李俊杰 白文婭 陳文棟 楊偉 邵建林

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科（昆明 650032）

腦缺血-再灌注損傷（cerebral ischemia reperfu?sion injury，CI-RI）是發(fā)生于缺血性腦卒中后由于血流再灌注所致的一種繼發(fā)性腦損傷。CI-RI 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種病理機(jī)制，如炎癥反應(yīng)、氧化損傷、胞內(nèi)鈣離子超載、線粒體功能障礙和神經(jīng)元凋亡等［1-3］。其中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡已被證實(shí)是再灌注早期加重缺血部位腦組織損傷的主要因素之一［4］。MicroRNAs（miRNAs）是一類能特異性地與mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，參與調(diào)控CI-RI所致的氧化損傷、血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程［5］。前期研究的測(cè)序及驗(yàn)證結(jié)果［6］發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p在缺血-再灌注損傷的大鼠腦組織中表達(dá)下調(diào)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Rho家族GTP酶3（Rnd3）可能為其下游的靶基因，且Rnd3在缺血腦組織中表達(dá)上調(diào)。然而，miR-27a-3p 能否通過(guò)調(diào)控Rnd3 參與CI-RI 的病理過(guò)程目前尚未有研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-27a-3p 能否通過(guò)靶向調(diào)控Rnd3 的表達(dá)參與大鼠PC12神經(jīng)細(xì)胞的OGD/R損傷過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 PC12 神經(jīng)細(xì)胞株和293 T細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；miR-27a-3p、Rnd3、U6 和GAPDH 引物購(gòu)自北京擎科生物公司；miRNA 和mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia 生物公司；慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技公司；miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor 及其相應(yīng)陰性對(duì)照的載體質(zhì)粒、Rnd3 干擾片段和熒光素酶相關(guān)質(zhì)粒均購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Cleaved-Caspase-3（C-caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；Bax 和β-Actin 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Bcl-2 抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex 公司；HRP 標(biāo)記的第二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；ECL顯影液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及OGD/R 模型制備 PC12 細(xì)胞復(fù)蘇后以104個(gè)/孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在添加有10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每2 d 換1 次液，培養(yǎng)箱環(huán)境為95%空氣+ 5% CO2，溫度為37 ℃。培養(yǎng)7 d 后，PC12 細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將293 T 細(xì)胞接種于添加10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。根據(jù)先前報(bào)道的方法［7］，將PC12 細(xì)胞接種于無(wú)糖培養(yǎng)基中，在37 ℃低氧（1%O2+ 94% N2+ 5% CO2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，之后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，于37 ℃兩氣培養(yǎng)箱（95%空氣+5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)后制備OGD/R模型。

1.2.2 最適復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)的篩選 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，接種于96 孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control，正常培養(yǎng)）、氧糖剝奪2 h 分別復(fù)氧3、6、9 和12 h 的OGD/R 模型組，每組3 復(fù)孔，分別檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力，胞內(nèi)miR-27a-3p 和Rnd3 mRNA 的表達(dá)，選擇合適的復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 將PC12 細(xì)胞按104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)，將包裝有miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor及其相應(yīng)陰性對(duì)照（miR-27a-3p Mimic-NC 和miR-27a-3p Inhibitor-NC）、Rnd3干擾片段（shRnd3）及其陰性對(duì)照（shRnd3-NC）的載體慢病毒對(duì)PC12 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h 后制備OGD/R 模型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，每組3 復(fù)孔，分為Control 組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞）、OGD/R 組（制備OGD/R 模型）、Mimic-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Mimic-NC 后制備OGD/R 模型）、Mimic 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Mimic 后制備OGD/R 模型）、Inhibitor-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Inhibitor-NC 后制備OGD/R模型）、Inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-27a-3p Inhibitor后制備OGD/R 模型）、shRnd3-NC 組（轉(zhuǎn)染shRnd3-NC 后制備OGD/R 模型）、shRnd3 組（轉(zhuǎn)染shRnd3 后制備OGD/R 模型）和shRnd3+Inhibitor 組（共轉(zhuǎn)染shRnd3和miR-27a-3p Inhibitor 后制備OGD/R 模型）。

