汪晨祥，秦永麗，蔣永榮，葛仕佳，鄭國權(quán)，孫振舉

（1 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2 西湖大學(xué)工學(xué)院，浙江 杭州 310030）

傳統(tǒng)塑料具有耐化學(xué)性和熱穩(wěn)定性，在日常生活和工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)塑料難以生物降解，造成一系列環(huán)境污染問題。因此尋找在物理化學(xué)性能上與傳統(tǒng)塑料相似并能生物降解的新型材料成為研究熱點[1-2]。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一類生物合成的高分子聚酯的統(tǒng)稱，PHAs 不僅擁有與聚乙烯、聚丙烯等石油化工產(chǎn)品相似的熱塑性與力學(xué)性能，而且具有生物可降解性、生物相容性等特征[3]，是一種可代替?zhèn)鹘y(tǒng)塑料的理想材料[4]。

目前，利用純菌發(fā)酵生產(chǎn)PHAs 的原料成本較高，使其工業(yè)化應(yīng)用中受到限制[5-6]。與此同時，硫酸鹽有機廢水是亟待解決的環(huán)境污染源之一[7]。該類廢水厭氧處理過程中產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物——小分子的混合有機酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乳酸等[8]，是PHAs產(chǎn)生菌合成PHAs的良好原料[9]。王愛杰等[10]的研究表明，產(chǎn)酸作用和硫酸鹽還原作用可以同時進(jìn)行，且具有顯著優(yōu)越性。近年來，本文作者課題組利用五隔室厭氧折流板反應(yīng)器（anaerobic baffled reactor，ABR）處理硫酸鹽有機廢水（以蔗糖為碳源）進(jìn)行了大量研究[8,11-12]。前期研究表明，在ABR 第1、第2 隔室，產(chǎn)酸菌（acid producing bacteria，APB）將蔗糖降解為丁酸、丙酸、乳酸和乙酸等揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），而硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）則利用其中的某些VFAs（如乳酸、丙酸、丁酸等）還原硫酸鹽的同時產(chǎn)生大量的乙酸，以作為第4、第5 隔室產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)良底物。上述第1、第2隔室稱為產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相，第4、第5隔室為產(chǎn)甲烷相。值得注意的是，硫酸鹽有機廢水中的COD/SO42-比值會直接影響產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相微生物代謝，改變該相中VFAs 的組分和含量[13]，從而影響PHAs 產(chǎn)生菌的富集和PHAs 的形成[14]。目前尚未見不同COD/SO42-比值條件下產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相PHAs產(chǎn)生菌富集的相關(guān)研究。

本研究在ABR 處理硫酸鹽有機廢水成功啟動并形成生物相分離特性的基礎(chǔ)上，繼續(xù)運行該反應(yīng)器，以第1、第2隔室產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥為研究對象，考察了進(jìn)水COD/SO42-比值對顆粒污泥中PHAs產(chǎn)生菌合成PHAs的影響，并分析產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs的合成機理。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

采用的五隔室ABR總?cè)莘e為77L，有效容積為62L[15]。反應(yīng)器分為5 個隔室，每一隔室由上、下流室組成，上、下流室體積比為3∶1。折流板底部邊緣通往上流室的折角為向上45°的導(dǎo)流板，便于將水送至上流室的中心，使泥水充分混合接觸，維持較高的顆粒污泥濃度。反應(yīng)器每個上流室上部安裝了三相分離器，頂部設(shè)置導(dǎo)氣口。反應(yīng)器通過蠕動泵控制進(jìn)水流量，采用保溫回流管包裹反應(yīng)器外壁控制反應(yīng)器溫度（33℃±1℃）。

