李敏敏 張?zhí)m迎 趙翠敏 熊永星 吳倩倩 趙 岑

（聊城市農業(yè)科學院，山東 聊城 252000）

靈芝Ganoderma lucidum，是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，含有三萜、多糖等多種活性成分。這些活性成分在抗腫瘤、抗癌，以及改善慢性病、提高機體免疫力等方面均有顯著效果。近年來，隨著人們生活水平穩(wěn)步提高，保健意識逐步增強，保健產品的需求量也日益加大。靈芝保健產品的開發(fā)成為目前研究的熱點之一。

從靈芝子實體、菌絲體、孢子粉、發(fā)酵液中分離獲得靈芝三萜、多糖，可用于保健品、美白抗衰類化妝品等功能產品的開發(fā)。靈芝不同類型材料中的三萜、多糖種類及含量存在差異，如子實體中三萜種類和含量最豐富，菌絲體中多糖、芝酮三醇、靈芝醇A含量較高。靈芝三萜和多糖提取及分離純化方法的差異會制約靈芝三萜和多糖的開發(fā)利用。因此，筆者分析歸納靈芝三萜、多糖的不同提取及分離純化方法，以期為其開發(fā)、利用提供理論指導。

1 靈芝三萜提取及分離純化方法

1.1 靈芝三萜提取方法

三萜類化合物廣泛存在，因其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫調節(jié)等多種藥理活性而受到廣泛關注。靈芝三萜多具脂溶特性，不易溶于水。如果只選擇傳統(tǒng)提取方法從靈芝的子實體以及孢子粉等材料中提取三萜類化合物，不僅花費時間較長、三萜得率較低，而且所提取的三萜類化合物結構也會由于提取方式不同而受到不同程度的破壞。因此，提取工藝需要綜合考慮靈芝三萜的吸附力、蒸汽壓、溶解度以及酶解和超聲空化作用等特性，根據(jù)實際情況選擇傳統(tǒng)溶劑提取、超聲波輔助、超臨界萃取、微波輔助和微波-超聲波協(xié)同等不同的提取方法[1]。

1.1.1 靈芝子實體三萜提取方法

彭小芳等[2]基于超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯(lián)用（UPLC-MS-MS）定量檢測法，對sd-2 靈芝子實體中三萜類化合物熱回流提取工藝進行優(yōu)化改進：提取時間2.5 h，液（mL）料（g）比14∶1，乙醇體積分數(shù)75%，提取2 次，所得三萜為11.859 1 mg/g。丁霄霄等[3]以靈芝子實體為原料，用復合酶提取靈芝總三萜的工藝為酶解處理90 min，溫度50 ℃、pH 5，酶解后的子實體繼續(xù)用無水乙醇在80 ℃水浴中回流提取2 h，靈芝總三萜的得率為1.29%±0.04%。此方法簡單、效率高，可以用于提取靈芝總三萜，但是試驗只對復合酶提取靈芝總三萜工藝進行研究，而復合酶對靈芝總三萜成分組成是否有影響還有待進一步研究。李波等[4]以靈芝子實體為原料采用傳統(tǒng)醇提法提取三萜，最佳條件為10 倍無水乙醇，溫度60 ℃，時間60 min，提取2 次，三萜的提取率為0.76%，在此醇提法的基礎上進行超聲輔助，提取率可提高20.5%。馬婧嘉等[5]在超聲波協(xié)同半仿生法的研究中，優(yōu)化提取靈芝子實體三萜工藝，在乙醇體積分數(shù)85%，液（mL）料（g）比30∶1，提取溫度為60 ℃，超聲時間30 min 的條件下，靈芝三萜提取率為2.99%，該工藝提取率較高且穩(wěn)定。徐樹來等[6]優(yōu)化超高壓輔助提取靈芝三萜的工藝：液（mL）料（g）比20∶1，壓力為350 MPa，保壓時間7 min，乙醇體積分數(shù)90%，靈芝三萜得率為1.154%。

