張衛(wèi)鋼，汪 磊，毛嘉玥，張 杰，陳雨晴，董明慧，李 曙，王 林

（皖南醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是常見的癡呆類型，其主要臨床表現是學習和記憶等能力進行性喪失。AD 的典型病理性特征是老年斑（由淀粉樣蛋白Aβ 沉積形成）和神經原纖維纏結（由過度磷酸化的τ 蛋白聚集形成）［1］。除此之外，神經炎癥在AD 的發(fā)展進程中有著重要的作用［2］。在AD 患者腦組織中可觀察到小膠質細胞過度激活、老年斑周圍聚集大量促炎細胞因子，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等；同時AD患者的血漿中促炎細胞因子表達水平也升高［3］。AD病程的進展會隨著炎癥反應而加快，及時防治炎癥可作為AD 的一種前瞻性治療方法［4］。

異常聚集的Aβ和τ蛋白可促進神經炎癥。自噬的主要功能是清除異常聚集的蛋白質［5］；在AD 患者、AD 轉基因鼠和細胞模型中均觀察到自噬水平的降低可誘導炎癥反應、Aβ和τ蛋白異常聚集；自噬途徑和自噬相關蛋白在炎癥的調節(jié)中起著核心作用［6］。轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）在自噬進程中有著重要的作用，它可調節(jié)自噬體的形成、自噬體和溶酶體的融合以及溶酶體的生成和功能的正常發(fā)揮［7］。TFEB 在中樞神經系統(tǒng)中普遍表達，在神經元和膠質細胞中都有活性。在AD 患者的腦部中檢測到細胞核中的TFEB 蛋白水平表達下降；在AD 模型鼠中，TFEB 激活后通過自噬溶酶體系統(tǒng)加速淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的降解和減少Aβ 的產生［8］。TFEB 還可通過自噬溶酶體途徑降解腦組織中的炎癥小體和促炎細胞因子從而改善神經炎癥。因此，TFEB 有望成為調控自噬和神經炎癥的治療靶標。

在不同AD 轉基因鼠中，TFEB 的基因修飾已顯示出神經保護作用，研究TFEB 激動劑在AD 中的作用將為新藥開發(fā)提供依據［9］。番茄素（tomatidine，TA）是一種來源于茄科的甾體生物堿。番茄素通過增加抗氧化酶活性和減少細胞凋亡來消除氧化應激［10］。有研究報道番茄素可促進哺乳動物細胞或線蟲中的自噬體的降解［11］；N2a 細胞經氧糖剝奪/復氧損傷后，給予番茄素處理后TFEB 的活性增加，可促進溶酶體降解并減輕細胞損傷［12］。但是番茄素在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的神經炎癥中的作用及機制尚未見報道。因此，本研究采用LPS 處理人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y 細胞），模擬細胞水平的神經炎癥模型，探究番茄素神經保護的可能機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

SH-SY5Y 細胞購買于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號為CL-0208。

2 主要試劑和儀器

LPS 和番茄素購自MedChemExpress；兔抗TFEB多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗Ser142 位點磷酸化TFEB（p-TFEB）多克隆抗體購自Affinity；兔抗P62、LC3 和cleaved caspase-3 多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗β-actin 單克隆抗體、CCK-8 試劑盒等試劑均購自碧云天生物技術有限公司；Trizol、RNA 反轉錄試劑盒等均購自Vazyme；TNF-α 和IL-1β 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。SDS-PAGE 電泳儀及成像分析儀購自Bio-Rad （型號：ChemiDoc）；流式分析儀購自BD（型號：Accuri）；激光共聚焦顯微鏡購自Leica（型號為SP8）。

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細胞復蘇后用含有100 U/mL 青霉素、10 μg/mL 鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO?培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，待細胞增殖至融合度約80%左右時，用0.25%胰酶消化傳代至另一培養(yǎng)瓶中，通過倒置光學顯微鏡觀察細胞的生長增殖，待細胞狀況穩(wěn)定后用于后續(xù)實驗。

