摘 要：分別以溫度和時間為變量，比較了濾膜法、酶底物法檢測地下水中總大腸菌群的數(shù)量。研究表明，2種方法的檢測結(jié)果隨溫度變化趨勢基本一致，在35、36、37 ℃時，大腸菌群生長最快，3個溫度下的檢測結(jié)果基本無差異（P < 0.05），而與28、32、40℃下的檢測結(jié)果相比差異明顯。濾膜法和酶底物法的培養(yǎng)時間在22、24、28 h時總大腸菌群基本無差異（P < 0.05），而16、18、20、32 h的總大腸菌群數(shù)差異明顯。因此為保證實驗數(shù)據(jù)真實準(zhǔn)確，2種檢測方法都應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度和時間。培養(yǎng)溫度為36±1 ℃，培養(yǎng)時間為22～28 h。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)溫度；培養(yǎng)時間；總大腸菌群數(shù)；濾膜法；酶底物法；影響因素

Temperature and time effects on different methods to detect total coliform bacteria in groundwater

WANG Puyu1，2

（1.Beijing Institute of Geo-Environment Monitoring， Beijing 100195， China；

2.Urban Groundwater Safety Prevention and Control Technology Innovation Base， Beijing 100195， China）

Abstract： This paper compared the number of total coliform bacteria detected by membrane filtration method and enzyme substrate method， using temperature and time as variables， respectively. The study shows that the detection results of the two methods basically agreed with the temperature change trend. At 35 ℃， 36 ℃ and 37 ℃， the coliform bacteria grew the fastest and showed almost no difference for the three temperatures （P<0.05）， but varied significantly at 28 ℃， 32 ℃， and 40 ℃. The primary culture time of filter membrane method and enzyme substrate method were basically not different at 22 h， 24 h and 28 h （P< 0.05）， while the total coliform number at 16 h， 18 h， 20 h and 32 h varied significantly. Therefore， in order to ensure the true accuracy of the experimental data， the culture temperature and time should be strictly controlled when using either of the two detection methods. The incubation temperature and time were 36 ± 1 ℃， and from 22 h to 28 h， respectively.

Keywords： incubation temperature; incubation time; total coliform bacteria; membrane filtration method; enzyme substrate method; influencing factors

地下水是城市生活和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要水源，且許多城市地下水的使用量占整個城市供水量的一半以上，城市垃圾糞便對地下水源的污染深受專家重視（朱濟(jì)成，1981；畢桂超等，2010）。大腸菌群是一類與糞便污染有關(guān)的菌群（呂肖楠，2014），主要包括大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌、檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌等，通常可作為水體糞便污染的指標(biāo)菌（張楊，2015）。指標(biāo)菌的數(shù)量與水體受糞便污染的程度呈正相關(guān)，且這些菌中極可能存在腸道致病菌，對人體健康存在威脅（昝帥君等，2015），地下水中大腸菌群的研究一直以來備受關(guān)注（陳露等，2013；劉京梅等，2006）。

在總大腸菌群檢測中，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間是重要的控制因素，溫度異?；蚺囵B(yǎng)時間有誤均會影響檢測結(jié)果。特別是與有機(jī)指標(biāo)和無機(jī)指標(biāo)相比，微生物的檢測周期一般較長。全自動固相萃取-高效液相色譜法檢測16種多環(huán)芳烴，40 min內(nèi)實現(xiàn)了全部待測指標(biāo)的分離檢測（紀(jì)春苗等，2017）；高效液相色譜法分離檢測鐵、銅、鋅，10 min內(nèi)便實現(xiàn)了Fe3+，Cu2+，Zn2+的同時分離測定（吳憲龍等，2000）；微生物的檢測周期相對要長（≥22 h），檢測中若某個步驟出現(xiàn)偏差，時間、精力均會增加，嚴(yán)重影響檢測效率。因此，結(jié)果異常的快速定位分析以及清楚了解符合檢測的溫度區(qū)間、培養(yǎng)時間區(qū)間尤為重要。環(huán)境因素、測樣要求不同，檢測方法亦不同。GB/T5750.12-2006生活飲用水衛(wèi)生指標(biāo)規(guī)定了3種檢測方法：濾膜法、多管發(fā)酵法、酶底物法。多管發(fā)酵法適用范圍廣，可用于各種水樣的檢測，但操作繁瑣，出具結(jié)果慢（鄒文燕等，2022）；相對多管發(fā)酵法，濾膜法操作簡便，出具結(jié)果快，適用范圍較窄，更適用于濁度較低、總大腸菌群較少的水樣（農(nóng)樹莘等，1993）；而酶底物法相對前2種方法成本較高，但操作簡單、檢測周期短（孫杰，2020）、準(zhǔn)確度高，且無需無菌環(huán)境（田立平等，2019），可滿足大量水樣檢測及應(yīng)急水樣檢測工作的需要（趙春霞等，2009；王士花等，2017），已在國際上被廣泛認(rèn)可。綜上可知，不同方法檢測總大腸菌群在操作及出具結(jié)果周期等方面各有不同，而其在檢測大腸菌群時隨環(huán)境如何變化？變化是否一致？逯南南等人（2014）用酶底物法檢測研究了不同溫度、不同時間、是否為無菌環(huán)境等條件下的大腸菌群的變化，而對不同方法檢測大腸菌群時檢測結(jié)果隨溫度時間的變化、檢測結(jié)果是否一致未做研究。

