陽碩，相佳宏，李子怡，許琳灝，施妍，劉偉

（1.司法鑒定科學(xué)研究院上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺司法部司法鑒定重點實驗室，上海 200063； 2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009）

樣品前處理是法醫(yī)毒物分析中一個重要的環(huán)節(jié)，尤其是體內(nèi)毒物分析，生物檢材基質(zhì)復(fù)雜、目標(biāo)物含量極低且存在形式多樣，在復(fù)雜的生物基質(zhì)中對痕量目標(biāo)物進(jìn)行提取、純化和濃縮直接關(guān)系到分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和結(jié)果判斷的科學(xué)性。 因此，高效且環(huán)保的樣品前處理方法對于分析結(jié)果的判斷顯得至關(guān)重要。

常見的樣品前處理方法主要有固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀法、微透析技術(shù)、超臨界流體萃取等。 固相萃取因其試劑用量少，且可與分析儀器在線連接，從而提高檢測效率，已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)的提取富集，但缺點是耗時長、成本高以及重復(fù)性難以保證。 液液萃取也被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域，如菊酯類農(nóng)藥、苯二氮類鎮(zhèn)靜安眠藥、苯丙胺類毒品等[1]。 與固相萃取相比，液液萃取操作簡便、無特殊設(shè)備要求，但該樣品前處理方法中的混合液易形成乳化現(xiàn)象，且萃取劑通常為有毒有機溶劑，可能存在污染環(huán)境的問題。 除了上述提到的固相萃取和液液萃取外，還有許多其他的樣品前處理方式，如簡單快捷的蛋白沉淀法，可進(jìn)行活體取樣的微透析技術(shù)以及相對環(huán)保的超臨界流體萃取技術(shù)等。 但是這些方法均存在不足，如蛋白沉淀法不能完全去除內(nèi)源性物質(zhì)，會稀釋樣品濃度，同時還存在生物樣本對環(huán)境造成污染的問題。 微透析技術(shù)雖然可以活體取樣，且所需樣本量較小，但是會對局部組織造成損傷，適用范圍較窄，只適用于水溶性、小分子物質(zhì)，對法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域的大多數(shù)目標(biāo)物并不適用。 超臨界流體萃取技術(shù)可提取植物內(nèi)的生物活性物質(zhì)，但提取過程中使用的夾帶劑會殘留在組分中，由于對反應(yīng)釜的要求很高，前期投入較大，故該方法多應(yīng)用于工業(yè)提取。

相較于上述提及的多種樣品前處理方法，移液吸頭微萃取技術(shù)在法醫(yī)毒物分析中有著巨大優(yōu)勢。該方法所需樣本量小、提取速度快、回收率高、選擇性好，并且消耗的有機溶劑少，更加環(huán)保，適用于法醫(yī)毒物分析中的多種檢材和目標(biāo)化合物。 移液吸頭微萃取技術(shù)屬于微固相萃?。é?solid phase extraction，μ-SPE），其在傳統(tǒng)固相萃取的基礎(chǔ)上進(jìn)行改善和發(fā)展，已應(yīng)用于諸多法醫(yī)毒物分析實例中。本文將系統(tǒng)性地介紹移液吸頭微萃取技術(shù)及其在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用。

1 前處理方法概述

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）可分為傳統(tǒng)的固相萃取、固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）、μ-SPE 和磁固相萃?。╩agnetic solid phase extraction，MSPE）。本文介紹的移液吸頭微萃取技術(shù)屬于μ-SPE，而μ-SPE 又可分為以下三類：移液吸頭固相萃取（μ-solid phase extraction pipette tips，μ-SPE-PT）、分散式移液吸頭微萃?。╠isposable pipette extraction，DPX）、吸附劑填充式微萃?。╩icro-extraction by packed sorbent，MEPS）。本文所介紹的移液吸頭微萃取是指μ-SPE-PT（1989 年提出的）[2]和DPX（2003 年提出的）[3]。