1.2 實驗方法

在開展本研究前已歷時157 天成功啟動ABR，此時進(jìn)水COD 濃度為4000mg/L，進(jìn)水SO42-濃度為250mg/L，COD/SO42-比值為16.0，水力停留時間（hydraulic retention time，HRT）為24h，對COD 和SO42-的平均去除率穩(wěn)定在95%以上，出水VFAs 濃度低于200mg/L，顆粒污泥性能良好。此時反應(yīng)器已形成良好的生物相分離特性，其中第1、第2 隔室為產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相。本研究在此成功啟動的ABR基礎(chǔ)上繼續(xù)運行，保持COD濃度和HRT不變，通過逐漸提高進(jìn)水SO42-濃度調(diào)節(jié)進(jìn)水COD/SO42-比值，以考察COD/SO42-比值對產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs產(chǎn)生菌富集的影響。反應(yīng)器的運行控制按照進(jìn)水SO42-濃度不同分為3個階段：第1階段（158～215天）進(jìn)水SO42-濃度為320mg/L，COD/SO42-比值為12.5；第2 階段（216～261 天）進(jìn)水SO42-濃度升高為430mg/L，COD/SO42-比值為9.3；第3 階段（262～342 天） 進(jìn) 水SO42-濃 度 升 高 為1000mg/L，COD/SO42-比值為4.0。每個階段的運行達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后即進(jìn)入下一運行階段。

1.3 分析項目及測定方法

1.3.1 常規(guī)指標(biāo)及電鏡分析

常規(guī)指標(biāo)及測試方法根據(jù)《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[16]以及《廢水的厭氧生物處理》[17]：COD，重鉻酸鉀法；SO42-，重量法；VFAs含量與組分，氣相色譜法[18]；顆粒污泥中PHAs 含量，氣相色譜法[19]；PHAs 產(chǎn)生菌形態(tài)，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）[20]

1.3.2 熒光原位雜交

顆粒污泥經(jīng)固定、包埋、冷凍切片、裝片脫水后進(jìn)行原位雜交，雜交后洗脫，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。使用探針為：①EUB338 （5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）[21]用于檢測真細(xì)菌；②PHACGNF（5′-CCYRGATCAACAAGTTCTAC-3′）[22]

用于檢測Ⅰ型和Ⅱ型PHAs聚合酶；③BmphaC015F（5′-CGTGCAAGAGTGGGAAAAAT-3′）[22]用于檢測Ⅳ型PHAs 聚合酶，使用熒光素AMCA（藍(lán)）對EUB338標(biāo)記，熒光素Texas Red（紅）對PHACGNF和BmphaC015F 標(biāo)記。探針由上海生工合成制備（熒光染料接在5′端）。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)器產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相的處理效能

2.1.1 不同COD/SO42-比值下COD和SO42-去除情況

隨著進(jìn)水SO42-濃度逐步提高，進(jìn)水COD/SO42-比值由12.5 逐漸降低為9.3 和4.0，考察COD/SO42-比值的變化對反應(yīng)器運行的影響。反應(yīng)器第1、第2隔室的COD和SO42-平均去除率如圖1所示。由圖可知，隨進(jìn)水COD/SO42-比值的降低，第1 隔室COD 及SO42-的平均去除率有逐漸降低的趨勢，進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5、9.3 和4.0 時，第1 隔室COD 的平均去除率分別為25%、24%、20%[圖1(a)]，第1 隔室SO42-的平均去除率分別為91%、86%、67%[圖1(b)]；而第2隔室的COD及SO42-的平均去除率明顯低于第1 隔室，隨進(jìn)水COD/SO42-比值的降低，第2 隔室COD 平均去除率變化不大，分別為6%、6%、5%[圖1(a)]，第2 隔室SO42-的平均去除率分別為6%、10%、22%，有逐漸升高趨勢[圖1(b)]。綜上可見，隨著進(jìn)水COD/SO42-比值不斷降低，第1 隔室的COD 和SO42-的平均去除率均逐漸降低，第2 隔室COD 的平均去除率相對穩(wěn)定但SO42-的平均去除率不斷上升，這種現(xiàn)象表明在反應(yīng)器產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中COD和SO42-的去除呈現(xiàn)沿程后移的現(xiàn)象。同時，第1、第2隔室總的COD 和SO42-的平均去除率均有降低的趨勢，進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5、9.3和4.0時，總的COD平均去除率分別為31%、30%和26%，總的SO42-平均去除率分別是97%、96%和89%。王愛杰等[10]以糖蜜廢水為碳源運行產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器，在COD/SO42-比值為5.0、3.0、4.2、2.0時，COD的平均去除率在28%～33%，SO42-的平均去除率在81%～92%，其結(jié)果與本研究相似。