3.2 細胞分組及給藥 先觀察不同濃度（1.25、2.5、5 和10 μg/mL）的LPS 對細胞活力和TFEB 活性的影響，并確定本研究的LPS 濃度為5 μg/mL。再觀察不同濃度（1、5 和10 μmol/L）的番茄素對細胞活力和TFEB 活性的影響，結合相關文獻確定用于本研究的番茄素濃度為5 μmol/L［13］。將SH-SY5Y 細胞分為對照（control，CON）組、LPS 組和LPS+TA 組。參考相關文獻在LPS 組中加入5 μg/mL LPS 處理24 h，建立炎癥模型［14］，LPS+TA 組先加入5 μmol/L 番茄素處理24 h后再加入5 μg/mL LPS共培養(yǎng)24 h。

3.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將SH-SY5Y 細胞懸浮液以適當密度種入96 孔板，同時設置空白對照組和正常對照組，細胞貼壁后進行相應處理，LPS 處理24 h，番茄素處理48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀測量450 nm 波長下不同組別的吸光度（A）并算出細胞活力。

3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 按凋亡試劑盒說明書，根據實驗需求，將SH-SY5Y細胞處理完成后用不含EDTA的胰酶消化，停止消化后用PBS溫和清洗細胞2 次，離心5 min，收集1×105～5×105個細胞，加入500 μL 試劑盒內緩沖液輕輕吹打混勻成單細胞懸液，再依序加入annexin V-FITC 試劑和PI 試劑各5 μL，吹打混勻，室溫、避光反應5～10 min，隨后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率，時間控制在1 h內。

3.5 Western blot 檢測蛋白水平 根據不同實驗需求，細胞處理完成后，去掉培養(yǎng)上清液，PBS 溫和清洗細胞2次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，靜置20 min，使細胞充分裂解，收集細胞至EP 管，4 ℃、10 000×g離心20 min，棄沉淀留上清液，用BCA 法測定蛋白質濃度。根據不同目的蛋白分子量配制10%或12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣蛋白量為30 μg，電泳分離蛋白質后，采用濕式轉移法轉移到NC 膜。5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入1∶1 000 稀釋的兔抗TFEB、p-TFEB、P62、LC3 和β-actin 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，次日TBST清洗3次，每次10 min，清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG（1∶1 000），室溫搖床孵育1 h，再用TBST 清洗3次，每次10 min。洗膜后用ECL 化學發(fā)光液和凝膠成像分析儀曝光條帶，ImageJ 軟件定量分析蛋白灰度值，目的蛋白與內參照β-actin 之比代表蛋白相對表達量。

3.6 RT-qPCR 法檢測mRNA 表達水平 使用Trizol試劑提取預處理后的細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。以cDNA 為轉錄模板，每孔取2 μL 加入八聯管中，再加上、下游引物（序列見表1）各0.4 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，DEPC 水7.2 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。根據產物的熔解曲線得到Ct 值，計算炎癥因子mRNA的相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.7 免疫熒光檢測 各組細胞干預完成后，吸出培養(yǎng)基，沿著孔壁緩慢注入PBS 清洗，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min，1% Triton-PBS清洗3次；免疫染色通透液破膜30 min，1% Triton-PBS清洗3次；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入免疫染色稀釋液配制的Ⅰ抗（TFEB抗體，1∶200；cleaved caspase-3抗體，1∶250），4 ℃孵育過夜；1% Triton-PBS 清洗3 次，清洗后用3%牛血清白蛋白配制的Ⅱ抗（1∶500）室溫避光孵育1 h，1% Triton-PBS 清洗后加入DAPI 染色液37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗后滴加適量抗熒光淬滅封片液于載玻片，采用激光共聚焦顯微鏡拍照。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理數據。數據用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯性差異法（LSD 法）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LPS對細胞炎癥反應和凋亡的影響

