

杉木是我國重要的鄉(xiāng)土針葉用材樹種，主要分布于我國長江流域、秦嶺以南地區(qū)。20 世紀(jì)70 年代起，江西省開始收集保存杉木優(yōu)樹種質(zhì)，建立來源豐富的種質(zhì)資源庫，進行遺傳改良工作[19]。持續(xù)的種質(zhì)資源收集為杉木種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良提供了豐富的材料，但日益劇增的種質(zhì)資源數(shù)量不利于種質(zhì)資源的保存、評價、創(chuàng)新研究及開發(fā)利用[4,19]。因此江西杉木核心種質(zhì)的構(gòu)建對充分利用現(xiàn)有江西杉木種質(zhì)資源具有重要意義。同時目前的杉木種質(zhì)資源收集、保存中由于缺乏統(tǒng)一、規(guī)范的編目工作等，導(dǎo)致存在本底不清，重復(fù)收集保存等問題[20]，故開展種質(zhì)鑒定、分子身份證構(gòu)建等工作對杉木種質(zhì)資源的收集、保存和利用十分重要。本研究通過SSR 標(biāo)記分析現(xiàn)有的江西杉木種質(zhì)資源遺傳多樣性，構(gòu)建核心種質(zhì)，并根據(jù)SSR 分子指紋圖譜、種質(zhì)資源信息等繪制核心種質(zhì)分子身份證，為今后江西杉木種質(zhì)資源的研究與利用提供理論依據(jù)和核心材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自江西省安福縣陳山林場和信豐縣林木良種場國家級杉木良種基地種質(zhì)資源庫，包括江西地方特色杉木優(yōu)良種源-安福陳山紅心杉優(yōu)樹種質(zhì)群體(安福群體，AF)、贛南地區(qū)杉木優(yōu)樹種質(zhì)群體(贛州群體，GZ)和江西本省其他地區(qū)杉木優(yōu)樹種質(zhì)群體(其他群體，QT)。其中安福陳山紅心杉種質(zhì)群體165 份，其主要來自羅霄山脈陳山林區(qū)；贛南地區(qū)杉木優(yōu)樹種質(zhì)群體224 份，其主要來自江西南部贛州全南、龍南、信豐等地；江西本省其他地區(qū)杉木優(yōu)樹種質(zhì)群體106 份，其主要來自江西銅鼓、吉安、上饒、景德鎮(zhèn)等地。參試495 份材料均為優(yōu)樹無性系材料。

2021 年4 月，采集健康且無病蟲害的新葉，冰袋保存帶回實驗室放置-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 提取與SSR 分析

采用改良CTAB 法提取杉木新葉DNA，在完成質(zhì)量及濃度檢測后，定量至約30.0 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基于文獻檢索及課題組前期的杉木SSR 引物開發(fā)，最終篩選了20 對SSR 引物用于后續(xù)分析[19]。SSR 引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，在每對引物的正向引物5′端進行M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′) 修飾，然后合成3′端具有熒光的M13 接頭(FAM、HEX)，通過序列互補進行標(biāo)記。SSR-PCR 體系(20.0 μL)：DNA 模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2 × Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。熒光引物擴增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性評價 運用PopGene 32 軟件開展遺傳多樣性分析，主要參數(shù)包括等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H) 和Shannon’s 信息指數(shù)(I) 等，利用PICCalc 軟件計算SSR 標(biāo)記的多態(tài)信息含量(PIC)。通過Ntsys 軟件采用UPGMA 進行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖。

1.3.2 核心種質(zhì)構(gòu)建及評價 利用Core finder 軟件[21]，以等位基因數(shù)最大化(M 策略) 為原則對SSR 數(shù)據(jù)進行分析，從供試江西杉木材料中抽取核心種質(zhì)。核心種質(zhì)構(gòu)建完成后，對構(gòu)建的核心種質(zhì)的相關(guān)遺傳參數(shù)進行t檢驗來評價核心種質(zhì)的代表性。同時通過主坐標(biāo)分析(PCoA)對構(gòu)建的核心種質(zhì)進行確認。