1.2.4 CCK?8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 在各組每孔細(xì)胞中加入10 μL 的 CCK-8 溶液，37 ℃孵育1 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 的吸光度。細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔OD450值-空白細(xì)胞孔OD450值）/（正常細(xì)胞孔OD450值-空白細(xì)胞孔OD450值）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin VFITC/PI 試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。收獲104個(gè)細(xì)胞后，每孔分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL 的PI 試劑溶液后進(jìn)行避光反應(yīng)，持續(xù)15 min入400 μL 1×的PBS 緩沖液后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR?27a?3p和Rnd3 的靶向關(guān)系 利用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-27a-3p 與Rnd3 的結(jié)合區(qū)域和位點(diǎn)。分別構(gòu)建Rnd3 3'-UTR 野生型（Rnd3/Wt）和突變型（Rnd3/Mut）的質(zhì)粒，并將其分別與miR-27a-3p Mimic-NC（NC）和miR-27a-3p Mimic（Mimic）利用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染入293 T 細(xì)胞，利用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)于48 h 后對(duì)海腎熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定。以螢火蟲(chóng)熒光素酶為對(duì)照，計(jì)算熒光素酶的相對(duì)酶活性。

1.2.7 RT?qPCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR?27a?3p 和Rnd3 mRNA 的表達(dá) TRIzol 法提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，利用試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。miR-27a-3p 上游引物：5′-TTCA?CAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；Rnd3上游引物：5′-GCAAGATAGTAGTGGTGGGCG-3′，下游引物：5′-TCTGGGTAAGAGAGGGGACGG-3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-27a-3p 和Rnd3 分別相對(duì)于各自內(nèi)參基因的表達(dá)量。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rnd3 和凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá) 利用RIPA 裂解液裂解和提取各組細(xì)胞中的總蛋白后測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)膜和封閉處理后分別加入Rnd3（1∶100）、Cleaved-caspase-3（1∶500）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶100）和β-actin（1∶500）的第一抗體4 °C 孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后加入HRP 標(biāo)記的第二抗體37 °C 孵育1 h，ECL 顯影后采集圖像分析灰度值和計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析并進(jìn)行Tukey 事后檢驗(yàn)，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)氧不同時(shí)刻細(xì)胞的活力和胞內(nèi)miR?27a?3p、Rnd3 mRNA 的表達(dá) 與Control 組比較，復(fù)氧后6、9 和12 h 時(shí)細(xì)胞的活力、miR-27a-3p 的表達(dá)水平均明顯降低（P< 0.05），12 h 最低；Rnd3 mRNA表達(dá)水平在3、6 和12 h 時(shí)均明顯升高（P< 0.05），12 h 時(shí)表達(dá)最高，在9 h 時(shí)表達(dá)無(wú)明顯變化；因此，選擇復(fù)氧12 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 復(fù)氧不同時(shí)刻細(xì)胞的活力和胞內(nèi)miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表達(dá)Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

表1 復(fù)氧不同時(shí)刻細(xì)胞的活力和胞內(nèi)miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表達(dá)Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

注：與Control組比較，*P < 0.05

組別Control組復(fù)氧3 h組復(fù)氧6 h組復(fù)氧9 h組復(fù)氧12 h組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.10 2.56 ± 0.14*2.59 ± 0.08*1.36 ± 0.04 5.85 ± 0.14*323.10< 0.001細(xì)胞的活力（%）100.00 ± 2.27 90.46 ± 3.83 66.30 ± 2.61*76.80 ± 3.18*62.66 ± 2.82*28.08< 0.001 miR-27a-3p 1.01 ± 0.08 0.45 ± 0.01*0.31 ± 0.02*0.49 ± 0.02*0.08 ± 0.01*79.10< 0.001

2.2 上調(diào)miR?27a?3p 和下調(diào)miR?27a?3p 對(duì)OGD/R 損傷細(xì)胞的活力、胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率的影響 與Control 組比較，OGD/R組PC12 細(xì)胞內(nèi)miR-27a-3p 的表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達(dá)升高、Bcl-2蛋白表達(dá)降低、細(xì)胞的總凋亡率增加（P< 0.05）；與Mimic-NC 組比較，Mimic 組細(xì)胞內(nèi)miR-27a-3p的表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax的蛋白表達(dá)降低、Bcl-2 蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞的總凋亡率降低（P< 0.05）；與Inhibitor-NC 組比較，Inhibitor 組細(xì)胞內(nèi)miR-27a-3p 的表達(dá)下調(diào)、Ccaspase-3 和Bax 的蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞的總凋亡率增加（P< 0.05），細(xì)胞的活力和Bcl-2 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P> 0.05），見(jiàn)表2 和圖1、2。

圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達(dá)的Western blot 圖Fig.1 Western blot of apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

圖2 各組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖Fig.2 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表2 各組細(xì)胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

表2 各組細(xì)胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與Mimic-NC組比較，△P < 0.05；與Inhibitor-NC組比較，▲P < 0.05

組別Control組OGD/R組Mimic-NC組Mimic組Inhibitor-NC組Inhibitor組F值P值細(xì)胞總凋亡率（%）3.55 ± 0.14 11.25 ± 0.09*12.44 ± 0.76 5.28 ± 0.43△11.93 ± 0.55 15.67 ± 0.50▲95.94< 0.001 miR-27a-3p 1.02 ± 0.14 0.27 ± 0.00*0.23 ± 0.01 0.70 ± 0.06△0.23 ± 0.01 0.15 ± 0.01▲30.47< 0.001細(xì)胞的活力（%）100.00 ± 1.21 59.01 ± 1.71*60.95 ± 3.08 74.84 ± 2.25△59.95 ± 2.29 53.58 ± 3.04 52.92< 0.001 C-caspase-3 0.42 ± 0.02 1.00 ± 0.04*0.79 ± 0.07 0.49 ± 0.06△0.82 ± 0.05 1.17 ± 0.08▲24.28< 0.001 Bax 0.28 ± 0.04 0.78 ± 0.07*0.89 ± 0.03 0.40 ± 0.06△0.77 ± 0.05 1.14 ± 0.07▲33.10< 0.001 Bcl-2 0.96 ± 0.01 0.41 ± 0.03*0.42 ± 0.02 0.69 ± 0.07△0.37 ± 0.02 0.30 ± 0.08 29.78< 0.001

2.3 miR?27a?3p靶向調(diào)控Rnd3的表達(dá) 與Control組比較，OGD/R 組PC12 細(xì)胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均上調(diào)（P< 0.05）；與Mimic-NC 組比較，Mimic 組細(xì)胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均下調(diào)（P< 0.05）；與Inhibitor-NC 組比較，Inhibitor 組細(xì)胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均上調(diào)（P< 0.05），見(jiàn)表3 和圖3。TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-27a-3p與Rnd3存在緊密結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，與Rnd3/Wt和Mimic-NC共轉(zhuǎn)染組比較，Rnd3/Wt 和Mimic 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性降低（P< 0.01）；與Rnd3/Mut 和Mimic-NC共轉(zhuǎn)染組比較，Rnd3/Mut和Mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），證實(shí)miR-27a-3p 能靶向調(diào)控Rnd3 的表達(dá)，見(jiàn)表4。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)Rnd3 蛋白表達(dá)的Western blot 圖Fig.3 Western blot of Rnd3 protein in each group

圖4 TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-27a-3p 與Rnd3 之間的結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Binding sites between miR-27a-3p and Rnd3 predicted by TargetScan database

表3 上調(diào)miR-27a-3p 和下調(diào)miR-27a-3p 對(duì)Rnd3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

表3 上調(diào)miR-27a-3p 和下調(diào)miR-27a-3p 對(duì)Rnd3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與Mimic-NC組比較，△P < 0.05；與Inhibitor-NC組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.14 ± 0.01 0.64 ± 0.05*0.64 ± 0.05 0.45 ± 0.04△0.56 ± 0.05 1.05 ± 0.08▲34.14< 0.001組別Control組OGD/R組Mimic-NC組Mimic組Inhibitor-NC組Inhibitor組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.08 3.12 ± 0.11*3.72 ± 0.44 1.71 ± 0.14△3.32 ± 0.12 5.81 ± 0.14▲63.35< 0.001

表4 miR-27a-3p 與Rnd3 結(jié)合的各組細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

表4 miR-27a-3p 與Rnd3 結(jié)合的各組細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

注：與Rnd3/Wt+Mimic-NC組比較，*P < 0.05

組別Rnd3/Wt+Mimic-NC組Rnd3/Wt+Mimic組Rnd3/Mut+Mimic-NC組Rnd3/Mut+Mimic組F值P值熒光素酶相對(duì)活性1.00 ± 0.02 0.73 ± 0.06*1.01 ± 0.04 1.00 ± 0.05 9.303< 0.001