因此，本文分別選擇濾膜法和酶底物法（因多管發(fā)酵法流程復(fù)雜，檢測周期長，因此本文未選擇此方法），研究了總大腸菌群隨溫度、時間的變化，對比了2種檢測方法對大腸菌群隨環(huán)境變化的影響。此研究結(jié)果為濾膜法和酶底物法檢測總大腸菌群時控制培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度提供了理論依據(jù)，也為研究其他檢測方法對大腸菌群隨環(huán)境變化的影響提供了參考，進(jìn)而為深入研究不同方法下大腸菌群隨溫度、時間等其他環(huán)境條件變化的原理等提供了研究基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 實驗室設(shè)備與試劑

1）濾膜法

奧林巴斯顯微鏡，型號 CX33；博訊壓力滅菌器，型號 BXM-30R；生化培養(yǎng)箱產(chǎn)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號LRH-150；培養(yǎng)皿采用90 mm玻璃平皿；玻璃試管，直徑180 mm。培養(yǎng)基為品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，為BR（生物試劑），由北京奧博星生物科技有限公司購買。

2）酶底物法

程控定量封口機(jī)，型號 lk-2010；定量盤，97孔定量盤；定量瓶，100 mL一次性無菌定量瓶。培養(yǎng)基，Minimal Medium ONPG-MUG（簡稱MMO MUG）培養(yǎng)基試劑，以上儀器設(shè)備及試劑均由西安立科有限公司購買；生化培養(yǎng)箱與濾膜法中的描述一致。

1.2? 方法原理

1）濾膜法。水樣通過0.45 ?m的濾膜（已經(jīng)高溫煮沸滅菌），細(xì)菌即被截留在濾膜上，將帶有濾膜的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將可疑菌落進(jìn)行驗證實驗——革蘭氏染色、乳糖發(fā)酵實驗，若革蘭氏染色出現(xiàn)特征菌，且乳糖發(fā)酵實驗中有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，表明此特征菌為大腸菌群陽性。計數(shù)濾膜上出現(xiàn)的此特征菌群數(shù)，即100 mL水樣中總大腸菌群數(shù)。

2）酶底物法。水樣經(jīng)過選擇性培養(yǎng)基（MMO MUG）培養(yǎng)會產(chǎn)生了一類細(xì)菌菌群，此類菌群可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），當(dāng)β-半乳糖苷酶將MMO MUG培養(yǎng)基中的色原底物分解，便釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，通過計算定量盤中顏色變化的格數(shù)算出水樣中總大腸菌群數(shù)。

1.3? 實驗方法及步驟

為了研究培養(yǎng)溫度、時間對大腸菌群數(shù)的影響是否會因檢測方法的不同而變化，本實驗以濾膜法和酶底物法為檢測方法，對6個北京市采集的地下水樣（樣品編號分別為D1、D2、D3、D4、D5、D6）分別在28、32、35、36、37、40℃溫度下培養(yǎng)24 h后研究總大腸菌群數(shù)隨溫度的變化，在36℃下分別培養(yǎng)16、18、20、22、24、28、32 h研究總大腸菌群數(shù)隨時間的變化。

每個水樣設(shè)置2個平行樣，以平行樣的均值作為檢測結(jié)果，且每一批水樣均設(shè)置空白培養(yǎng)基作為空白對照，設(shè)置質(zhì)控樣驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。具體檢測步驟見表1。

1.4? 計算方法

1）濾膜法：總大腸菌群數(shù)按公式（1）計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，以每100 mL水樣中的總大腸菌群數(shù)（CFU·100 mL-1）表示。公式（1）計算所得總大腸菌群數(shù)是以濾膜上生長的大腸菌群數(shù)計的。

