陳家琛，吳聽(tīng)雨，夏偉梁

0 引言

肺癌是當(dāng)今危害極大的癌癥之一，其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）[1]。NSCLC常見(jiàn)的基因突變有EGFR突變、ROS1融合、RET融合、ALK易位、MET剪接位點(diǎn)突變、ERBB2突變和BRAF突變等[2]。EGFR突變是肺腺癌中最常見(jiàn)的突變類(lèi)型，約占10%[3]。EGFR突變患者使用酪氨酸激酶抑制劑通常能顯著延長(zhǎng)患者的生存期，大大改善預(yù)后。然而，治療后仍不可避免地產(chǎn)生耐藥性[4]，因此對(duì)靶向治療機(jī)制的進(jìn)一步探究顯得尤為重要。

細(xì)胞焦亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，通常是通過(guò)切割GSDM（gasdermin）家族蛋白后形成N端游離的肽段，這一肽段會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞形成孔道并導(dǎo)致細(xì)胞破裂，從而釋放胞質(zhì)成分[5]。許多研究證明細(xì)胞焦亡與腫瘤治療關(guān)系密切，然而對(duì)于腫瘤發(fā)展的影響尚存在爭(zhēng)議[6]。鮮有研究關(guān)注非小細(xì)胞肺癌中靶向藥物與焦亡的關(guān)系、不同EGFR突變對(duì)靶向治療的不同響應(yīng)是否與其產(chǎn)生的細(xì)胞死亡方式有關(guān)。因此，本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌不同EGFR突變體中靶向藥物治療與細(xì)胞焦亡之間的關(guān)系，并評(píng)估其在提高療效中的作用，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路，以進(jìn)一步提高患者的生存率和生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人肺癌A549細(xì)胞、鼠肺癌Lewis（LLC）細(xì)胞（中科院細(xì)胞所）；培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司； 特級(jí)胎牛血清（烏拉圭）購(gòu)自上海雅酶生物公司；高糖DMEM、MEM和PBS均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；無(wú)血清凍存液、5×蛋白上樣緩沖液、RIPA強(qiáng)裂解液、PMSF裂解液、10% SDS、Tris-鹽酸緩沖液、PAGE膠凝固劑、促凝劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光顯色液均購(gòu)自上海雅酶生物公司；AKT抗體（4060S）、Caspase-3（9662S）、ERK抗體（12950S）、GSDMD（69469S）和GSDME（19453S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH、β-actin和β-Tubulin均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液及相關(guān)蛋白酶抑制劑使其充分裂解，并用BCA溶液進(jìn)行蛋白濃度定量檢測(cè)，以便后續(xù)進(jìn)行電泳上樣體積確定。將配置好的蛋白樣品加入PAGE凝膠后按120 V進(jìn)行80 min電泳。電泳結(jié)束后300 mA 90 min轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用高蛋白奶粉，TBST緩沖液配制成5%的封閉液封閉60 min，一抗溶液中孵育過(guò)夜。次日經(jīng)TBST溶液洗滌后于相應(yīng)二抗溶液中孵育1 h。最后采用化學(xué)發(fā)光儀器進(jìn)行目的蛋白顯像。

1.2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建 將需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的細(xì)胞鋪到96孔板中，每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種。待細(xì)胞貼壁后，以含慢病毒的培養(yǎng)液（2倍濃度梯度稀釋的慢病毒）培養(yǎng)細(xì)胞（感染復(fù)數(shù)MOI=慢病毒體積×慢病毒滴度/細(xì)胞數(shù)量）。根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的MOI值，使用慢病毒轉(zhuǎn)染目標(biāo)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染慢病毒12 h后需更換新的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。換液48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察樣孔中細(xì)胞狀態(tài)和帶熒光細(xì)胞比例。最后通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定抗生素來(lái)篩選和傳代細(xì)胞一周以上。而后將細(xì)胞接種到12孔板中，收集蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.3 乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn) 在96孔板中每孔鋪3 000～5 000個(gè)細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)孔周?chē)訚M(mǎn)PBS緩沖液，防止水分蒸發(fā)造成實(shí)驗(yàn)誤差）。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度，進(jìn)行藥物處理。實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間結(jié)束后，細(xì)胞在含有0.04% Triton X-100、2 mmol/L HEPES和0.01%BSA（pH7.5）裂解緩沖液中裂解15 min，而后用50 μl細(xì)胞裂解液與含0.34 mmol/L NADH和2.5 mmol/L丙酮酸鈉的500 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.5）150 μl混合。孵育30 min后，在酶標(biāo)儀上用吸光度340 nm監(jiān)測(cè)變化90 s以上。將獲得的實(shí)驗(yàn)組LDH值與對(duì)照組中測(cè)定的LDH值進(jìn)行歸一化，計(jì)算細(xì)胞存活百分比。

