付艷杰 郭文靜 段鵬月 劉星辰

作者單位：450000 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,河南省腫瘤醫(yī)院

淋巴瘤屬于惡性血液系統(tǒng)腫瘤,具有高度異質(zhì)性,其中非霍奇金淋巴瘤占比約90%[1]。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是常見(jiàn)的侵入性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤,發(fā)病率約占總非霍奇金淋巴瘤的30%,且具有全身浸潤(rùn)特點(diǎn)[2]。臨床治療以化療、放療等方案為主,經(jīng)一線治療后治愈率約70%,但仍有30% DLBCL患者復(fù)發(fā),10%～15%呈現(xiàn)難治性,2年生存率僅20%[3]。既往研究顯示對(duì)于復(fù)雜/難治性DLBCL再次采用原方案或進(jìn)行二線治療難以起效[4]。隨著腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展和技術(shù)發(fā)展,嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-Cell,CAR-T)被發(fā)現(xiàn)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有較好的靶向性和殺傷活性。同時(shí)通過(guò)準(zhǔn)確評(píng)估治療效果,將治療方案進(jìn)行個(gè)體化的調(diào)整,提高DLBCL患者的治愈率是當(dāng)前臨床的研究熱點(diǎn)。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)屬于糖酵解酶,是腫瘤微環(huán)境中重要的代謝酶之一,在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中提供能量[5]。淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫功能的重要組成部分,在細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)中起了關(guān)鍵作用,大量研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(absolute lymphocyte count,ALC)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[6]。CD4+/CD8+在腫瘤免疫監(jiān)測(cè)中具有重要作用,Ki67是判斷腫瘤增殖能力和判斷腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)。故本研究主要探討CAR-T免疫療法對(duì)復(fù)發(fā)/難治性DLBCL患者LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取我院2018年2月至2022年2月收治且明確診斷為復(fù)發(fā)難治性DLBCL患者92例,男性49例,女性43例;年齡22～74歲,平均(55.13±14.36)歲,符合《中國(guó)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),滿足以下任意1項(xiàng)即可診斷:①經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療至完全緩解(complete remission,CR),但半年內(nèi)復(fù)發(fā),采用原方案或二線治療方案無(wú)法獲得CR;②經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)一線治療≥4療程,病情進(jìn)展或腫瘤縮小<50%;③造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)活檢確診;②可干預(yù)靶點(diǎn)(CD20/CD19);③年齡≥18歲,≤75歲;④ECOG評(píng)分[8]:0～3分;⑤預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月;⑥外周血T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≥0.2×109/L;⑦臨床資料及隨訪資料完善;⑧AnnArbor分期[9]:Ⅱ～Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn):①T細(xì)胞淋巴瘤患者;②育齡期婦女妊娠結(jié)果為陽(yáng)性;③心、腦、肝等器官功能嚴(yán)重衰竭;④既往1個(gè)月內(nèi)參加其他臨床試驗(yàn)者;⑤采用激素或免疫抑制治療其他慢性疾病者;⑥伴有自身免疫疾病或免疫缺陷者;⑦伴有嚴(yán)重感染者。

1.2 治療方法

所有患者均行CAR-T細(xì)胞免疫治療?；颊哂诒驹盒型庵苎馨图?xì)胞單采,抽取DLBCL患者外周靜脈血,采用血細(xì)胞單采儀(COBE Spectra型)應(yīng)用采集程序采集80～100 mL血細(xì)胞,獲得適量淋巴細(xì)胞,數(shù)量>1×109/L。行體外分離、純化T細(xì)胞。構(gòu)建CAR表達(dá)載體,利用基因工程技術(shù),選擇CD19作為靶點(diǎn)分子融合T細(xì)胞受體的跨膜激活信號(hào)域,促進(jìn)T細(xì)胞增殖,使CAR基因在T細(xì)胞表面表達(dá),制成CAR-T細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)程無(wú)菌操作、嚴(yán)格質(zhì)控。CAR-T細(xì)胞治療前3～5 d行FC方案(氟達(dá)拉濱30 mg/m2·d-1+環(huán)磷酰胺750 mg/m2·d-1)連續(xù)3 d預(yù)處理。根據(jù)患者反應(yīng)輸注人源化CD19 CAR-T細(xì)胞,輸注劑量均為1×106/kg,總輸注劑量為5×108～11×108cell。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 療效評(píng)估[10]觀察DLBCL患者經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療后總有效率,CR:治療前相關(guān)臨床病癥體征完全消失;治療后殘留病灶經(jīng)正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission tomography,PET)掃描呈陰性,為典型氟代脫氧葡萄糖(FDG)高親和性淋巴瘤;治療后CT顯示淋巴結(jié)及淋巴結(jié)病灶縮至正常大小;治療后不觸及肝、脾,影像學(xué)檢查為正常大小。部分緩解(partial remission,PR):淋巴結(jié)、肝、脾無(wú)增大,單個(gè)淋巴結(jié)最大橫徑縮小≥50%;其他器官未見(jiàn)可測(cè)量病灶;無(wú)新病灶。穩(wěn)定(stable disease,SD):治療效果未達(dá)到CR和PR,但不符合疾病進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn);影像學(xué)檢查未見(jiàn)新病灶。進(jìn)展(progression disease,PD):治療中出現(xiàn)橫徑≥1.5 cm新病灶;淋巴結(jié)、受累結(jié)節(jié)及其他病灶增大≥50%。總有效率=(CR+PR)/接受治療總病例數(shù)×100%。觀察治療有效和無(wú)效患者臨床特征,包括性別、年齡、AnnArbor分期、ECOG評(píng)分、結(jié)外受累部位、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index,IPI)、CAR-T治療線數(shù)。