2.4 Rnd3 干擾片段的篩選結(jié)果 與shRnd3-NC組比較，shRnd3-002、shRnd3-003 和shRnd3-004 組細(xì)胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低（P< 0.05）；與shRnd3-003 和shRnd3-004 組比較，shRnd3-002 組細(xì)胞內(nèi)Rnd3 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低（P< 0.05），因此選擇shRnd3-002 干擾片段進(jìn)行后續(xù)下調(diào)Rnd3 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表5和圖5。

圖5 各Rnd3 干擾片段作用下Rnd3 蛋白表達(dá)的Western blot 圖Fig.5 Western blot of Rnd3 protein expression with the various Rnd3 interference fragments

表5 各Rnd3 干擾片段對(duì)Rnd3 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

表5 各Rnd3 干擾片段對(duì)Rnd3 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

注：與shRnd3-NC組比較，*P < 0.05；與shRnd3-003組比較，△P <0.05；與shRnd3-004組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.87 ± 0.12 0.97 ± 0.12 1.08 ± 0.19 0.38 ± 0.03*△▲0.66 ± 0.03*0.63 ± 0.08*5.63< 0.001組別Control組shRnd3-NC組shRnd3-001組shRnd3-002組shRnd3-003組shRnd3-004組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.11 1.03 ± 0.04 1.28 ± 0.04 0.07 ± 0.02*△▲0.63 ± 0.03*0.47 ± 0.09*47.65< 0.001

2.5 下調(diào)Rnd3 對(duì)OGD/R 損傷PC12 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響以及下調(diào)miR?27a?3p 的逆轉(zhuǎn)作用 與Control 組比較，OGD/R 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均升高、細(xì)胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達(dá)升高、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低、細(xì)胞總凋亡率增加（P< 0.05）；與shRnd3-NC 組相比，shRnd3 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均降低、細(xì)胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表達(dá)降低、Bcl-2蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞總凋亡率降低（P< 0.05）；與shRnd3 比較，shRnd3+Inhibitor 組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)均升高、細(xì)胞的活力降低、C-caspase-3和Bax 的蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞總凋亡率增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。下調(diào)miR-27a-3p 逆轉(zhuǎn)了下調(diào)Rnd3 的作用，進(jìn)一步證明miR-27a-3p 靶向調(diào)控 Rnd3 的表達(dá)，見(jiàn)表6、7和圖6、7。

圖6 各組Rnd3 蛋白和凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表達(dá)的Western blot 圖Fig.6 Western blot of Rnd3 protein and apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

圖7 各組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖Fig.7 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表6 各組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

表6 各組Rnd3 mRNA 和蛋白的表達(dá)量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與shRnd3-NC組比較，△P < 0.05；與shRnd3組比較，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.11 ± 0.02 0.71 ± 0.05*0.69 ± 0.02 0.22 ± 0.03△0.52 ± 0.07▲41.17< 0.001組別Control組OGD/R組shRnd3-NC組shRnd3組shRnd3+Inhibitor組F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.05 1.52 ± 0.06*1.02 ± 0.06 0.12 ± 0.00△1.02 ± 0.02▲127.40< 0.001

表7 各組細(xì)胞的活力、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

表7 各組細(xì)胞的活力、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

注：與Control組比較，*P < 0.05；與shRnd3-NC組比較，△P < 0.05；與shRnd3組比較，▲P < 0.05

組別Control組OGD/R組shRnd3-NC組shRnd3組shRnd3+Inhibitor組F值P值細(xì)胞總凋亡率（%）3.38 ± 0.16 11.59 ± 0.69*12.10 ± 0.73 4.09 ± 0.35△8.96 ± 0.85▲44.81< 0.001細(xì)胞的活力（%）100.00 ± 3.08 62.86 ± 2.05*64.77 ± 3.53 88.12 ± 2.74△68.16 ± 2.13▲35.34< 0.001 C-caspase-3 0.07 ± 0.00 0.64 ± 0.04*0.49 ± 0.03 0.17 ± 0.01△0.62 ± 0.04▲81.70< 0.001 Bax 0.14 ± 0.01 0.92 ± 0.04*0.74 ± 0.03 0.27 ± 0.01△0.98 ± 0.04▲150.8< 0.001 Bcl-2 0.68 ± 0.02 0.36 ± 0.01*0.18 ± 0.01 0.49 ± 0.02△0.46 ± 0.02 124.5< 0.001