不同濃度的LPS（1.25、2.5、5 和10 μg/mL）處理細胞24 h。CCK-8 實驗結果表明，與CON 組相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 的LPS 使細胞活力顯著下降（P＜0.05），見圖1A。分別采用2.5 和5 μg/mL 的LPS 孵育細胞24 h，RT-qPCR 結果顯示，與CON 組相比，IL-1β mRNA 水平在LPS 濃度為2.5 和5 μg/mL 組中均顯著上升（P＜0.05），TNF-α mRNA 水平只在LPS 濃度為5 μg/mL 組中表達顯著上升（P＜0.05），見圖1B。流式細胞儀檢測結果顯示，2.5 和5 μg/mL 的LPS 引起細胞凋亡的數量顯著增加（P＜0.01），見圖1C。免疫熒光染色檢測結果表明，與CON 組相比較，cleaved caspase-3 表達水平在2.5 和5 μg/mL LPS 組中顯著上升（P＜0.05），見圖1D。

Figure 1. Effects of LPS on the inflammatory response and apoptosis of cells. A： the CCK-8 assay was used to measure the viability of SH-SY5Y cells after LPS treatment； B： RT-qPCR was conducted to detect TNF-α and IL-1β mRNA levels in SH-SY5Y cells after LPS treatment； C： flow cytometry was performed to measure the apoptosis of SH-SY5Y cells after LPS treatment；D： representative cleaved caspase-3 fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents cleaved caspase-3，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖1 LPS對SH-SY5Y細胞炎癥反應和凋亡的影響

2 LPS對細胞自噬和TFEB活性的影響

Western blot 實驗結果顯示，與CON 組相比，5 μg/mL LPS 處理組P62、LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達水平均顯著下降（P＜0.05），但是p-TFEB 表達水平顯著上升（P＜0.01）；2.5 μg/mL LPS 雖引起P62、LC3-II/I和TFEB 表達水平下降但無統(tǒng)計學意義，見圖2A。免疫熒光染色結果顯示，TFEB 在5 μg/mL LPS 處理組只定位在胞質中（圖2B）。綜合以上實驗結果，本研究選擇5 μg/mL的LPS濃度作為后續(xù)實驗條件。

Figure 2. Effects of LPS on the autophagy and TFEB activity of SH-SY5Y cells. A： Western blot was performed to detect P62，LC3，TFEB and p-TFEB protein levels； B： representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group（green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=25 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖2 LPS對SH-SY5Y細胞自噬和TFEB活性的影響

3 番茄素對TFEB的表達和定位的影響

分別用1、5 和10 μmol/L 的番茄素處理細胞48 h。CCK-8 結果表明，1、5 和10 μmol/L 的番茄素對細胞的活力無顯著影響（圖3A）。Western blot 實驗結果顯示，與CON 組相比，5 μmol/L 番茄素處理組，TFEB 表達水平顯著上升（P＜0.01），但p-TFEB 的表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖3B。免疫熒光染色結果顯示，與CON 組相比，5 μmol/L 番茄素處理后TFEB主要定位于細胞核中（圖3C）。

Figure 3. Effect of tomatidine （TA） on the expression and localization of TFEB. A： the CCK-8 assay was used to measure the viability of SH-SY5Y cells after tomatidine treatment； B： Western blot was used to detect TFEB and p-TFEB protein levels； C：representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=25 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group.圖3 番茄素對TFEB的表達和定位的影響

4 番茄素對LPS 處理的細胞TFEB 和自噬功能的影響

Western blot 實驗結果表明，與CON 組比，LPS 組中P62 表達水平下降但差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.19），LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達水平顯著下降（P＜0.05），而p-TFEB 表達水平顯著上升（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS+TA 組中P62 有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.08），p-TFEB 表達水平顯著下降（P＜0.01），而LC3-II/LC3-I 和TFEB 表達水平顯著上升（P＜0.05），見圖4A。免疫熒光染色結果顯示，與CON 組相比，TFEB 在LPS 組中主要定位于胞質，而在LPS+TA組中則易位到細胞核中，見圖4B。

Figure 4. Effects of tomatidine（TA） on TFEB and autophagy in LPS-treated SH-SY5Y cells. A： Western blot was used to detect P62，LC3，TFEB and p-TFEB protein levels； B： representative TFEB fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents TFEB，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs CON group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖4 番茄素對LPS處理的SH-SY5Y細胞TFEB表達和自噬功能的影響