1.3.2 安全性評(píng)價(jià) 以治療開(kāi)始后的臨床觀察、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及相關(guān)特殊檢查為依據(jù),觀察經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療后患者細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome,CRS)、神經(jīng)毒性反應(yīng)、低免疫球蛋白血癥等。

1.3.3 LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平檢測(cè) 取患者外周靜脈血6 ml,采用全自動(dòng)生化分析儀(博科BK-400型)檢測(cè)LDH水平;采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(WD-5000型)檢測(cè)ALC、CD4+/CD8+表達(dá)。超聲引導(dǎo)下穿刺取病灶活檢標(biāo)本,40 g/L甲醛溶液固定行石蠟包埋,采用免疫組化法檢測(cè)癌組織Ki67水平,試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司,操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

92例DLBCL患者經(jīng)CAR-T細(xì)胞免疫治療后CR 39例(42.39%),PR 24例(26.09%),SD 18例(19.57%),PD 11例(11.96%),總有效率為68.48%。

2.2 不良反應(yīng)

92例DLBCL患者在CAR-T細(xì)胞免疫治療過(guò)程中71例(77.17%)發(fā)生CRS,均予以對(duì)癥治療,癥狀改善不明顯患者采用糖皮質(zhì)激素治療,未發(fā)生不良影響;發(fā)生低免疫球蛋白血癥73例(79.35%);未出現(xiàn)神經(jīng)毒性反應(yīng)。

2.3 治療前后LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平比較

經(jīng)CAR-T細(xì)胞免疫治療后LDH、Ki67水平較治療前下降,ALC、CD4+/CD8+較治療前上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DLBCL患者治療前后LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平比較

2.4 CAR-T細(xì)胞免疫治療有效和無(wú)效患者治療前臨床特征比較

DLBCL治療無(wú)效患者年齡、AnnArbor分期、結(jié)外受累部位數(shù)量、IPI、LDH、Ki67、CAR-T治療線數(shù)均高于治療有效組患者,ALC、CD4+/CD8+均低于治療有效組患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CAR-T細(xì)胞免疫治療有效和無(wú)效DLBCL患者治療前臨床特征比較

2.5 影響CAR-T細(xì)胞免疫治療療效的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析顯示,高齡、AnnArborⅣ期、多結(jié)外受累部位數(shù)量、高IPI得分、二線以上CAR-T以及治療前LDH、Ki67的水平升高和ALC、CD4+/CD8+的水平降低是影響DLBCL患者CAR-T細(xì)胞免疫治療療效的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 影響CAR-T細(xì)胞免疫治療療效的多因素分析

2.6 LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平對(duì)CAR-T細(xì)胞免疫治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值

建立ROC曲線,LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67 AUC分別為0.823、0.835、0.873、0.849,提示LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67 對(duì)CAR-T細(xì)胞免疫治療療效具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平對(duì)CAR-T細(xì)胞療效的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線

表4 治療前LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平對(duì)CAR-T細(xì)胞療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