1.3.3 核心種質(zhì)分子身份證構(gòu)建 依據(jù)SSR 標(biāo)記PIC值的高低，依次增加標(biāo)記數(shù)量進行核心種質(zhì)的UPGMA 聚類分析，篩選能實現(xiàn)所有核心種質(zhì)有效區(qū)分所需的最少SSR 標(biāo)記組合，以這組SSR 標(biāo)記作為高效標(biāo)記組，用于后續(xù)核心種質(zhì)SSR 分子指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建。將高效SSR 標(biāo)記組在核心種質(zhì)中檢測到等位基因，按小到大的順序排序，然后用數(shù)字1～9 進行編碼，若等位基因數(shù)大于9 時，則用A～Z 編碼，缺失位點用0 表示，構(gòu)建每個核心種質(zhì)的SSR 分子指紋圖譜。將種質(zhì)信息和SSR 分子指紋圖譜相結(jié)合，分別利用條碼生成器和二維碼生成器構(gòu)建江西杉木核心種質(zhì)的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

利用SSR 標(biāo)記對江西杉木種質(zhì)進行分析以探究其遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)：20 個SSR 標(biāo)記在495 份江西杉木種質(zhì)中共檢測到等位基因數(shù)(Na)122 個，平均為6.1 個位點，其中CLSSR33標(biāo)記最少，僅有2 個，CLSSR9 標(biāo)記最多，達15 個。所選擇的20 個標(biāo)記中，獲得等位基因數(shù)(Na)在5 個以上的標(biāo)記有16 個，表明本研究選擇的SSR 標(biāo)記位點多態(tài)性較好，可用于江西杉木種質(zhì)的遺傳多樣性分析。此外，20 個標(biāo)記位點的有效等位基因數(shù)(Ne) 變化范圍在1.014～3.405 之間，平均值為1.836；Shannon’s 信息指數(shù)(I)變化范圍為0.045～1.428，平均值為0.762；Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H) 變化范圍在0.014～0.706 之間，平均值為0.400；觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He) 均值分別為0.394 和0.400，Ho＜He；位點多態(tài)性信息含量(PIC) 的變化范圍為0.014～0.657，平均值為0.357，其中低度多態(tài)性位點6 個(PIC≤0.25)；中度多態(tài)性位點11 個(0.25＜PIC＜0.5)；高度多態(tài)性位點3 個(PIC≥0.5)。以上結(jié)果表明495 份江西杉木種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富。

表1 江西杉木495 份種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)Table 1 The genetic diversity parameters of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

2.2 核心種質(zhì)構(gòu)建與評價

利用Core Finder 軟件，采用M 策略進行抽樣構(gòu)建核心種質(zhì)，結(jié)果表明當(dāng)抽取種質(zhì)數(shù)量為52 份時，等位基因保留比例接近100%。因此，基于SSR 基因型數(shù)據(jù)從495 份江西杉木種質(zhì)中抽取52 份核心種質(zhì)，抽樣比例為10.5%，其中安福陳山紅心杉種質(zhì)10 份，贛南地區(qū)種質(zhì)20 份，江西其他地區(qū)的種質(zhì)22 份。

通過遺傳多樣性參數(shù)分析對構(gòu)建的江西杉木52 份核心種質(zhì)的代表性進行評價，結(jié)果表明(表2)，與原種質(zhì)比較，核心種質(zhì)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He) 和多態(tài)信息含量(PIC) 的保留比例依次為100.0%、107.4%、115.1%、109.0%、104.1%、110.0% 和111.2%，且t檢驗顯示核心種質(zhì)與原種質(zhì)間各遺傳多樣性參數(shù)差異不顯著，說明構(gòu)建的核心種質(zhì)很好的保留了原種質(zhì)的遺傳多樣性，因此初步認為52 份核心種質(zhì)能夠代表495 份原種質(zhì)。PCoA 對核心種質(zhì)作進一步確認，結(jié)果顯示，江西杉木52 份核心種質(zhì)較為均勻地分布在495 份原種質(zhì)中(圖1)，說明構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較好的代表性。