總大腸菌群菌落數(shù) = （數(shù)出的大腸菌群菌落數(shù)×100）/過濾的水樣體積 （1）

2）酶底物法：計數(shù)經(jīng)培養(yǎng)后的定量盤中出現(xiàn)黃色反應(yīng)的孔數(shù)，對照MPN表查出最終的大腸菌群數(shù)（MPN·100 mL-1）。

對不同溫度和時間做的數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計17.0軟件進(jìn)行處理，以P<0.05作為差異標(biāo)準(zhǔn)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 溫度對總大腸菌群的影響

1）濾膜法

實驗中溫度分別設(shè)置為28、32、35、36、37、40℃，培養(yǎng)時間為24 h，檢測結(jié)果如圖1-a所示。由圖1-a可知，以濾膜法檢測總大腸菌群時，6個水樣的檢測值隨溫度變化趨勢基本一致，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35～37℃時，各溫度下總大腸菌群數(shù)相近，在此區(qū)間溫度對其生長基本無影響，當(dāng)溫度遠(yuǎn)離此區(qū)間時，總大腸菌群數(shù)逐漸降低，表明低溫或者高溫均抑制大腸菌群的生長。

2）酶底物法

以酶底物法檢測水樣分別在溫度為28、32、35、36、37、40℃下培養(yǎng)24 h后的檢測結(jié)果，如圖1-b所示。

結(jié)果表明，酶底物法與濾膜法檢測大腸菌群隨時間變化趨勢基本一致，不同培養(yǎng)溫度下的檢測結(jié)果存在差異。隨著培養(yǎng)溫度由35℃減小到28℃，D1-D6水樣的總大腸菌群數(shù)隨之降低，分別由41.9、18.5、8.1、45.4、<1、67.9 MPN·100 mL-1降低到20.8、2.0、1.0、17.1、<1、48.4 MPN·100 mL-1，差異明顯。而在35、36、37℃時總大腸菌群數(shù)基本無差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在40℃時，總大腸菌群相對35、36和37℃時的值偏小，36±1℃是大腸菌群的最佳培養(yǎng)溫度，實驗中為保證結(jié)果準(zhǔn)確需嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度在此范圍（辛生等，2015）。

綜合考慮，不同檢測方法對大腸菌群的最佳生長溫度36±1℃無影響。此溫度下大腸菌群酶的活性最高，生長代謝最快，然而當(dāng)培養(yǎng)溫度偏離時，會嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，因此檢測水樣時需嚴(yán)格控制溫度。

2.2? 時間對總大腸菌群的影響

對于濾膜法，分為初培養(yǎng)階段和驗證階段，初培養(yǎng)階段即本文所研究培養(yǎng)時間對大腸菌群影響階段，驗證階段培養(yǎng)時間為定量（24 h），酶底物法只需培養(yǎng)無需驗證。

1）濾膜法

濾膜法檢測總大腸菌群時的檢測結(jié)果如圖2-a所示。由圖2-a可知，不同初培養(yǎng)時間下大腸菌群總數(shù)不同，培養(yǎng)了16、18、20 h后，總大腸菌群數(shù)值與培養(yǎng)24 h時的總大腸菌群數(shù)（36 CFU·100 mL-1、16 CFU·100 mL-1、9 CFU·100 mL-1、47 CFU·100 mL-1、0、78 CFU·100 mL-1）相比明顯較低，可能是接種于培養(yǎng)基中的大腸菌群，未達(dá)到其生長周期，菌落未完全生成；在32 h時，菌落數(shù)降低，可能是培養(yǎng)時間較久，導(dǎo)致許多菌體衰老死亡，衰老死亡的菌體會使鏡檢呈破裂狀，影響檢測結(jié)果。在培養(yǎng)了22、24、28 h后，經(jīng)每2個檢測數(shù)據(jù)之間的對比，總大腸菌群基本無差異（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2）酶底物法

相比濾膜法，酶底物法操作無需在無菌環(huán)境下，增加了操作的簡便性，與濾膜法類似的是，不同培養(yǎng)時間仍是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，水樣在36℃下分別培養(yǎng)16、18、20、22、24、28、32 h，見圖2-b。

由圖2-b可看出，酶底物法檢測大腸菌群實驗結(jié)果隨培養(yǎng)時間的變化呈現(xiàn)波動趨勢，在培養(yǎng)時間分別為16、18、20、32 h時，檢測結(jié)果與培養(yǎng)24 h的檢測結(jié)果有明顯差異（P>0.05），而在培養(yǎng)時間分別為22、24、28 h時，檢測結(jié)果無明顯差異。培養(yǎng)32 h后檢測結(jié)果與22、24、28 h時差異明顯，可能是因為MMO MUG培養(yǎng)基中的抑制劑隨培養(yǎng)時間增加降低了抑制雜菌生長的效果，從而影響了檢測結(jié)果。因此酶底物法檢測總大腸菌群時，培養(yǎng)時間應(yīng)該控制在22～28 h，黃曉蓉（2018）、吳海鵬（2023）、逯南南等（2014）人的研究也得到此結(jié)果。