DLBCL呈高度異質(zhì)性和侵襲性,經(jīng)規(guī)范治療具有較好的緩解率,但部分患者在治療出現(xiàn)CR或造血干細(xì)胞移植后1～3年復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)發(fā)/難治性DLBCL[11]。復(fù)發(fā)/難治性DLBCL傳統(tǒng)治療療效差,中位生存期短。CAR-T細(xì)胞療法是近年來(lái)推出的新型精準(zhǔn)靶向治療腫瘤細(xì)胞技術(shù),成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),可通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變異,從而殺滅癌細(xì)胞[12]。同時(shí)與傳統(tǒng)免疫治療相比,CAR-T可減少共刺激分子免疫逃逸,在血液系統(tǒng)腫瘤中具有良好的療效[13]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)CAR-T細(xì)胞免疫治療后臨床總有效率68.48%。而CAR-T細(xì)胞免疫治療在取得療效的同時(shí),存在CRS、神經(jīng)毒性、感染、脫靶效應(yīng)等不良反應(yīng),其中以CRS常見(jiàn),由于CAR-T細(xì)胞活化可釋放大量細(xì)胞因子,刺激巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素,使患者發(fā)生持續(xù)性高熱等癥狀,這會(huì)引起多臟器功能障礙,嚴(yán)重情況下可危及生命[14-15]。本研究結(jié)果中71例(77.17%)發(fā)生CRS不良反應(yīng),及時(shí)干預(yù)后未見(jiàn)嚴(yán)重情況發(fā)生。CAR-T細(xì)胞滅殺腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)損傷正常B細(xì)胞,出現(xiàn)脫靶效應(yīng),B細(xì)胞和免疫球蛋白水平下降。本研究73例(79.35%)患者發(fā)生低免疫球蛋白血癥。因此在CAR-T細(xì)胞免疫治療中,應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)控患者不良反應(yīng)發(fā)生情況及不良反應(yīng)嚴(yán)重程度,并予以對(duì)癥治療。

此外LDH可為腫瘤細(xì)胞提供能量,因此在惡性腫瘤中水平高,當(dāng)腫瘤細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致大量LDH釋放入血,因此血清LDH測(cè)定在腫瘤療效的預(yù)后判斷中具有重要意義[16]。有研究顯示ALC與血液腫瘤預(yù)后具有密切關(guān)系,且ALC水平減少被列入霍奇金淋巴瘤預(yù)后評(píng)分,是霍奇金淋巴瘤預(yù)后的不良因素之一[17]。CD4+和CD8+均屬于T淋巴細(xì)胞,是人體免疫力的重要指標(biāo),CD4+主要代表T輔助細(xì)胞,其記數(shù)能夠直接反映人體免疫功能,但隨生理情況波動(dòng);CD8+代表T抑制細(xì)胞和T殺傷細(xì)胞,而CD4+/CD8+從整體上反映細(xì)胞免疫功能狀態(tài),在腫瘤免疫檢測(cè)中具有重要作用[18-19]。Ki67是判斷腫瘤增殖能力、腫瘤惡性程度及預(yù)后效果的重要指標(biāo),但在DLBCL中Ki67陽(yáng)性指數(shù)存在爭(zhēng)議[20]。本研究結(jié)果中DLBCL治療無(wú)效患者年齡、AnnArbor分期、ECOG評(píng)分、結(jié)外受累部位數(shù)量、IPI、LDH、Ki67、CAR-T治療線數(shù)均高于治療有效組患者,ALC、CD4+/CD8+均低于治療有效組患者。采用Logistic回歸分析結(jié)果顯示,高齡、AnnArborⅣ期、多結(jié)外受累部位數(shù)量、高IPI得分、二線以上CAR-T以及治療前LDH、Ki67的水平升高和ALC、CD4+/CD8+的水平降低是影響DLBCL患者CAR-T細(xì)胞免疫治療療效的危險(xiǎn)因素。這與高齡患者自身免疫功能下降、臟器衰竭等相關(guān),同時(shí)DLBCL患者AnnArbor疾病分期越高,存在多個(gè)結(jié)外受累部位提示病情越嚴(yán)重。而IPI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)患者年齡、臨床分期、結(jié)外受累數(shù)量、LDH等評(píng)價(jià)預(yù)后,因此IPI評(píng)分越高對(duì)預(yù)后危險(xiǎn)度越高。Ki67陽(yáng)性指數(shù)越高,提示腫瘤細(xì)胞惡性程度越高,因此可預(yù)測(cè)CAR-T細(xì)胞療效。本研究經(jīng)ROC曲線分析LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平AUC分別為0.823、0.835、0.873、0.849,提示對(duì)DLBCL療效具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述,DLBCL患者經(jīng)CAR-T細(xì)胞免疫治療后,可升高ALC和CD4+/CD8+表達(dá),降低LDH、Ki67水平表達(dá),且LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平的表達(dá)對(duì)臨床療效具有預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究未觀察DLBCL患者CAR-T細(xì)胞免疫治療后的生存期,以及LDH、ALC、CD4+/CD8+、Ki67水平對(duì)長(zhǎng)期預(yù)后的影響,待后續(xù)進(jìn)行更全面的臨床研究。