3 討論

CI-RI 常常給患者的神經(jīng)功能帶來(lái)不可逆的損害，然而，目前治療方法有限。MicroRNAs 能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如缺血性卒中［8］、膠質(zhì)瘤［9］、阿爾茨海默?。?0］等。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是CI-RI 后的常見(jiàn)病理事件，與后期的神經(jīng)功能缺損密切相關(guān)。CI-RI 早期促凋亡蛋白如Cleaved Caspase-3、Bax 等的大量表達(dá)都會(huì)加重細(xì)胞的凋亡［11］。

本研究在CI-RI 的體外模型中觀察到PC12 神經(jīng)細(xì)胞在OGD/R 后細(xì)胞活力下降，細(xì)胞的凋亡增加。同時(shí)，OGD/R 后胞內(nèi)的miR-27a-3p 表達(dá)下調(diào)，由此推測(cè)miR-27a-3p 可能參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。miR-27a-3p 是一種具有多種調(diào)控功能的miRNA，已有研究［12］表明，miR-27a-3p 參與了多種疾病的細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程。在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中，miR-27a-3p 的上調(diào)通過(guò)抑制自噬介導(dǎo)了七氟烷的抗凋亡作用。此外，miR-27a-3p 的上調(diào)通過(guò)靶向抑制LITAF 和TLR4 通路，減輕腦缺血-再灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［13］。另有研究［14］表明，miR-27a-3p 的上調(diào)可減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并通過(guò)靶向調(diào)控OXSR1 表達(dá)抑制腎小管上皮HK-2 細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-27a-3p 提高了OGD/R 損傷后的細(xì)胞活力和抑制了細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)miR-27a-3p 則作用相反，表明在OGD/R 損傷模型中，miR-27a-3p 能抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)作用。

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Rnd3 的3'-UTR 區(qū)具有miR-27a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-27a-3p 能夠靶向作用于Rnd3，此外，上調(diào)miR-27a-3p 能使其表達(dá)下調(diào)，下調(diào)miR-27a-3p 則使其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證明了miR-27a-3p 能夠靶向調(diào)控Rnd3 的表達(dá)。Rnd3 也被稱為RhoE，是一種小GTP 結(jié)合蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可大量表達(dá)［15］。已有研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，Rnd3 的上調(diào)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，而Rnd3 基因的缺失則抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。此外，研究［18］證實(shí)Rnd3 可通過(guò)激活I(lǐng)RAK/ERK/NF-KB 信號(hào)通路，加重乙醇誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，OGD/R 損傷后細(xì)胞凋亡加劇，而胞內(nèi)Rnd3 的表達(dá)明顯升高。因此，在OGD/R 損傷的PC12 細(xì)胞中，miR-27a-3p 的抗凋亡作用可能與其對(duì)Rnd3 的抑制作用有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實(shí)Rnd3 的作用及其是否參與了miR-27a-3p 的抗凋亡機(jī)制，筆者構(gòu)建了特異性的shRNA 下調(diào)PC12 細(xì)胞中Rnd3 的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRnd3 后，胞內(nèi)Rnd3 的表達(dá)降低，同時(shí)，細(xì)胞的活力提高、細(xì)胞凋亡下降，表明下調(diào)Rnd3具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。然而，下調(diào)miR-27a-3p 則消除了miR-27a-3p 對(duì)Rnd3 的抑制效應(yīng)，在轉(zhuǎn)染shRnd3 的情況下使Rnd3 的表達(dá)上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了shRnd3 產(chǎn)生的抗凋亡作用，導(dǎo)致shRnd3 不能進(jìn)一步減輕OGD/R 引發(fā)的細(xì)胞損傷，由此表明，miR-27a-3p 通過(guò)抑制Rnd3 的表達(dá)減輕了細(xì)胞凋亡。

綜上所述，上調(diào)miR-27a-3p 對(duì)OGD/R 損傷的PC12 神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制是通過(guò)靶向抑制Rnd3 的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本研究將為CI-RI 損傷治療靶點(diǎn)的選擇提供理論參考，但也存在一定的局限性，僅僅進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)，下一步有待進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明miR-27a-3p 調(diào)控Rnd3 對(duì)CI-RI的影響。

【Author contributions】LI Junjie performed the experiments and wrote the article.BAI Wenya performed the experiments.CHEN Wen?dong and YANG Wei revised the article.SHAO Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.