綜合考慮，2種方法下濾膜法的初培養(yǎng)時間或酶底物法的培養(yǎng)時間都應(yīng)控制在22～28 h內(nèi)，不足或者超出此范圍均影響實驗結(jié)果。使用濾膜法時不可提早或推遲鏡檢、驗證實驗，使用酶底物法時不可提早或推遲計算定量盤中顏色變化格數(shù)。

2.3? 質(zhì)量控制

2.3.1? 空白對照

檢測中，每批樣品對應(yīng)2個空白對照水樣，將空白對照水樣與接種水樣的培養(yǎng)基同時培養(yǎng)，以在36℃、培養(yǎng)24 h條件下的總大腸菌群結(jié)果為例，空白對照水樣結(jié)果如圖3所示。圖3-a為濾膜法實驗的空白對照，結(jié)果無大腸菌群生長；圖3-b為酶底物法實驗的空白對照，表明經(jīng)培養(yǎng)后定量盤無變色反應(yīng)，大腸菌群未檢出。因此2種檢測方法均表明，在一系列操作后培養(yǎng)基及器皿未被污染且操作無誤，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3.2? 質(zhì)控樣品結(jié)果

為了驗證整個檢測過程的準(zhǔn)確性，本文每批次樣品添加1個質(zhì)控樣（由CICC《中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心》購買）作為對照，由于2種方法的操作及計數(shù)單位不同，為了更直觀的反映檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，濾膜法和酶底物法采用2個不同的質(zhì)控樣品，編號分別為：CICC FTQC-75-06和CICC HJQC-003，培養(yǎng)溫度為36℃，檢測結(jié)果如表2所示。

實驗結(jié)果表明，2種方法下檢測結(jié)果均可信。濾膜法檢測結(jié)果為123 CFU·100 mL-1，雖與真值180 CFU·100 mL-1有差異，但在95%置信范圍71～460 CFU·100 mL-1內(nèi)；酶底物法的檢測結(jié)果雖與真值存在差異但也在95%置信范圍內(nèi)。2種方法均有效評價了隨著不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間總大腸菌群數(shù)的變化，此結(jié)果與徐莊艷（2022）研究成果一致。

3? 結(jié)論及建議

大腸菌群最適生長溫度為36±1℃，偏離此溫度區(qū)間菌株生長變緩，檢測結(jié)果偏小。使用濾膜法和酶底物法2種方法檢測大腸菌群，檢測結(jié)果隨溫度變化趨勢基本一致，檢測方法基本不會影響大腸菌群的最適培養(yǎng)溫度；2種檢測方法在培養(yǎng)時間為22～28 h時的檢測結(jié)果基本無差異，不足和超出此培養(yǎng)時間均會影響實驗結(jié)果。濾膜法、酶底物法檢測水中總大腸菌群時溫度和培養(yǎng)時間均為重要影響因素。

使用不同檢測方法對大腸菌群最適培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間無影響，而2種方法在檢測時各有優(yōu)缺點(diǎn)。濾膜法相對酶底物法雖檢測成本較低，但操作復(fù)雜，需進(jìn)行驗證試驗，檢測周期長，檢測效率較低，且微生物檢測對樣品時效性要求較高（采樣后2 h完成檢測），為滿足地下水環(huán)境監(jiān)測的需要，酶底物法更適用當(dāng)前環(huán)境下的水樣檢測。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，被污染區(qū)域的風(fēng)險可能會加大，地下水中大腸菌群數(shù)量、種類也會發(fā)生變化，為了更高效的檢測與分析，水質(zhì)總大腸菌群檢測新方法的研究勢在必行。且對地表水甚至污水等大腸菌群濃度較高、種類較多的水樣的分析，將是我們下一步研究的內(nèi)容。

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收稿日期：2023-04-21；修回日期：2023-07-12

基金項目：北京市監(jiān)測網(wǎng)運(yùn)行項目（2022年）資助

作者簡介：王璞玉（1993- ），女，碩士，工程師，主要從事水質(zhì)檢測及分析工作。E-mail：w1335280494@163.com

引用格式：王璞玉，2023.溫度、時間對不同方法檢測地下水中總大腸菌群的影響［J］.城市地質(zhì)，18（4）：113-118