1.1.2 靈芝菌絲體三萜提取方法

鄭苗欣等[7]以靈芝菌絲體為原料，通過正交試驗優(yōu)化超聲輔助的最佳工藝條件：乙醇體積分數(shù)為85%，液（mL）料（/g）比為30∶1，提取時間為30 min，靈芝菌絲體三萜的平均得率達3.50%。劉奇等[8]通過正交試驗和Box-Behnken 響應面設計法優(yōu)化超聲輔助提取靈芝菌絲體三萜工藝，得出超聲輔助提取靈芝菌絲體總三萜正交試驗最佳工藝為超聲時間50 min，超聲功率90 W，pH 8，液（mL）料（g）比40∶1，在此條件下靈芝菌絲體三萜平均提取率為0.76%；超聲輔助提取靈芝菌絲體總三萜響應面試驗最佳工藝為超聲時間42 min，超聲功率90 W，pH 8，液（mL）料（g）比30∶1，在此條件下，靈芝菌絲體總三萜平均提取率為1.09%。這兩種提取工藝參數(shù)可靠，可為靈芝三萜工業(yè)化生產提供技術參考。

1.1.3 靈芝孢子粉三萜提取方法

孢子粉包括未破壁孢子粉和破壁孢子粉。李康等[9]研究破壁靈芝孢子粉中總三萜的最佳提取工藝，優(yōu)化提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)95%，液（mL）料（g）比60∶1，在85 ℃條件下回流提取2 h，提取2次，總三萜的含量可達6.45%。崔馨戈等[10]以赤芝、紫芝破壁孢子粉（破壁率≥98%）為原料，采用超聲輔助法優(yōu)化后，赤芝破壁孢子粉超聲提取最優(yōu)方案：提取溶劑為無水乙醇，液（mL）料（g）比65∶1，提取溫度42 ℃，提取時間60 min；紫芝破壁孢子粉超聲提取最優(yōu)方案：提取溶劑為無水乙醇，液（mL）料（g）比50∶1，提取溫度40 ℃，提取時間42 min；采用超聲輔助提取赤芝、紫芝孢子粉中的總三萜，相較于傳統(tǒng)的溶劑浸提法和回流提取法，提取時間縮短且提取率提高，高效省時，原料利用率高，且不會因為提取溫度太高而破壞有效成分，適用于工業(yè)生產。此外，溫艷艷等[11]研究優(yōu)化CO2超臨界提取破壁靈芝孢子粉中三萜類成分工藝，最佳提取工藝：無水乙醇為提取溶劑，提取溫度為50 ℃，液（mL）料（g）比為20∶1，提取時間為1.5 h，提取2 次，三萜提取率最高為12.29%；為進一步分析靈芝破壁孢子粉在CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類成分含量差異提供理論依據(jù)和參考。

1.1.4 靈芝發(fā)酵物三萜提取方法

劉海良等[12]利用有機溶劑萃取法，從樹舌靈芝發(fā)酵液中的醇溶物、醇沉物提取靈芝酸，得率分別為0.022 mg/g、0.049 mg/g。高文庚等[13]、胡瓊方等[14]分別采用回流法、超聲波輔助法，從靈芝發(fā)酵粉中提取三萜類物質，其平均得率分別為0.676 0 mg/g、0.612 8 mg/g。

1.2 靈芝三萜分離純化方法

根據(jù)靈芝三萜類物質為醇溶性、弱酸性的特性，通常采用色譜法對其分離純化，包括高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）、高速逆流色譜（High speed counter current chromatography，HSCCC）、大孔吸附樹脂色譜（Macro-porous resin column chromatography）、柱層析（Column chromatography）、薄層色譜分離純化法（Thin-layer chromatography）等。

高效液相色譜方法精密度高，分離純化度高，穩(wěn)定性和重復性好。梁銳等[15]采用優(yōu)化后的HPLC純化條件：以乙腈-乙酸水溶液（0.01%）為流動相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長252 nm，從靈芝子實體水提物中分離純化獲得不同的靈芝酸單體。大孔吸附樹脂色譜法具有高效簡便、快捷、節(jié)約成本等優(yōu)點，但不同類型的大孔樹脂分離純化三萜類化合物效果，存在較大的差異。錢竹[16]用大孔吸附樹脂色譜AB-8 吸附發(fā)酵液中靈芝三萜，在流速為2 mL/min，上樣pH 2 的條件下，吸附并純化獲得靈芝酸8.837 mg/g；祝朋玲等[17]利用HPD-500 型大孔樹脂吸附靈芝子實體總三萜，在上樣液1.0 g/mL（干樣），最大上樣量2 BV，用8.5 BV 的75%乙醇進行洗脫時，靈芝子實體總三萜純度達60.59%。

由此可見，應根據(jù)具體需求選擇適合的大孔樹脂類型。HSCCC 法可以在乙醇、石油醚提取的靈芝三萜粗提液中，純化分離出靈芝酸S、T、B，并且將HSCCC 與大孔吸附樹脂HZ-816 結合使用，可分離得到高純度的靈芝酸F、C1、A、C2。半制備HPLC 和薄層、硅膠柱層析法，可以用于分離純化靈芝菌絲體中的靈芝酸Mc、TMk、Mf、S、R等靈芝酸單體。