圖1 江西杉木核心種質(zhì)PCoA 分析Fig.1 The principal coordinates analysis of core collection of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

基于聚類分析52 份核心種質(zhì)可分為6 大類。其中，核心種質(zhì)QT065、QT099 和GZ012 均單獨形成一類；核心種質(zhì)GZ051 和GZ209 則形成一類，QT059 和QT063 組成一類；其余45 份核心種質(zhì)則形成一大類。

2.3 核心種質(zhì)分子身份證構(gòu)建

由于杉木為二倍體，每個SSR 位點應(yīng)由2 個相同或不同的等位基因組成。SSR 標(biāo)記的等位基因數(shù)、基因型越多，PIC值越高，能區(qū)分種質(zhì)的能力也越強，在繪制指紋圖譜中價值也越高?；谧钌贅?biāo)記區(qū)分最多種質(zhì)的原則，依據(jù)SSR 標(biāo)記的PIC值的高低，依次增加標(biāo)記數(shù)量對核心種質(zhì)進行區(qū)分，結(jié)合UPGMA 聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H97 標(biāo)記與H286、CLSSR9 和CLSSR37 相結(jié)合，就可將52 份江西杉木核心種質(zhì)完全鑒別區(qū)分(圖2)。

圖2 基于UPGMA 聚類的江西杉木核心種質(zhì)鑒別分析Fig.2 The identification of core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi by UPGMA

通過H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 這4 個高效SSR 標(biāo)記在52 份核心種質(zhì)中檢測到的等位基因，構(gòu)建每份核心種質(zhì)的SSR 分子指紋圖譜(圖3)。將獲得SSR 分子指紋圖譜數(shù)據(jù)與種質(zhì)信息編碼一同構(gòu)建核心種質(zhì)特異的分子身份證碼。參考王華緘等[20]，種質(zhì)信息編碼共有6 位數(shù)字組成，分為3 個部分，第1～3 位表示種質(zhì)原產(chǎn)地信息，如001 為江西省安?？h；第4 位是種質(zhì)資源類別，1 表示一代優(yōu)樹，2 表示二代優(yōu)樹、3 表示三代優(yōu)樹等；第5～6 位表示收集、保存時間，如79 表示1979 年。若上述信息未知或不清楚則用X 表示。以AF047 為例（圖4），其分子身份證號碼為00110668444B34，表示該種質(zhì)原產(chǎn)地江西省安?？h，收集、保存的為1 代優(yōu)樹，時間為2006年，4 個核心標(biāo)記（H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37）的指紋圖譜依次為68/44/4B/34。最后利用每份種質(zhì)的14 位分子身份證編號，分別制作條形碼和二維碼（圖4）。

圖3 江西杉木核心種質(zhì)的SSR 分子指紋圖譜Fig.3 The DNA fingerprint of the core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

圖4 部分江西杉木核心種質(zhì)的DNA 分子身份證Fig.4 The DNA molecular IDs of some core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

3 討論

進行遺傳多樣性評價是開展種質(zhì)資源評價工作的重要組成部分。開展杉木種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究對收集、保存、評價和利用杉木種質(zhì)材料的意義重大。江西是我國杉木的主要的分布和中心產(chǎn)區(qū)之一，栽培歷史悠久，在長期的自然選擇和人工選擇作用下形成一些頗具特色的優(yōu)良種質(zhì)資源，如安?！瓣惿郊t心杉”、武寧“瓜源木”、遂川“龍泉木”、全南“黃田江杉木”等[22]，使得江西擁有豐富的杉木種質(zhì)資源。本研究采用20 個SSR 標(biāo)記在495 份江西杉木種質(zhì)中共檢測到122 個等位基因(Na)，平均Shannon’s 信息指數(shù)(I)、平均Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)、平均觀測雜合度(Ho)和平均期望雜合度(He)分別為0.762、0.400、0.394 和0.400，與其他采用相同技術(shù)進行的杉木相關(guān)研究結(jié)果比較[4,13,23-24]，江西杉木種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。