移液吸頭微萃取技術(shù)適用于多種生物樣本的檢測分析，檢測效率高[4]。 移液吸頭微萃取技術(shù)是目前基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)中純化、濃縮和選擇性分離蛋白質(zhì)和多肽的重要工具[5-7]。 相比于傳統(tǒng)的固相萃取，移液吸頭微萃取所需要的樣品量小，消耗的有毒溶劑也更少，還可以重復(fù)使用，從而提高回收率[8]。 因此，該萃取技術(shù)不僅操作簡單，而且提取效率也更高。 對于生物樣品，尤其是樣本量較小的生物樣品，移液吸頭微萃取的效果要遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的固相萃取[9]。 萃取移液吸頭有商業(yè)版本和自制版本，自制移液吸頭大多應(yīng)用于精神類藥物和污染物的萃取，可重復(fù)使用，減少了生物樣品帶來的環(huán)境污染和潛在傳染性，另外也可在實驗室進(jìn)行一些預(yù)實驗，為其商業(yè)化提供建議和方向。 由于自制移液吸頭費時費力，因此在常規(guī)實踐中優(yōu)先選擇商業(yè)版本的移液吸頭。 移液吸頭微萃取是一種發(fā)展中的新技術(shù)，相比于其他前處理方式的成本更高，這也是其應(yīng)用受限的主要因素。

1.1 μ-SPE-PT

μ-SPE-PT 是傳統(tǒng)固相萃取的小型化版本（具體可參考文獻(xiàn)[10]），其移液吸頭頭部有特殊的形狀，可以將吸附劑包裹其中，達(dá)到固定吸附劑的目的，移液吸頭體通常由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚烯烴制成[11]。 相比于傳統(tǒng)的SPE，μ-SPE-PT 的樣品萃取速度更快，且回收率也更高[12]。

μ-SPE-PT 的應(yīng)用方法簡單：首先，選用合適的溶劑激活吸附劑。 吸附劑位點活化后使該固相和樣品中的分析物之間產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆肿幼饔茫缓笫箻悠啡芤哼M(jìn)入移液吸頭，吸附劑（固相）可以吸附樣品中目標(biāo)化合物和干擾化合物，隨后使用有機溶劑或混合溶劑來去除干擾物。最后，用一種溶劑洗脫目標(biāo)化合物[10]。 使用時應(yīng)注意移液吸頭堵塞和針管污染的問題，因此，樣品在使用移液吸頭提取前有必要對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理，且吸取樣品時應(yīng)該小心謹(jǐn)慎，以防止污染。

1.2 DPX

DPX 由傳統(tǒng)的SPE 改造而來，是固相萃取和分散萃取的結(jié)合。 DPX 萃取裝置有1 mL 或5 mL 兩種容量的移液吸頭，最初粉狀吸附劑自由地分散在移液吸頭內(nèi)，后來對裝置進(jìn)行改進(jìn)，吸附劑可以很好地分散在兩個固定裝置之間，處于裝置下端較低的部分（具體可參考文獻(xiàn)[10]），有利于液體的雙向流動，同時還可防止注射器被污染。

DPX 的使用步驟大致與μ-SPE-PT 相類似，但原理有一些不同。 首先，用溶劑來活化吸附劑，然后將樣品吸入移液吸頭并與吸附劑充分混合，最后用合適的洗脫劑洗脫雜質(zhì)。 如果所需組分的回收率較低， 則可通過重復(fù)整個過程的步驟來提高效率，包括重復(fù)樣品上樣和樣品洗脫。 與μ-SPE-PT 不同的是，在提取過程中可吸入少許空氣，使樣品溶液中的目標(biāo)物和吸附劑充分接觸、混合，從而提高樣品回收率[13]。 DPX 前處理過程簡單，只需要在上樣前對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理（如稀釋、離心、蛋白沉淀等）即可，以防止萃取移液吸頭發(fā)生堵塞[14]。

2 移液吸頭微萃取技術(shù)在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

DPX 和μ-SPE-PT 是常見的兩種微萃取移液吸頭，市面上有許多商業(yè)化的微萃取移液吸頭，對于不同性質(zhì)的目標(biāo)物，其對應(yīng)的吸附劑也有所不同。 在法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域，目前已報道的商業(yè)萃取移液吸頭的吸附劑有：苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）、磺酸官能化的陽離子交換劑（CX）、十八烷基硅烷顆粒（C18）、反向吸附劑-鹽析（RP-S）、弱陰離子交換劑-鹽析（WAX-S）、強陽離子交換劑（SCX）等。除了商用吸附劑，許多實驗室也會通過自制吸附劑來達(dá)到檢測目的。 已報道的有關(guān)法醫(yī)毒物分析的自制萃取移液吸頭吸附劑有：聚丙烯腈和金屬有機骨架組成的納米纖維（PAN/MIL-53（Fe））、微碳納米管（MWCNT）、胺功能化鋯基金屬有機框架（Zr-MOFNH2）、苯乙烯-二乙烯苯共聚物（SDVB copolymer/PANI composites）、十八烷基硅烷外表面包有牛血清白蛋白（RAM-C18-BSA）、三維-離子液體-Fe3O4-石墨烯納米復(fù)合吸附劑（3D-IL-Fe3O4-GO）、聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯[poly（MMA-co-EDMA）]等。 已有很多研究[15-42]報道過移液吸頭微萃取在法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體如表1 所示。