圖1 不同進(jìn)水COD/SO42-比值下COD和SO42-平均去除率

2.1.2 不同COD/SO42-比值下VFAs濃度及組分變化

不同進(jìn)水COD/SO42-比值下反應(yīng)器產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中VFAs 濃度及組分變化情況見表1。由表可知，第1、第2隔室VFAs濃度隨著進(jìn)水COD/SO42-比值降低不斷升高，當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5、9.3和4.0時，第1隔室VFAs 濃度分別為1423mg/L、1631mg/L 和1848mg/L；第2 隔室VFAs 濃度分別為1289mg/L、1451mg/L和2065mg/L。

表1 不同COD/SO42-值VFAs濃度及占比

從整體看，不同COD/SO42-比值下第1和第2隔室中VFAs 組分均以乙酸和丁酸為主。與此同時，進(jìn)水COD/SO42-比值的下降對乙酸、丁酸和丙酸等的占比產(chǎn)生了影響。當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值由12.5降為9.3時，第1、第2隔室的VFAs組分變化不大，第1 隔室偶數(shù)碳VFAs 如乙酸和丁酸的占比分別為30%和50%左右，奇數(shù)碳VFAs 如丙酸和乳酸占比分別為15%和10%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分別為70%和20%左右，丙酸占比為10%左右，乳酸未檢出。然而，當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值降為4.0時，第1、第2隔室的VFAs組分發(fā)生較大變化，第1隔室乙酸和丁酸的占比分別為22%和54%左右，丙酸和乳酸占比分別為11%和13%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分別為34%和45%，丙酸占比為9%，并且在第2 隔室檢測出乳酸，占比為12%。任南琪等[23]以糖蜜廢水作為有機碳源運行的產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器中，酸性末端產(chǎn)物中乙酸始終占據(jù)主導(dǎo)地位，占50%～82%，這種代謝類型被稱為乙酸型代謝。在本研究中，隨著進(jìn)水COD/SO42-比值的下降，第1 隔室的代謝類型始終為丁酸型代謝；當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5 和9.3 時，第2 隔室的代謝類型為乙酸型代謝，當(dāng)比值降為4.0 時，第2 隔室逐漸轉(zhuǎn)為丁酸型代謝。

2.2 不同COD/SO42-比值條件下PHAs的積累

在不同進(jìn)水COD/SO42-比值條件下，產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs所占細(xì)胞干重的含量變化如圖2 所示。由圖可知，進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5時，第1、第2隔室顆粒污泥中PHAs質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38%和19%；當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值降為9.3時，第1、第2隔室顆粒污泥中的PHAs質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27%和35%，由此可見第1 隔室的PHAs 含量在減少，第2隔室的PHAs含量則在增加且含量超過第1隔室；當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值降為4.0時，第1、第2 隔室顆粒污泥中的PHAs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降為15%和29%。王娜等[4]利用序批式反應(yīng)器以剩余污泥水解液為底物合成PHAs，反應(yīng)器中PHAs 最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近13%。Tamang等[24]以廚余廢棄油脂為底物富集PHAs 產(chǎn)生菌合成PHAs，最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38%。由此可見，利用硫酸鹽有機廢水厭氧處理的產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相合成PHA具有一定潛力。

