楊麗華 王振峰 吳雅靜

【摘要】 目的：探討上饒市隱匿性乙肝病毒感染（OBI）狀況，并分析其血清學(xué)指標(biāo)與基因特征。方法：收集2021年6月—2022年8月上饒市居民體檢血液標(biāo)本72 584例，對(duì)所有血液樣本進(jìn)行乙肝表面抗原（HBsAg）檢測(cè)，對(duì)HBsAg陰性的標(biāo)本進(jìn)行乙肝病毒（HBV）DNA檢測(cè)。對(duì)OBI樣本檢測(cè)其乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、乙型肝炎E抗體（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）水平，以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。同時(shí)對(duì)OBI樣本進(jìn)行HBV基因分型與S區(qū)氨基酸做突變檢測(cè)。結(jié)果：72 584例血液標(biāo)本中HBsAg陰性且HBV DNA陽性檢出率為0.11%（81/72 584），OBI檢出率為0.10%（74/72 584）。74例OBI患者中單獨(dú)HBcAb陽性占比最高（37.84%），不同血清學(xué)特征OBI患者間ALT和AST水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。74例OBI患者實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中，74例OBI樣本中有19例呈陽性，檢出率為25.68%。19例HBV DNA陽性患者中有15例樣本擴(kuò)增出S區(qū)序列，其中HBV基因分型B型13例，C型2例，且均發(fā)生S區(qū)氨基酸發(fā)生突變，其中14例HBsAg抗原決定簇基因及周邊主要親水區(qū)域（MHR）檢測(cè)出氨基酸突變。結(jié)論：上饒市居民中OBI感染率較高，其中HBcAb陽性占比最高，HBV基因分型以B型居多，S區(qū)及MHR氨基酸突變可能與OBI感染的發(fā)生密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 隱匿性乙肝病毒感染 血清學(xué)指標(biāo) HBV基因分型 上饒市

Study on Occult Hepatitis B Virus Infection Status in Shangrao City/YANG Lihua， WANG Zhenfeng， WU Yajing. //Medical Innovation of China， 2023， 20（34）： 0-093

[Abstract] Objective： To explore the status of occult hepatitis B virus infection （OBI） in Shangrao city， and analyze the serological indicators and gene characteristics. Method： A total of 72，584 blood samples of residents with physical examination in Shangrao City were collected between June 2021 and August 2022. Hepatitis B surface antigen （HBsAg） detection was performed on all blood samples， and hepatitis B virus （HBV） DNA detection was performed on HBsAg negative samples. The levels of hepatitis B virus surface antibody （HBsAb）， hepatitis B E antigen （HBeAg）， hepatitis B E antibody （HBeAb）， hepatitis B virus core antibody （HBcAb）， alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were detected among OBI samples. HBV genotyping and S region amino acid mutation detection were performed on OBI samples. Result： The detection rate of negative HBsAg with positive HBV DNA in 72，584 blood samples was 0.11% （81/72，584）， and the detection rate of OBI was 0.10% （74/72，584）. Among the 74 patients with OBI， positive HBcAb alone accounted for the highest proportion （37.84%）， and there were no statistical differences in ALT and AST levels among OBI patients of different serological characteristics （P>0.05）. A total of 74 OBI patients were detected by real-time PCR， 19 out of 74 OBI samples were positive， with a detection rate of 25.68%. The S-region sequence was amplified in 15 of 19 HBV-DNA positive patients， including 13 cases of HBV genotype B and 2 cases of HBV genotype C， and S region amino acid mutation was detected in all cases. Amino acid mutations were detected in 14 cases of HBsAg antigen determinant genes and surrounding major hydrophilic regions （MHR）. Conclusion： The infection rate of OBI among residents in Shangrao City is high， and the proportion of positive HBcAb is the highest， the majority of HBV genotypes are B type， the mutations of S region and MHR amino acid may be closely related to the occurrence of OBI infection.