表1 移液吸頭微萃取在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

2.1 移液吸頭微萃取技術(shù)在毒品分析中的應(yīng)用

2.1.1 大麻類

大麻是全球范圍內(nèi)濫用最為嚴(yán)重的毒品[15]。Δ9-四氫大麻酚（Δ9-THC）是大麻中的主要活性成分，而Δ9-四氫大麻酸（Δ9-THC-COOH）是其主要代謝產(chǎn)物，因此Δ9-THC-COOH 是尿液中的主要檢測目標(biāo)物，Δ9-THC 是血液及口腔液中的主要檢測目標(biāo)物?？诜?-THC 的生物利用度低，僅有4%～20%，口服后4～6 h 的血藥峰質(zhì)量濃度通常不超過10 ng/mL[43]，如果近期有攝入過大麻，在呼氣中也可檢出Δ9-THC，質(zhì)量濃度通常比血液中的更低（pg/mL）[44]。 因此，需要建立一種更加快速靈敏且高效的檢測分析方法。目前，已報道的檢測血液中Δ9-THC 含量的前處理方法有SPE[45-46]和LLE[47-49]等。 但前處理時間較長，不利于半衰期短且生物利用度低的Δ9-THC 在生物基質(zhì)中的檢測分析，且重復(fù)性也難以保證，而快捷的移液吸頭微萃取能夠縮短前處理時間且具有較高的重復(fù)性，彌補了SPE、LLE 等存在的缺陷。LUO 等[16]建立一種在血液和呼氣中應(yīng)用新型衍生化法檢測大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）、四氫大麻酚（THC）及其代謝物的方法，將200 μL 血液及呼氣樣品加入內(nèi)標(biāo)后，重氮衍生化0.5 h，衍生化后的呼氣樣品直接進(jìn)入LC-MS/MS 系統(tǒng)分析，血液樣品應(yīng)用商業(yè)的DPX 萃取移液吸頭和WAX-S 吸附劑，并利用衍生化反應(yīng)顯著提升了在血液中檢測CBN、CBD 等的靈敏度，血液和呼氣中目標(biāo)物定量限分別低至0.1～0.25 ng/mL 和0.5～2.5 pg/mL，較以往的在呼氣中檢測THC 的方法靈敏度提高了約100 倍[44，50-51]。

已報道的應(yīng)用移液吸頭微萃取技術(shù)在生物基質(zhì)中檢測分析大麻類的方法中（表1），均使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正其輕微的基質(zhì)抑制作用[23]。 大多數(shù)前處理方式為乙腈沉淀蛋白后使用DPX 萃取移液吸頭和弱陰離子交換劑-鹽析（WAX-S）吸附劑進(jìn)行提取。由于THC 及其代謝物為弱酸性化合物， 因此選擇弱陰離子交換劑進(jìn)行吸附。 目標(biāo)物均為類脂溶性化合物，難溶于水，鹽析可以輔助目標(biāo)物從水相轉(zhuǎn)移到有機相，從而進(jìn)一步提高回收率。 另外，雜質(zhì)會保存在吸附劑上，故不需清洗和洗脫步驟，方便快捷。

2.1.2 苯丙胺類

甲基苯丙胺是一種強效的中樞神經(jīng)興奮劑。 在已報道的生物基質(zhì)中檢測苯丙胺類毒品的方法中，大多數(shù)前處理方式為SPE[52-54]或LLE[55-58]等，但是通常需要的前處理時間較長，且會消耗大量的有機溶劑，容易造成環(huán)境污染。 KUMAZAWA 等分別應(yīng)用μ-SPE-PT 萃取移液吸頭和C18吸附劑提取血液[22]和尿液[25]中的甲基苯丙胺和苯丙胺。在100 μL 的血液中加入400 μL 水和50 μL 5 mol/L 氫氧化鈉溶液，然后經(jīng)過25 次移液吸頭萃取循環(huán)，將吸附劑與目標(biāo)化合物充分混合后用甲醇洗脫，洗脫5 次后用三氟乙酸酐進(jìn)行衍生化，最后使用GC-MS 進(jìn)行分析檢測。其中，甲基苯丙胺的回收率大于87.6%，苯丙胺的回收率大于81.7%，檢出限分別為1.5、1.1ng/mL。尿液的體積為500 μL，前處理步驟和血液一致，最后使用GC-MS 進(jìn)行檢測分析，甲基苯丙胺的回收率大于82.9%，苯丙胺的回收率大于82.2%，檢出限分別為0.08、0.1 ng/mL。 與其他檢測方法相比（表1），KUMAZAWA 等[22]和MONTESANO 等[23]所提的方法中，移液吸頭提取循環(huán)次數(shù)最多（25 次），回收率也較高（79.7%～94.7%），側(cè)面反映出循環(huán)次數(shù)的增加有利于提高目標(biāo)物的回收率，但要注意吸附劑飽和現(xiàn)象[23]。