5 番茄素對LPS 處理的細胞炎癥反應和細胞凋亡的影響

RT-qPCR 結果表明，與CON 組相比，IL-1β 和TNF-α mRNA 表達水平在LPS 組中顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組中IL-1β mRNA 表達有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.16），TNFα mRNA 表達顯著下降（P＜0.01），見圖5A。流式細胞儀檢測結果顯示，與CON 組相比，LPS 組細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組細胞凋亡率顯著下降（P＜0.01），見圖5B。免疫熒光染色結果顯示，與CON組相比，LPS組cleaved caspase-3表達顯著上升（P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+TA 組cleaved caspase-3表達顯著下降（P＜0.01），見圖5C。

Figure 5. Effects of tomatidine （TA） on inflammatory response and apoptosis in LPS-treated SH-SY5Y cells. A： RT-qPCR was used to detect TNF-α and IL-1β mRNA levels in SH-SY5Y cells； B： flow cytometry was used to measure the apoptosis of SHSY5Y cells； C： representative cleaved caspase-3 fluorescence staining images of SH-SY5Y cells in each group （green represents cleaved caspase-3，and blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs CON group； ##P＜0.01 vs LPS group.圖5 番茄素對LPS處理的SH-SY5Y細胞炎癥反應和細胞凋亡的影響

討 論

神經炎癥可通過不同的方式誘導，其中LPS 誘導是常見的。LPS存在于革蘭氏陰性菌外膜中，其主要受體是Toll 樣受體，從而促進多種炎癥介質的表達和神經退行性疾病的發(fā)展。本研究同樣利用LPS處理SH-SY5Y 細胞模擬細胞神經炎癥的微環(huán)境，探討在細胞水平上番茄素能否發(fā)揮神經保護作用。與以往實驗結果一致，本研究結果也顯示LPS 可引起炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA 表達水平和促凋亡蛋白cleaved caspase-3 的表達水平顯著上升，凋亡細胞的數量也顯著增多。番茄素主要存在于未成熟的綠色番茄的皮中，已被證明是耐藥腫瘤細胞的化學增敏劑，可抑制肺癌、肝癌、結腸癌細胞的增殖和侵襲；番茄素還有抗炎、抗氧化、抑制病毒傳播和保護心臟等功能［15］。有研究報道，在谷氨酸、雙氧水處理的SH-SY5Y 細胞中，番茄素具有一定的神經保護作用［16］，但番茄素能否在神經炎癥中發(fā)揮保護作用尚未見報道。本研究結果顯示給予番茄素處理后，SHSY5Y 細胞炎癥因子的表達水平顯著降低，凋亡細胞數量顯著減少；該結果初步證明在LPS 處理的SHSY5Y 細胞中，番茄素具有一定神經保護作用，但其具體機制尚不明確。

TFEB 包含基本的螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結構域（bHLHZip），通過與靶基因E-box （CANNTG）啟動子元件緊密結合來調控靶基因的表達，從而參與溶酶體生物發(fā)生、自噬調節(jié)和應激適應等細胞過程［17］。在TFEB敲除小鼠腦組織中觀察到Aβ沉積和磷酸化τ 蛋白的積累；在AD 小鼠模型中，TFEB 的過表達增強了對細胞脂滴和受損線粒體的降解［18］。但目前關于TFEB 在神經炎癥中的作用尚無報道，本研究結果顯示，在SH-SY5Y 細胞中，LPS 誘導TFEB 的表達水平顯著降低，該結果表明細胞的神經炎癥可降低TFEB 的表達。在缺血缺氧損傷的小鼠神經母細胞瘤N2A 細胞中，番茄素促進TFEB 入核和TFEB表達水平增加。與其結果一致，本研究中給予番茄素處理后，TFEB 的表達水平顯著增加。生理情況下TFEB 主要位于胞質中，當饑餓或受刺激時TFEB 快速轉移到細胞核并增強其有關靶基因的轉錄和靶蛋白的表達水平［19］。翻譯后修飾調控TFEB 的亞細胞定位，磷酸化是調控TFEB 活性的中心驅動因素，去磷酸化后TFEB 從胞質易位至胞核［20］。本研究中，SH-SY5Y 細胞給予LPS 處理后p-TFEB 表達水平顯著上升，TFEB 主要定位于胞質中；而番茄素處理后，p-TFEB 表達水平顯著降低，TFEB 從胞質易位至胞核增強自噬功能。本實驗結果證明在LPS 處理的SH-SY5Y 細胞中，番茄素可促進TFEB 的表達和核移位。