在林木育種中，核心種質(zhì)在親本選擇、雜交育種、種質(zhì)保存和利用等方面發(fā)揮著重要作用。核心種質(zhì)是通過從整個種質(zhì)資源中選擇出少量且具有代表性的種質(zhì)材料，可以最大程度的代表原種質(zhì)的遺傳多樣性水平。因此，在構(gòu)建核心種質(zhì)中應(yīng)優(yōu)先考慮選擇稀有位點，最大限度保留原種質(zhì)的等位基因多樣性[4,25]。M 策略基于等位基因的最大化，同時兼顧遺傳多樣性，是目前最具優(yōu)勢的一種方法。通過Core Finder 軟件以M 策略構(gòu)建核心種質(zhì)已在杜仲、杉木、木荷等林木上成功應(yīng)用[2,4,16]。因此，本研究選擇基于M 策略利用Core Finder 軟件構(gòu)建江西杉木種質(zhì)資源的核心種質(zhì)，結(jié)果從495 份江西杉木原種質(zhì)中得到52 份核心種質(zhì)，同時通過t檢驗和PCoA 分析，顯示獲得的核心種質(zhì)具有更豐富的遺傳多樣性，且均勻分布于原種質(zhì)資源中，表明構(gòu)建的核心種質(zhì)可靠有效，具有代表性。

核心種質(zhì)構(gòu)建的宗旨是以最小的資源數(shù)量和遺傳重復(fù)包含原種質(zhì)中最大的遺傳多樣性。因此，確定合理取樣比例是關(guān)鍵[9]。目前研究表明林木種質(zhì)資源的核心種質(zhì)取樣比例一般在10%～30%之間。方樂成等[26]分析了192 份楸樹(Catalpa bungeiC.)種質(zhì)的遺傳多樣性，獲得了46 份核心種質(zhì)，抽樣比例23.96%；劉松等[15]利用SSR 標(biāo)記建立了占原種質(zhì)24.85%的中國板栗核心種質(zhì)；楊漢波等[16]基于SSR 標(biāo)記從754 份木荷種質(zhì)資源中獲得了115 份核心種質(zhì)，占原種質(zhì)的15.3%；李洪果等[2]則從887 份杜仲種質(zhì)中得到189 份核心種質(zhì)和698 份保留種質(zhì)，核心種質(zhì)占原種質(zhì)的21.3%。在本研究中，根據(jù)SSR 標(biāo)記分析結(jié)果，基于M 策略從495 份原種質(zhì)中抽取了52 份核心種質(zhì)，經(jīng)過遺傳多樣性評價和顯著性t檢驗，確定江西杉木核心種質(zhì)合適的取樣比例為10.5%。這個比例與已報道的同樣基于SSR 標(biāo)記獲得的廣西杉木核心種質(zhì)占比9.3%接近[4]；低于Duan 等[13]從南方6 個省份700 份杉木基礎(chǔ)群體中構(gòu)建300 份核心種質(zhì)的比例，也低于在SNP 標(biāo)記基礎(chǔ)上獲得杉木核心育種群體占比(64.7%)以及速生優(yōu)質(zhì)杉木核心種質(zhì)占比(50%)[27-28]。本研究的杉木種質(zhì)均來源江西省，李魁鵬等[4]杉木種質(zhì)則主要來源廣西境內(nèi)，兩者的遺傳結(jié)構(gòu)較Duan 等[13]700 份杉木材料來源南方6 省市相對簡單。這符合核心種質(zhì)的取樣比例應(yīng)根據(jù)原種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和數(shù)量規(guī)模來決定[29]。江西杉木52 份核心種質(zhì)中安福陳山紅心杉種質(zhì)10 份(6.1%)、贛南地區(qū)種質(zhì)20 份(8.9%)、江西其他地區(qū)的種質(zhì)22 份(20.8%)，安福陳山紅心杉種質(zhì)資源較多，但抽取的核心種質(zhì)反而較少，這可能與陳山紅心杉種質(zhì)資源遺傳多樣性水平偏低有關(guān)[19]。