[Key words] Occult hepatitis B virus infection Serological indicators HBV genotyping Shangrao City

First-author's address： Shangrao People's Hospital， Jiangxi Province， Shangrao 334000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.34.020

隨著我國乙肝疫苗工作的不斷開展，近年來乙型肝炎病毒（HBV）感染率有所下降^[1]。但我國整體HBV感染率水平仍然較高，相關(guān)研究顯示，我國每年HBV感染人數(shù)已超過百萬^[2]。HBV的主要傳播途徑是輸血，隨著近年來對(duì)血液制品中乙肝表面抗原（HBsAg）的嚴(yán)格檢測(cè)，使得我國HBV經(jīng)血液傳播的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低^[3-4]。隱匿性乙肝病毒感染（OBI）是HBV感染的一種特殊形式，是指常規(guī)血液檢測(cè)中HBsAg呈陰性，但血液或肝臟組織中能檢測(cè)到HBV DNA，且病毒載量往往較低，對(duì)我國醫(yī)療輸血帶來極大的安全隱患^[5-6]。同時(shí)目前對(duì)于OBI患者的血清學(xué)及基因分型特征尚無定論，因此，本研究以上饒市居民為研究對(duì)象，探討該地區(qū)居民中OBI發(fā)生率及病毒學(xué)特點(diǎn)，以期為居民的HBV防控與輸血安全提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021年6月—2022年8月上饒市居民體檢血液標(biāo)本72 584例。納入標(biāo)準(zhǔn)：因獻(xiàn)血或身體檢查而留存血液標(biāo)本；病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他型肝炎或嚴(yán)重肝臟疾病；合并血液系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重貧血。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊呒凹覍賹?duì)研究知情并自愿參與。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 通過查閱患者病歷資料了解患者年齡、性別等一般資料信息。

1.2.2 OBI標(biāo)本篩查 使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（北京聯(lián)眾泰克科技有限公司，UD90DT，國械注準(zhǔn)20183220293）對(duì)所有血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，S/CO值高于1提示存在反應(yīng)性，高于0.5但低于1為灰區(qū)，低于0.5為陰性，除陰性外其他均判定為陽性。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)對(duì)HBsAg陰性組標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)。對(duì)于檢出的HBsAg陰性且HBV DNA陽性樣本排除HBV感染治療后的窗口期患者，從而篩選出OBI患者。

1.2.3 血清學(xué)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)OBI樣本乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、乙型肝炎E抗體（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）水平，使用全自動(dòng)生化分析儀（迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，吉械注準(zhǔn)20192220203，CS-T240PLUS）采用速率法測(cè)量其谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

1.2.4 HBV DNA載量及基因分型與S區(qū)基因突變檢測(cè) 采用磁珠法及相應(yīng)試劑[寧波海爾施基因科技有限公司，浙甬食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第1400194號(hào)]提取OBI樣本中的HBV DNA，使用實(shí)時(shí)熒光PCR定量?jī)x（英灘捷基貿(mào)易有限公司，7500，國械注進(jìn)20163400767）進(jìn)行病毒載量檢測(cè)，以10 IU/mL為檢出最低閾值。參照相關(guān)文獻(xiàn)^[7]中S區(qū)基因擴(kuò)增條件、引物序列及GeneBank野生型序列，使用基因測(cè)序儀（廣州金圻睿生物科技有限責(zé)任公司，KM MiniSeqDx-CN，國械注準(zhǔn)20203220340）對(duì)S區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序，并使用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因分型工具對(duì)S區(qū)基因序列進(jìn)行基因分型對(duì)比，以GeneBank野生型序列為參照使用MEGA5.0軟件檢測(cè)S區(qū)氨基酸突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 OBI發(fā)生率

72 584例血液標(biāo)本中HBsAg陰性且HBV DNA陽性檢出率為0.11%（81/72 584），OBI檢出率為0.10%（74/72 584）。

2.2 OBI樣本血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

74例OBI患者中單獨(dú)HBcAb陽性占比最高（37.84%），其次為HBcAb陽性/HBsAb陽性（25.68%），所有OBI患者中HBcAb陽性率為94.59%，見表1。

2.3 不同血清模式OBI患者感染學(xué)特征比較

不同血清模式OBI患者一般資料及ALT、AST水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 OBI樣本HBV DNA定量與基因分型

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中，74例OBI樣本中有19例呈陽性，檢出率為25.68%。19例樣本平均HBV DNA濃度為（45.72±8.23）IU/mL，其中17例樣本HBV DNA濃度低于100 IU/mL，2例樣本HBV DNA濃度高于100 IU/mL。19例HBV DNA陽性患者中有15例樣本擴(kuò)增出S區(qū)序列，其中HBV基因分型B型13例，C型2例。

2.5 不同血清模式OBI患者病毒定量檢測(cè)及基因分型分布

不同血清模式OBI患者HBV DNA定量檢測(cè)（陽性、陰性）與基因分型分布[B型、C型、未檢出（HBV DNA定量陰性及HBV DNA定量陽性但未擴(kuò)增處S區(qū)序列）]差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.6 病毒基因分型與S區(qū)氨基酸突變分析