1.2.4 小鼠皮下腫瘤模型構(gòu)建 提前一周購(gòu)買(mǎi)5周齡SPF級(jí)雄性C57/BL6小黑鼠，并在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。每只小鼠接種100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，種植體積50 μl。第二天觀(guān)察小鼠狀態(tài)。后續(xù)每隔兩天觀(guān)察一次小鼠狀態(tài)和皮下瘤形成情況。待皮下成瘤后，對(duì)小鼠隨機(jī)分組，按照實(shí)驗(yàn)安排對(duì)小鼠進(jìn)行給藥處理。給藥方式為灌胃給藥（奧希替尼：25 mg/kg，3次/周）， 藥物配方：5% DMSO+40%PEG300+5% Tween-80+50% 0.9%氯化鈉溶液（配制成5 mg/ml奧希替尼）。每天觀(guān)察小鼠狀態(tài)。待皮下腫瘤成瘤后，每隔兩天記錄小鼠體重變化，測(cè)量腫瘤大?。╒=0.5×長(zhǎng)度×寬度2）。

1.2.5 細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè) 在96孔板中每孔鋪3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至合適密度，進(jìn)行轉(zhuǎn)染或藥物等處理。實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間結(jié)束后，將CCK-8試劑和新鮮培養(yǎng)液按照1:9比例稀釋后加入96孔板中，每孔100 μl，而后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育0.5～3 h，孵育1 h后在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 收集血樣后，室溫放置30 min使其自然凝固后，2 000 r/min，離心20 min，收集上清液，配制標(biāo)準(zhǔn)品后點(diǎn)板，酶標(biāo)板貼上封板膜，室溫反應(yīng)2 h，撕開(kāi)封板膜，用洗滌緩沖液400 μl洗4遍。充分去除洗滌緩沖液后將試劑盒中的酶標(biāo)目的檢測(cè)抗體工作液加入到每個(gè)樣孔中，每孔200 μl。將酶標(biāo)板貼上封板膜，室溫反應(yīng)2 h。撕開(kāi)酶標(biāo)板加上封板膜，洗滌緩沖液將所有樣孔洗4 遍，每遍1 min。配置底物反應(yīng)液，加入洗好后的酶標(biāo)板樣孔中，每孔200 μl。在酶標(biāo)板樣孔中加入50 μl終止反應(yīng)液，樣孔中的顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，完成上述步驟后30 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Adobe InDesign軟件排圖。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組數(shù)據(jù)組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建EGFR野生、突變細(xì)胞模型

為了在體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型中模擬臨床上EGFR突變患者對(duì)于EFGR-TKIs療法的響應(yīng)程度，選擇在鼠源細(xì)胞系LLC中導(dǎo)入人源EGFR突變序列，最終構(gòu)建EGFR突變細(xì)胞模型，并設(shè)定了以下實(shí)驗(yàn)組：EV、EGFR-WT、L858R、T790M、19Del和20ins。細(xì)胞系構(gòu)建完成后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中EGFR的表達(dá)都遠(yuǎn)高于未導(dǎo)入的細(xì)胞株的水平，且根據(jù)L858R突變抗體進(jìn)一步驗(yàn)證了EGFR-L858R突變的成功導(dǎo)入。EGFR的相關(guān)下游通路，如pERK被不同程度激活，pAKT在L858R及T790M中被一定程度激活，這也輔助驗(yàn)證了EGFR突變構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1A。本研究還驗(yàn)證了構(gòu)建好的細(xì)胞系增殖水平，見(jiàn)圖1B，可以看到相比EV組，構(gòu)建的EGFR突變穩(wěn)轉(zhuǎn)株的細(xì)胞增殖水平略有提高，這可能是導(dǎo)入EGFR突變后增加了腫瘤細(xì)胞的惡性程度。

圖1 構(gòu)建LLC細(xì)胞系的EGFR野生、突變穩(wěn)轉(zhuǎn)株Figure 1 Establishment of LLC cell lines stably express EGFR-WT and EGFR-mutated