本研究中，52 份核心種質(zhì)的等位基因數(shù)(Na)的保留比例為100%，而有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC) 6 個參數(shù)的保留比例大于100%，這主要是由群體中的樣本量和等位基因頻率改變引起。這些遺傳參數(shù)都是根據(jù)等位基因頻率按不同的方法估算獲得，用于度量不同群體在多樣性上的遺傳冗余情況，而核心種質(zhì)的構(gòu)建是一個減少頻率高等位基因、增加稀有等位基因比例的過程，在去除遺傳冗余的過程中，各等位基因頻率的不規(guī)律增減會導(dǎo)致相應(yīng)遺傳多樣性參數(shù)保留比例大于100%，這一現(xiàn)象在杜仲[2]、毛白楊[10]、木荷[16]和新疆野杏(Armeniaca vulgarisLam.)[25]等的核心種質(zhì)構(gòu)建中均存在。

隨著DNA 分子指紋圖譜的快速發(fā)展，SSR 等分子標(biāo)記的檢測結(jié)果可進一步轉(zhuǎn)化為字符串、條形碼或二維碼，即DNA 分子身份證[30]。種質(zhì)鑒定是種質(zhì)資源收集、評價、保存和利用的基石，DNA分子身份證是種質(zhì)鑒定的重要工具，目前已被廣泛應(yīng)用在作物、菌類、果樹、花卉等種質(zhì)鑒定[30-32]，近年來，這一技術(shù)也逐步應(yīng)用于林木種質(zhì)資源的鑒定[33]。胡春龍等[34]構(gòu)建了46 份白蠟(Fraxinussp.)種質(zhì)資源的分子身份證，為白蠟新品種的審定、DUS測試等奠定了理論基礎(chǔ)。張成才等[35]對36 個薄殼山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch)國外引種品種建立分子身份證，為區(qū)分和鑒別薄殼山核桃品種提供參考。本研究在運用SSR 標(biāo)記分析江西杉木遺傳多樣性的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了其核心種質(zhì)的DNA 指紋圖譜，繪制了相應(yīng)的分子身份證。不同于已報道的杉木分子身份證，本研究構(gòu)建的分子身份證不僅包含了杉木種質(zhì)的DNA 指紋圖譜信息，同時借鑒作物、果樹等種質(zhì)的分子身份證構(gòu)建方法，設(shè)定了包含種質(zhì)原產(chǎn)地、種質(zhì)資源類別、收集保存時間的補充碼，進一步增加所繪制的種質(zhì)分子身份證的可靠性和特異性。

4 結(jié)論

本研究利用前期篩選的20 個杉木SSR 標(biāo)記，分析了495 份江西杉木種質(zhì)的遺傳多樣性，并利用M 策略構(gòu)建了含有52 份材料的江西杉木核心種質(zhì)，核心種質(zhì)保留了原種質(zhì)10.5%，等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)的保留比例依次為100.0%、107.4%、115.1%、109.0%，表明本研究建立的核心種質(zhì)是有效的。同時根據(jù)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC) 和鑒別能力，確定了H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 等4 個標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)52 份核心種質(zhì)的有效區(qū)分，并構(gòu)建了52 份核心種質(zhì)的分子指紋圖譜和分子身份證，為杉木種質(zhì)資源的收集、保存和利用提供了理論基礎(chǔ)。