15例擴(kuò)增出S區(qū)序列的樣本均發(fā)生S區(qū)氨基酸突變，其中14例HBsAg抗原決定簇基因及MHR檢測(cè)出氨基酸突變，見表4。

3 討論

HBV傳播途徑廣泛，而OBI作為HBV感染中的一種特殊形式，不僅給輸血安全帶來極大挑戰(zhàn)，同時(shí)也會(huì)發(fā)生于疫苗接種后人群中，相關(guān)研究指出，該病是乙肝疫苗接種、透析及輸血失敗的重要影響因素^[8]。因此，了解人群中OBI感染率與病毒特征尤為重要。不同地區(qū)的OBI感染率差距較大，本研究中顯示，上饒市72 584例血液標(biāo)本中OBI檢出率為0.10%，OBI感染率高于韶關(guān)市（0.089%）^[9]、西安市（0.067%）^[10]，低于溫州市（0.12%）^[11]。說明上饒市居民中仍存在一定比例的OBI感染人群，需重視血液制品中的OBI篩查，防止漏檢引發(fā)的HBV傳播。

HBcAb陽性是HBV既往感染的標(biāo)志，常常伴隨患者一生，同時(shí)也是OBI陽性的特征之一^[12]。本研究中顯示，74例OBI患者中呈現(xiàn)出5種不同血清模式，其中單獨(dú)HBcAb陽性占比最高（37.84%），所有OBI患者中HBcAb陽性率為94.61%，證明了上述論斷，同時(shí)提示臨床血液篩查應(yīng)重視HBcAb的檢測(cè)。本研究中顯示，不同血清模式OBI患者一般資料及ALT、AST水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與左曉嬌等^[13]研究結(jié)果相似，提示高HBV感染率的環(huán)境是導(dǎo)致OBI發(fā)生率較高的原因之一。OBI的發(fā)生機(jī)制尚無統(tǒng)一的定論，但相關(guān)研究指出，免疫因素是OBI感染發(fā)生的一個(gè)重要因素。在免疫抑制的情況下很可能會(huì)誘導(dǎo)OBI的激活，并使患者顯示出典型的血清學(xué)特征^[14-15]。同時(shí)機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)能通過相關(guān)機(jī)制將HBV DNA載量控制在較低水平，這也是其呈隱匿性的重要原因^[16]。本研究中顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中74例OBI樣本中有19例呈陽性，檢出率為25.68%，且整體HBV DNA較低，其中17例樣本HBV DNA濃度低于100 IU/mL，僅2例樣本HBV DNA濃度高于100 IU/mL。相關(guān)研究指出，OBI患者中HBcAb陽性組的HBV DNA定量檢測(cè)陽性率明顯低于HBcAb陰性組^[17]。但本研究中顯示，各血清模式OBI患者間HBV DNA定量檢測(cè)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮為本研究納入樣本量較小所致。

目前對(duì)于OBI的基因分型與突變的研究逐漸受到重視，本研究中顯示，19例HBV DNA陽性患者中有15例樣本擴(kuò)增出S區(qū)序列，其中HBV基因分型B型13例，C型2例，與孫妮等^[18]研究結(jié)果相似。MHR是HBsAg膜外區(qū)的氨基酸區(qū)域，相關(guān)報(bào)道指出，HBV DNA中S區(qū)MHR氨基酸發(fā)生的突變，尤其是在“a”抗原決定簇上發(fā)生的突變是OBI發(fā)展的重要原因之一^[19-20]。本研究中OBI患者S區(qū)MHR氨基酸突變發(fā)生率較高，同時(shí)Q129R為常見突變位點(diǎn)，表明了上饒市人群S區(qū)MHR氨基酸突變的地域特點(diǎn)。

OBI不僅為輸血安全帶來極大挑戰(zhàn)，同時(shí)會(huì)影響患者肝細(xì)胞生命周期，增加患者出現(xiàn)肝硬化與肝癌的風(fēng)險(xiǎn)^[21]。本次研究對(duì)上饒市居民中OBI流行情況、血清學(xué)及病毒基因特征進(jìn)行了初步探討，為本地OBI防控及血液篩查提供了數(shù)據(jù)支持。但本研究尚存在一定不足，納入樣本量較小，有待日后進(jìn)一步擴(kuò)增樣本量深入研究與分析。

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（收稿日期：2023-03-30） （本文編輯：何玉勤）

*基金項(xiàng)目：上饒市科技局重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021E002）

①江西省上饒市人民醫(yī)院 江西 上饒 334000

通信作者：楊麗華