2.2 奧希替尼處理EGFR特定突變細(xì)胞模型

首先我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行72 h藥物處理，CCK-8測(cè)定EGFR穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)奧希替尼的響應(yīng)度，圖2A中可以觀(guān)察到，相比EV組，其他突變穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)藥物的敏感度都有所提高，并確定后續(xù)用藥濃度為1 μmol/ml。在藥物處理組中部分細(xì)胞形態(tài)腫大，膜被明顯破壞，符合發(fā)生焦亡時(shí)的表型，尤其是在L858R以及T790M中這一現(xiàn)象尤為明顯，見(jiàn)圖2B。因此我們推測(cè)EGFR-L855R、EGFRT790M、EGFR-19del突變細(xì)胞株在藥物處理后發(fā)生的細(xì)胞死亡方式里包括焦亡。

圖2 構(gòu)建的EGFR野生、突變穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)Osimertinib(1 μmol/ml)的藥物敏感度Figure 2 Sensitivity of wild-type and mutated EGFR LLC cell lines to osimertinib (1 μmol/ml)

因此我們對(duì)細(xì)胞繼續(xù)用藥物處理72 h后采樣測(cè)定其LDH釋放水平，見(jiàn)圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理72 h后，在EGFR-T790M和EGFR-L858R突變細(xì)胞株中都發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的LDH釋放（P=0.039、P=0.0013）。

圖3 LLC細(xì)胞經(jīng)Osimertinib(1μmol/ml)處理72h后LDH釋放水平Figure 3 Levels of LDH released in LLC cells treated with osimertinib (1 μmol/ml) for 72 h

2.3 TKI靶向藥物處理后可發(fā)生GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

細(xì)胞形態(tài)和LDH測(cè)定的結(jié)果，讓我們推斷經(jīng)過(guò)TKI處理后，EGFR-L858R以及EGFR-T790M可能發(fā)生了細(xì)胞焦亡。鑒于臨床上，EGFR-L858R突變患者比例較大，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們主要關(guān)注在EGFR-L858R突變上。后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在接受藥物處理的L858R突變株中觀(guān)察到明顯的GSDME蛋白切割，見(jiàn)圖4A。對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行量化，可以看到接受藥物處理的L858R細(xì)胞株中，GSDME-N（圖4B）以及cleaved Caspase-3（圖4C）的蛋白水平顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.0001）。

圖4 1μmol/ml Osimertinib處理72h后對(duì)LLC-EGFR-L858R蛋白水平的影響Figure 4 Effect of 72-hour treatment with osimertinib (1 μmol/ml) on the protein levels of LLC-EGFR-L858R

2.4 過(guò)表達(dá)GSDME后奧希替尼對(duì)腫瘤的抑制提高

通過(guò)結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證沉默GSDME及過(guò)表達(dá)GSDME后TKI的處理結(jié)果。經(jīng)過(guò)1 μmol/ml的奧希替尼處理72 h，可以看到通過(guò)沉默GSDME在很大程度上遏制了TKI的治療水平，另外過(guò)表達(dá)GSDME也在一定程度提高了細(xì)胞焦亡的程度，因此經(jīng)過(guò)藥物處理后GSDME-OE組細(xì)胞數(shù)量顯著低于其他兩組（P=0.0486;P=0.0284），見(jiàn)圖5。

圖5 GSDME表達(dá)水平對(duì)奧希替尼處理效果的影響Figure 5 Effect of GSDME expression levels on osimertinib treatment

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤抑制水平

選用C57/BL6小鼠進(jìn)行皮下腫瘤細(xì)胞模型的構(gòu)建，選擇構(gòu)建好的LLC穩(wěn)轉(zhuǎn)株。實(shí)驗(yàn)共計(jì)分為五組即WT（-）、WT（+）、L858R（-）、L858R（+）、L858R-GSDME-OE（+）。每組四只，每只小鼠分別注射特定腫瘤細(xì)胞數(shù)量為5×105。在注射腫瘤細(xì)胞五天后開(kāi)始給藥，并持續(xù)記錄小鼠體重和腫瘤大小。其中小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖6A、B，可以看到使用我們選擇的藥物濃度不影響小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育，從腫瘤大小和Ki-67表達(dá)水平可看出，L858R（+）和L8585RGSDME-OE（+）這兩組的效果較好，有效抑制了腫瘤的增殖，見(jiàn)圖6C和6D。

圖6 GSDME過(guò)表達(dá)可有效提高奧希替尼對(duì)小鼠的治療效果Figure 6 Overexpression of GSDME enhanced therapeutic efficacy of osimertinib on mice

2.6 奧希替尼處理后產(chǎn)生的細(xì)胞焦亡與腫瘤免疫治療的潛在聯(lián)系

L858R及L858R-GSDME-OE小鼠體內(nèi)的IL-1β水平遠(yuǎn)高于其他對(duì)照組，這有利于免疫細(xì)胞的募集。L858R處理組和未處理組相比，IL-18的水平經(jīng)過(guò)藥物處理后降低（P＜0.0001），見(jiàn)圖7。

