肖雪 梁妤婷 古銳 李莉 陳娟 鐘家禹

1 廣州天愛兒科?？崎T診部，廣州 510630；2 佛山南海天愛普通?？崎T診部，佛山528299；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510120

手足口病（hand， foot and mouth disease，HFMD）是腸道病毒（enterovirus，EV）引起的常見小兒急性傳染病之一，多發(fā)生于5 歲以下的嬰幼兒，臨床癥狀以手掌、腳掌、口腔黏膜上發(fā)生水皰、發(fā)燒、嘔吐為特征的一種病毒性皮膚?。?］。2008 年暴發(fā)時HFMD 病原主要以腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）、柯薩奇病毒 A 組 16 型（Coxsaekievirus group A 16，CA16）為主要病原［2］，隨后在2013 年前后HFMD 的病原譜逐漸發(fā)生改變，非EV71 非CA16 腸道病毒成為HFMD 的主要病原體［3-5］，其中以CA6 為HFMD 的主要流行病原體［6-7］。HFMD 從2008 年暴發(fā)以來，10多年來持續(xù)流行，也說明了HFMD的病原譜是在不斷變化，需要長期監(jiān)測與跟蹤。

2020 年，新冠病毒突然暴發(fā)，改變了人們的生活方式，戴口罩，減少了傳染病的流行。為了解新冠疫情期間及疫情后廣佛地區(qū)的HFMD 病原感染情況，我們選取了新冠疫情期間及疫情后的兩年進(jìn)行對比，以分析廣佛地區(qū)EV 的感染情況。

資料與方法

1.一般資料

2022 年1 月至2023 年8 月，采集到廣州天愛兒科?？崎T診部和佛山南海天愛普通?？崎T診部就診的疑似HFMD患者標(biāo)本共659 份，其中2022 年362 份，2023 年1—8 月297份；標(biāo)本大部份是咽拭子和肛拭子，小部份是皰疹液等。

2.方法

2.1.病原學(xué)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測 2022 年1 月至2023 年8 月門診收集659 份標(biāo)本都外送到廣州金域檢測公司同時進(jìn)行EV 通用型、EV71、CA16 熒光PCR 檢測；檢測試劑是金域公司的EV71、CA16 和EV 通用型三重?zé)晒釶CR 試劑盒，結(jié)果按說明書進(jìn)行判斷。

2.2.EV 型別5'非編碼區(qū)（UTR）的引物設(shè)計與擴(kuò)增 在對熒光PCR 檢測結(jié)果為EV71 和CA16 病毒陰性而EV 通用型為陽性的標(biāo)本，設(shè)計了UTR合成兩對引物，引物參考之前的文章［8］，提取病毒RNA 進(jìn)行RT-PCR，電泳片段符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，根據(jù)UTR基因核苷酸序列的同源性進(jìn)行型別鑒定。

結(jié)果

1.2022年HFMD病原體檢出情況

2020 年新冠病毒突然暴發(fā)后，EV 陽性率明顯下降，2022 年同時進(jìn)行EV 通用型、EV71、CA16 檢測的標(biāo)本有362份，總陽性47份，陽性率為12.98%，EV71全年沒有檢測到，CA16病毒陽性率為1.38%（5/362），CA16僅在4—7月份檢測到，且檢出率不高。非EV71非CA16的EV全年陽性率為11.60%（42/362）。全年檢出率較高在5—7 月份，最高檢出率在6月份，為22.22%。見表1。

2.2023年1—8月HFMD病原體檢出情況

2023年是新冠病毒全國放開管控的第一年，EV 陽性明顯增多，2023 年1—8 月同時進(jìn)行EV 通用型、EV71、CA16 3種病毒檢測的手足口病標(biāo)本有297份，總陽性100份，陽性率為33.67%，1—8 月沒有檢出EV71，CA16 的檢出率為2.36%（7/297），非EV71 非CA16 的EV 共檢測出93 份，陽性率為31.31%（93/297），2023 年6、7 月份維持于較高的陽性率。2023年1—8月各月同時檢測3種病毒情況見表1。

3.非EV71非CA16的EV型別擴(kuò)增與分析

我們選取了熒光PCR檢測結(jié)果中的EV71和CA16是陰性而EV 通用型為陽性的部份標(biāo)本提取RNA，選取2022 年標(biāo)本26份、2023年標(biāo)本38份，提取RNA進(jìn)行RT-PCR，對電泳片段符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，2022 年標(biāo)本成功測序20 份，可分型為18 份，2023年成功測序31份，可分型為28份。序列用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST 程序進(jìn)行比較后，確定序列屬于EV 型別，各序列屬于病原譜如表2。在2022—2023 年中檢出的非EV71 非CA16 的EV 有9 種，分別為：CA6、CA10、CA4、CA2、CA8、柯薩奇病毒B 組5 型（CB5）、CB2、CB3、?？刹《?0 型（E30）。其中CA6 在非EV71 非CA16 的EV 中占主要病原，檢出率為27.45%，第二位是CA10，檢出率為15.69%，這兩種病毒占到非EV71 非CA16的EV的43.14%。各種型別的EV檢出情況見表2。