圖2 不同進(jìn)水COD/SO42-比值顆粒污泥中的PHAs含量變化情況

綜上可知，隨著進(jìn)水COD/SO42-比值逐漸降低，第1 隔室顆粒污泥中PHAs 的含量逐漸降低，第2隔室顆粒污泥中PHAs的含量先上升后下降，顆粒污泥PHAs 的高含量隔室由第1 隔室后移至第2 隔室。由前期研究可知，進(jìn)水COD/SO42-比值的變化會影響ABR 的代謝相和系統(tǒng)穩(wěn)定性，隨著COD/SO42-比值降低，反應(yīng)器產(chǎn)酸、硫酸鹽還原、產(chǎn)甲烷相后移[12]，這與2.1節(jié)中第1、第2隔室的COD、SO42-去除變化和VFAs 濃度變化相符。此外，隨著進(jìn)水COD/SO42-比值逐漸降低，第2 隔室VFAs 中偶數(shù)碳VFAs（乙酸和丁酸）占比先升高后降低，其中乙酸占比同樣先上升后降低，而奇數(shù)碳VFAs（丙酸和乳酸）占比先降低后升高（表1），有研究表明大多數(shù)天然PHAs產(chǎn)生菌先利用偶數(shù)碳VFAs（乙酸和丁酸），其次是奇數(shù)碳VFAs（丙酸、乳酸）[25-26]，同時乙酸馴化的活性污泥比用丙酸、丁酸馴化的活性污泥能更有效地貯存PHAs[27-28]，Jia 等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)在含有3種VFAs為碳源的系統(tǒng)中，PHAs產(chǎn)生菌對VFAs的利用率為：乙酸＞丁酸＞丙酸。綜上可知，在產(chǎn)酸-硫酸鹽還原中，通過調(diào)控進(jìn)水COD/SO42-比值，進(jìn)而調(diào)節(jié)VFAs 的組分是富集PHAs 產(chǎn)生菌合成PHAs的關(guān)鍵。

2.3 顆粒污泥中PHAs及其產(chǎn)生菌形態(tài)分析

為了更清楚地了解污泥內(nèi)部的微生物形態(tài)，對第215 天（COD/SO42-比 值 為12.5）、第261 天（COD/SO42-比值為9.3）、第342 天（COD/SO42-比值為4.0）時第1、第2 隔室的顆粒污泥進(jìn)行TEM 觀察，如圖3～圖5 所示。由圖可見PHAs 產(chǎn)生菌的形態(tài)及菌體細(xì)胞內(nèi)大量聚集的顆粒狀PHAs，該顆粒狀PHAs 與Nygaard 等[30]研究觀察結(jié)果相似。進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5 時，觀察到第1 隔室的PHAs產(chǎn)生菌細(xì)胞內(nèi)存在大量顆粒狀PHAs，第2 隔室中部分細(xì)胞內(nèi)存在少量的顆粒狀PHAs（圖3）；當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值為9.3 時，第1 隔室中存在顆粒結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量減少，第2 隔室PHAs 產(chǎn)生菌個體明顯變大，并且出現(xiàn)多種形態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞體內(nèi)顆粒狀結(jié)構(gòu)顯著增多（圖4）；在進(jìn)水COD/SO42-比值降為4.0 時，兩個隔室顆粒污泥中微生物形態(tài)變小，僅有少量細(xì)胞內(nèi)可以觀察到PHAs顆粒結(jié)構(gòu)（圖5）。這與第1、第2隔室顆粒污泥中PHAs的含量變化相一致，見圖2。同時，對第261天第1、第2隔室的顆粒污泥進(jìn)行了FISH分析，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，該階段PHAs產(chǎn)生菌在顆粒污泥中廣泛分布。有研究表明，PHAs 產(chǎn)生菌能在顆粒污泥的各個位置生長[31]，與本研究FISH觀察到的現(xiàn)象相符。