圖7 奧希替尼治療后小鼠體內(nèi)IL-1β和IL-18水平Figure 7 Levels of IL-1β and IL-18 in mice after osimertinib treatment

3 討論

肺癌的治療方式越來(lái)越多，但死亡率仍居高不下，每年約造成176萬(wàn)人死亡[7]。值得注意的是，中國(guó)每年約有63.1萬(wàn)人死于肺癌[8]，且肺癌發(fā)生率逐年攀升。臨床上，常用的酪氨酸激酶抑制劑雖然顯著改善了預(yù)后，但耐藥性的出現(xiàn)仍是棘手的問(wèn)題。在已有的基礎(chǔ)上解決耐藥或者探索新的治療方式是臨床上的趨勢(shì)。本研究基于臨床現(xiàn)狀[9]，構(gòu)建了EGFR-EV、EGFRWT、EGFR-L858R、EGFR-T790M、EGFR Exon19del（Del_746-751）、EGFR Exon20ins（D770_N771＞ASVDN）突變細(xì)胞株。EGFR基因中最常見(jiàn)的突變：外顯子19缺失以及外顯子21的Leu858Arg（L858R）點(diǎn)突變，這兩個(gè)突變約占所有EGFR突變的45%[10]。2017年邵峰團(tuán)隊(duì)的研究[11]發(fā)現(xiàn)化療藥物可以引發(fā)GSDME主導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。為了觀(guān)察焦亡現(xiàn)象，我們常用的方法是觀(guān)察經(jīng)過(guò)處理后的細(xì)胞形態(tài)以及LDH的釋放水平。本研究結(jié)果顯示，與其他突變相比，L858R突變的細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞焦亡而死亡，并且提高焦亡水平可以進(jìn)一步增強(qiáng)奧希替尼的治療效果。

由于細(xì)胞焦亡是一個(gè)比較新的概念，很多治療方式是否造成焦亡往往容易被忽略。本研究發(fā)現(xiàn)，由于EGFR-L858R細(xì)胞株經(jīng)藥物處理后以焦亡為主要細(xì)胞死亡方式，由此推測(cè)藥物對(duì)腫瘤的抑制效果與焦亡的發(fā)生程度相當(dāng)。通過(guò)過(guò)表達(dá)介導(dǎo)焦亡發(fā)生的GSDME基因，本研究成功實(shí)現(xiàn)了提高焦亡水平的可能。細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)GSDME后，藥物處理效果都顯著高于普通的EGFR-L858R細(xì)胞株。臨床上雖然不能通過(guò)調(diào)控焦亡的程度來(lái)提高治療水平，但可以在患者的篩選中發(fā)現(xiàn)更易發(fā)生焦亡的肺癌患者，更好地設(shè)計(jì)治療方案。

臨床上，已經(jīng)有許多治療方案將TKI治療和免疫治療聯(lián)用并取得一定的效果，但并非所有患者都能從這種聯(lián)合治療中受益，且毒性發(fā)生率相對(duì)較高[12]。目前關(guān)于焦亡的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡通常會(huì)伴隨炎性因子的大量釋放，如IL-1β以及IL-18[13]，本研究通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)藥物處理后的小鼠血液中IL-1β水平提高，IL-18水平下降。有研究表明IL-1β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟和單核細(xì)胞分化為DC和炎性巨噬細(xì)胞[13]。IL-18可以促進(jìn)Th2反應(yīng)和血管生成。這意味著在沒(méi)有其他細(xì)胞因子的情況下，腫瘤細(xì)胞中的遷移和侵襲增加，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境更加惡性[14]。因此，我們推測(cè)經(jīng)過(guò)TKI靶向治療后，腫瘤細(xì)胞焦亡釋放大量炎性因子，引發(fā)強(qiáng)烈的不良反應(yīng)。最終，這對(duì)腫瘤免疫可能起到了正向調(diào)節(jié)作用。鑒于焦亡對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響尚未明確，該部分研究有待進(jìn)一步開(kāi)展，但深挖焦亡機(jī)制有望為臨床上肺癌患者的治療帶來(lái)新的視角。本研究使用的是鼠源的EGFR突變細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，雖然與臨床上的數(shù)據(jù)接近，但是否完全對(duì)應(yīng)還需更多臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。綜上，本研究結(jié)果為肺癌治療提供了新的思路和方法，也為深入探究肺癌治療機(jī)制提供了重要的參考。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。