2.1.3 其他毒品

除了上述提到的大麻類和苯丙胺類毒品，也有應(yīng)用移液吸頭微萃取技術(shù)對其他毒品進(jìn)行提取純化的報道。 STOWE 等[59]提出一種在頭發(fā)基質(zhì)中檢測阿片類物質(zhì)的方法，該方法的前處理過程應(yīng)用了DPX 萃取移液吸頭和CX 吸附劑。 首先，將12 mg頭發(fā)置于1.1 mL 甲醇和三氟乙酸（體積比為90∶10）溶液中，微波爐中90 ℃加熱60 min，使用含有吸附劑的萃取劑移液吸頭提取后用600 μL 0.1 mol/L 的乙酸鹽緩沖溶液沖洗兩次，甲醇溶液沖洗一次，以去除雜質(zhì)干擾。 再使用550 μL 二氯甲烷-異丙醇-氫氧化銨（體積比為80∶20∶3）溶液洗脫，40 ℃下氮氣吹干洗脫液，最后用225 μL 0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液復(fù)溶。 該前處理方法結(jié)合LC-MS 技術(shù)對頭發(fā)中可待因、嗎啡、羥考酮等阿片類物質(zhì)進(jìn)行檢測分析，回收率為54%～81%，定量限為0.05 ng/mg。此外，由于阿片類藥物在C18吸附劑上的保留較差，故在檢測目標(biāo)物含有阿片類物質(zhì)時，微萃取移液吸頭的吸附劑通常不選擇C18吸附劑。

2.2 移液吸頭微萃取技術(shù)在精神類藥物分析中的應(yīng)用

精神藥物主要有抗抑郁藥、抗精神病藥、抗驚厥藥和其他相關(guān)藥物，主要目的是治療各種精神疾病。 近年來，精神藥物的濫用也在增加[60]，對公共安全造成了一定威脅。 KUMAZAWA 等[35]提出一種在100 μL 血漿中檢測分析五種酚噻嗪類物質(zhì)的方法，該方法應(yīng)用μ-SPE-PT 萃取移液吸頭和C18吸附劑進(jìn)行前處理提取（循環(huán)25 次），然后使用200μL10%甲醇溶液清洗雜質(zhì)，清洗后的移液吸頭放置在真空下干燥30 s，干燥后用100 μL 甲醇洗脫5 min，洗脫液直接注入GC-MS 進(jìn)行檢測分析，目標(biāo)物回收率為91%～95%，定量限為2.5～20 ng/mL。 該提取方法的洗脫液直接注入氣相色譜儀，無需揮干復(fù)溶，步驟簡單快捷，相比與常規(guī)的固相萃取，時間縮短了至少15 min，另外消耗的樣品僅100 μL，溶劑總共消耗0.7 mL，均比之前的報道更少，有利于減少環(huán)境污染。 該方法為法醫(yī)毒物分析中酚噻嗪類藥物的篩選和定量分析提供了新的思路和工具， 有望引入常規(guī)檢測，更加廣泛的應(yīng)用。

3 結(jié)語與展望

在法醫(yī)毒物分析中，移液吸頭微萃取技術(shù)作為一種在傳統(tǒng)固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展而來的先進(jìn)技術(shù)，適用于各種生物樣品的前處理，其應(yīng)用前景十分可觀。 相比于傳統(tǒng)固相萃取，移液吸頭微萃取技術(shù)具有提取效率高、環(huán)保、所需樣品量少、可重復(fù)使用和可自動化等優(yōu)點，雖然也有價格昂貴、商業(yè)化產(chǎn)品數(shù)量少和吸附劑會發(fā)生飽和等不足之處，但發(fā)展前景依然十分可觀，有望進(jìn)一步降低成本，擴大生產(chǎn)，爭取盡早在常規(guī)檢測中廣泛應(yīng)用。