2 靈芝多糖提取及分離純化方法

2.1 靈芝多糖提取方法

靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、免疫調節(jié)、降血脂與抗衰老等作用。靈芝多糖大多為雜多糖，雖不易溶于有機溶劑，但易溶于水。提取靈芝多糖的方式除了傳統(tǒng)的熱水和稀酸堿提取法外，還有微波、超聲波、微波輔助超聲波和超聲波輔助堿提法等。采用不同提取方法提取多糖的得率及理化表征均不同，其分子量、單糖的化學及物理結構改變，會影響其抗氧化活性等特性。因而選擇靈芝多糖的提取方法，應綜合考慮該方法所提取的多糖產量及活性等是否滿足要求。

2.1.1 靈芝子實體多糖提取方法

靈芝子實體多糖存在于細胞內，采用傳統(tǒng)的浸提方式提取靈芝多糖難度較大。李波等[4]采用超聲波輔助提取的方法，將靈芝多糖的提取率提高13.2%。王鋒等[18]采用優(yōu)化后的超聲輔助堿提取工藝：超聲功率為105 W，超聲時間為20 min，水浴提取溫度為100 ℃，水浴時間為80 min，液（mL）料（g）比為40∶1，靈芝子實體中多糖提取率為傳統(tǒng)水提法的三倍左右，多糖提取率為67.8 mg/g。孫小梅[19]綜合考慮水浴回流法、加速溶劑萃取法、超聲波輔助法以及微波輔助提取法的多糖得率、對多糖結構的破壞性、實際應用性等因素，最終選擇采用超聲波輔助法提取靈芝子實體多糖，并構建其指紋圖譜。此外，張倩倩[20]研究表明，靈芝子實體菌蓋、菌肉、菌管、菌柄，以及孢子粉（破壁和未破壁）多糖的含量有差異，破壁孢子粉的多糖含量較高，子實體組織中菌柄的多糖含量較高。

2.1.2 靈芝菌絲體及孢子粉多糖提取方法

靈芝菌絲體生長較快，生產周期短，可用于集約化提取多糖。楊光成等[21]利用I2-DMSO 溶液去除菌絲體從培養(yǎng)基中夾帶的糖類物質，并用標準菌絲體進行校正，保證菌絲體中多糖的準確測定。訾鴻威[22]采用超高壓技術同時進行靈芝孢子破壁與多糖的提取，提取劑在靈芝孢子細胞短時間內快速破裂的同時，將多糖帶出胞外，在壓力360 MPa，液（mL）料（g）比為25∶1，保壓時間為4.5 min時，靈芝多糖得率為2.79%。

2.2 靈芝多糖的分離純化方法

靈芝多糖分離純化方法有乙醇分級沉淀法、超濾膜分離法、離子交換層析法、凝膠層析法（分子篩層析法）等。李康強等[23]以分級醇沉方法從靈芝子實體水提物中分離出80%以上的靈芝多糖。

靈芝多糖結構極為復雜，多糖結構會因為靈芝多糖原料以及純化方法的不同，而導致其結構的差異。劉艷芳等[24]采用乙醇沉淀和柱層析方法，分別從靈芝子實體、孢子粉中分離純化獲得免疫調節(jié)活性存在差異的β-葡聚糖。為了分離純化出靈芝胞外多糖，在實際操作過程中往往會綜合利用多種分離純化方法。李平作等[25]利用蛋白酶法和Sevage法結合除去雜蛋白，然后經Sepharose CL-6B凝膠過濾色譜和DEAE-纖維柱層析，多糖回收率達78.2%。超濾膜分離法可以利用不同孔徑的濾膜按照多糖分子質量初步分級，但分級精度不夠高。楊祖金等[26]采用超濾膜分離法分離得到分子量6000 Da 的靈芝多糖，純度為73.5%。

3 展望

靈芝是極具藥用價值的真菌，其三萜、多糖在醫(yī)藥領域和保健食品的開發(fā)有很大應用潛力。

靈芝三萜、多糖的提取，以及分離、純化流程優(yōu)化，多種方法聯(lián)合提高靈芝三萜、多糖的提取率，降低生產成本，仍是現(xiàn)階段研究的難點，也是未來的研究方向。同時應加強靈芝三萜、多糖的結構與生物活性、作用機理、醫(yī)療保健開發(fā)等的研究。