圖3 進(jìn)水COD/SO42-比值為12.5時顆粒污泥TEM圖

圖4 進(jìn)水COD/SO42-比值為9.3時顆粒污泥TEM圖

圖5 進(jìn)水COD/SO42-比值為4.0時顆粒污泥TEM圖

圖6 進(jìn)水COD/SO42-比值為9.3時顆粒污泥FISH圖

結(jié)合2.1 節(jié)、2.2 節(jié)可知，進(jìn)水COD/SO42-比值的改變影響了VFAs 組分，進(jìn)而對PHAs 產(chǎn)生菌的數(shù)量、個體形態(tài)和顆粒狀PHAs 的積累有一定影響。由表1 可知，當(dāng)進(jìn)水COD/SO42-比值由12.5 降至9.3，第1、第2隔室的乙酸濃度均有所上升，此時兩個隔室內(nèi)PHAs產(chǎn)生菌數(shù)量顯著增多，個體形態(tài)明顯變大；然而隨著進(jìn)水COD/SO42-比值降為4.0，第1、第2隔室中乙酸的濃度及占比較COD/SO42-比值為9.3 時有所降低，此時PHAs 產(chǎn)生菌形態(tài)變小，積累的顆粒結(jié)構(gòu)也變少，因為一般來說相比于碳鏈較長的脂肪酸如丙酸、丁酸，鏈長較短的乙酸更有利于微生物的生長[32]。并且隨著進(jìn)水SO42-濃度逐漸升高，反應(yīng)器內(nèi)由硫酸鹽還原產(chǎn)生的硫化物含量不斷增加，對微生物產(chǎn)生一定毒性作用，同時SRB具有一定硫酸鹽和硫化物的耐受性，可以正常生長繁殖[33]。分析認(rèn)為，在產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中，保持進(jìn)水COD/SO42-比值在合適的范圍，有助于PHAs 產(chǎn)生菌生長繁殖與PHAs 的積累；且PHAs 產(chǎn)生菌個體大、顆粒狀PHAs 聚集多的污泥PHAs 含量也高。

2.4 產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相PHAs合成途徑分析

由液相VFAs 組分及固相顆粒污泥微生物中PHAs 積累狀況推測，產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中存在如圖7 所示的生物鏈?zhǔn)絽f(xié)同代謝模式。由圖7 可知，硫酸鹽有機廢水中的蔗糖主要被水解菌和APB轉(zhuǎn)化為三碳以上VFAs（乳酸、丙酸、丁酸等），這些三碳以上VFAs 可以被脂肪酸型SRB（fatty-acid utilized-SRB，F(xiàn)SRB）利用轉(zhuǎn)化為乙酸的同時還原硫酸鹽，而乙酸進(jìn)一步被乙酸型SRB（acetic-acid utilized-SRB，ASRB）利用還原硫酸鹽生成二氧化碳。其中APB、FSRB 和ASRB 均可利用各階段產(chǎn)生的VFAs 合成PHAs，本文作者課題組[8]前期高通量測序的結(jié)果也佐證了這一點，16S rRNA高通量測序結(jié)果表明，在COD/SO42-比值為6.9時，ABR第1、第2隔室的優(yōu)勢菌為APB與SRB，如窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）為APB，有研究表明其具有合成PHA的能力[34]；Widdel等[35]首次在SRB中觀察到PHAs的積累，Hai等[36]發(fā)現(xiàn)多種SRB如脫硫球菌屬（Desulfococcus）、脫硫桿菌屬（Desulfobacterium）等具有利用VFAs 合成PHAs 的能力。綜上，在產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中，存在APB-FSRB-ASRB 生物鏈?zhǔn)絽f(xié)同代謝模式，其中APB、FSRB 和ASRB 可利用VFAs各組分合成PHAs并貯存于菌體內(nèi)。

圖7 產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中PHAs合成途徑

3 結(jié)論

（1）在ABR產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中，進(jìn)水COD/SO42-比值會影響COD 與SO42-的去除、VFAs 的濃度和組成以及反應(yīng)器的代謝類型。隨著進(jìn)水COD/SO42-比值由12.5 降低至4.0，COD 與SO42-的去除沿程后移；反應(yīng)器第1隔室保持丁酸型代謝類型，第2隔室由乙酸型代謝轉(zhuǎn)為丁酸型代謝類型。

（2）通過調(diào)控進(jìn)水COD/SO42-比值，進(jìn)而改變液相中VFAs 的組分，是產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中富集PHAs產(chǎn)生菌和提高PHAs 產(chǎn)量的關(guān)鍵。隨著COD/SO42-比值降低，顆粒污泥PHAs含量由第1隔室高于第2隔室轉(zhuǎn)變?yōu)榈? 隔室明顯高于第1 隔室，其中COD/SO42-比值9.3 時，產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥PHAs 合成效果最好。TEM 和FISH 觀察結(jié)果表明，顆粒污泥中PHAs 含量較高時，PHAs 產(chǎn)生菌大量富集，細(xì)胞體內(nèi)顆粒狀PHAs數(shù)量較多。

（3）在ABR反應(yīng)器產(chǎn)酸-硫酸鹽還原相中，存在APB-FSRB-ASRB的生物鏈?zhǔn)絽f(xié)同代謝模式，同時APB、FSRB 和ASRB 利用多種VFAs 合成并積累PHAs于菌體內(nèi)。