TFEB 可參與自噬體形成和自噬溶酶體降解，TFEB 表達水平降低雖引起自噬功能障礙［21］，但是要明確具體哪一過程異常須結合自噬其他指標的變化來判定。LC3 是目前認可度最高的自噬標志物，貫穿于自噬體從形成到成熟的各個階段；自噬初始階段受到抑制，可降低自噬體的形成和LC3-II 分子的表達水平［22］。本研究的結果顯示，給予LPS 處理后，LC3-II/LC3-I 表達水平顯著下降，初步證實LPS 抑制自噬體的形成。自噬是一個動態(tài)的過程，單檢測LC3-II/LC3-I 的表達水平無法完全充分反映細胞內的自噬狀態(tài)。P62 是另一個常用的自噬標志物，P62和LC3-II/LC3-I 表達水平的變化可反映自噬通量的改變。在自噬過程中，P62與泛素化的蛋白質結合后與LC3-Ⅱ相互作用，靶向自噬體最終在自噬溶酶體內降解；當自噬體形成受抑制或溶酶體功能受損時，P62 會在胞質中逐漸累積［23］。P62 的活性受到磷酸化、乙?；刃揎椀恼{節(jié)［24］。在AD 患者腦中檢測出P62蛋白水平的低表達，敲除P62抑制自噬功能會導致Aβ 積累、τ 蛋白過度磷酸化和神經退行性變［25］。本研究中初步證實LPS 抑制自噬體的形成，但實驗結果卻顯示LPS處理后的P62的表達水平顯著下降。已有大量文獻報道LPS 會導致腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性下降，而AMPK 可通過磷酸化水平調控P62 的表達［26］。本課題組其他實驗結果也證實，在細胞水平上LPS 降低AMPK 的活性；因此，我們猜測在LPS 處理SHSY5Y 細胞中，P62 的表達水平顯著下降是可能由于AMPK 活性降低引起，具體機制需要進一步驗證。在LPS 處理的SH-SY5Y 細胞中，給予番茄素處理后LC3-II/LC3-I 表達水平顯著上升，而P62 表達水平雖降低但差異無統(tǒng)計學意義，該實驗結果初步表明在SH-SY5Y細胞中番茄素可促進自噬體的形成。

在AD 發(fā)生發(fā)展過程中，自噬、神經炎癥和蛋白質異常聚集相互影響［27］。有研究報道AD 患者顳葉皮質中自噬蛋白P62和LC3陽性囊泡增加，與炎癥小體、Aβ和過度磷酸化τ蛋白共定位，這可能是因為炎癥小體的產生促進神經炎癥，從而降低自噬功能，導致AD 患者顳葉處蛋白異常聚集［28］。自噬功能的增強可促進炎癥因子的降解，抑制神經炎癥和發(fā)揮神經保護的作用。在本研究中，LPS引起炎癥因子表達水平增加，自噬體形成受到抑制；給予番茄素處理后增強自噬體的形成，促進炎癥因子的降解。番茄素促進炎癥因子的降解能否改善神經炎癥引起細胞凋亡，本研究中檢測細胞凋亡蛋白cleaved caspase-3 的表達水平和細胞凋亡數量的變化，實驗結果顯示番茄素處理后cleaved caspase-3 表達水平和凋亡細胞數量均減少。以上結果可表明番茄素可增強自噬功能，促進炎癥因子的降解，從而減少SH-SY5Y 細胞凋亡。

綜上所述，我們的研究結果顯示，在細胞水平上，番茄素增強TFEB 表達并促進其入核，改善LPS引起的細胞自噬功能障礙和凋亡，從而發(fā)揮神經保護作用。但是本研究結果僅在細胞水平上有驗證，該機制是否在動物水平有效仍需進一步研究。