討論

HFMD 在我國從2008 年大規(guī)模暴發(fā)以來，連續(xù)多年在我國尤其是華南地區(qū)普遍流行，HFMD是一種對5歲以下兒童具有嚴(yán)重危害性的傳染病，2008 年已將HFMD 納入國家法定傳染病丙類傳染病。2020年，新冠病毒的突然暴發(fā)，導(dǎo)致管控措施的出現(xiàn)：如戴口罩、城市局部封閉，同時限制人口流動，改變了人們的生活方式，2022 年底才放開疫情管控。為了解新冠疫情期間及放開后廣州地區(qū)的HFMD 病原感染情況，我們選取了新冠疫情期間及新冠疫情期放開后這段時間進(jìn)行對比，分析廣州和佛山地區(qū)手足口病的感染情況。

2022 年是新冠病毒暴發(fā)的第3 年，也是疫情管控的最后一年，2022年上半年廣佛地區(qū)疫情管控相對較松的，下半年從國慶節(jié)后收緊直到11 月底放開，12 月份大規(guī)模感染新冠病毒，反映在HFMD 病原體流行特征為：上半年相對有流行，下半年流行明顯下降。2022 年全年我們門診HFMD 的總陽性檢出率為12.98%（47/362），2022 年全年沒有檢出EV71，CA16 檢出率也較低，僅在4—7 月有檢出，在同時進(jìn)行3 種病毒檢測標(biāo)本中，非EV71 非CA16 的EV，除12 月外全年11 個月都有檢出，因為12 月是疫情放開的第一個月，很多人感染了新冠病毒，12月份沒有檢出EV，5—7月是EV檢出較高的月份，其中全年最高檢出率在6月份，為22.22%（8/36）。2023 年是新冠疫情放開的第一年，在1—4 月，EV的檢出率不算高，而到了5 月份，EV 的檢出率突然增加，到了8 月份又下降明顯，2023 年1—8 月的檢出率為33.67%，最高檢出率為6月，為54.55%。2023年廣佛地區(qū)的EV檢出在5—7 月陽性率有一個突然上升的趨勢，增加明顯，而到8 月份又下降明顯。2022 年的HFMD 流行特征與前兩年我們收集的數(shù)據(jù)（2020、2021）有些不一樣［9］，2022 年因為下半年的管控與放開，2022年下半年HFMD并沒有明顯的流行，與2020年上半年管控相似，而在2021年HFMD 還是存在兩個明顯的流行時期，到了2023 年，前4 月EV 并沒有明顯流行，可能是人們剛剛感染了新冠病毒，而到了5 月份后，EV感染突然開始上升，到了8月份又比7月份下降明顯。新冠疫情結(jié)束后的2023 年比疫情期間的2022 年EV 陽性率高，今后的EV 感染趨勢是否存在與2019 年之前那樣存在夏秋兩季流行，有待觀察。

為了解2022—2023年EV 中除CA16、EV71外的具體哪些病毒流行，我們選取了熒光PCR 檢測結(jié)果為EV71 和CA16 是陰性而EV 通用型為陽性的部份標(biāo)本直接提取RNA，設(shè)計了EV 5'UTR 的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，之后進(jìn)行測序及序列分析。2022—2023 年共選取了64 份標(biāo)本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增測序分析，有效分析了51 份序列，可以分型的有46 份，而5 份不能確定型別的，占9.80%，本次非EV71 非CA16 病毒確定了9 種病毒型別，這些型別存在于我們之前的統(tǒng)計數(shù)據(jù)中［8-9］，HFMD 經(jīng)過10 多年的演變，感染型別趨于多樣化［10］，這次我們分析的序列中分型的型別相對偏少，這可能與我們擴(kuò)增的標(biāo)本數(shù)量、分析的序列偏少有關(guān)。我們確定的型別中占主要的是腸道病毒A 組，為CA6、CA10、B5 等，其中CA6 和CA10 是最主要的兩種病毒，這與國內(nèi)別的地區(qū)流行趨勢基本一致［11-13］，CA6 和CA10 已成為全球HFMD流行的主要病原［14-16］。

2022—2023年的檢測標(biāo)本中沒有檢測出EV71感染，這與我國多年來推行EV71 疫苗相關(guān)［17］，而CA16 感染率也是較低，非EV71非CA16的病毒占主要，這種感染狀況在全國持續(xù)多年［3-4，18］，非EV71 非CA16 的EV 中存在較多型別，型別復(fù)雜，現(xiàn)在主要以CA6、CA10為主，CA6從2013年前后在我國開始流行［7，19］，現(xiàn)在已成為HFMD 的主要病原體，而近年來柯薩奇病毒B 組型別檢出率也相對較高，其中以CB5 為多，同時?？刹《拘蛣e也檢出較多［13］，在我們測序中，有一定比例的非EV71 非CA16 的EV 難以定型，可能還有別的型別沒有區(qū)分，這表明HFMD 感染型別較多，也側(cè)面說明我國HFMD 這10 多年長期一直流行，可能與EV 型別多樣化相關(guān)。因此，在監(jiān)測EV71 和CA16 這兩種主要型別EV 的同時，需要加強(qiáng)對非EV71 非CA16 的EV 的監(jiān)測及分子流行病學(xué)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 肖雪：構(gòu)建思路，論文寫作，設(shè)計試驗；梁妤婷、古銳：標(biāo)本采集，數(shù)據(jù)收集，整理資料；李莉、陳娟：標(biāo)本采集，實施試驗，分析數(shù)據(jù)；鐘家禹：審核論文，修改論文