王浩，邸璐，王芳，張德俐，易維明，李永軍，沈秀麗

（1 山東理工大學農業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255000；2 山東省清潔能源工程技術研究中心，山東淄博 255000；3 農業(yè)農村部規(guī)劃設計研究院，農業(yè)農村部農業(yè)廢棄物能源化利用重點實驗室，北京 100125）

生物質作為零碳資源的一種，其無害化利用對于節(jié)能減排和農業(yè)循環(huán)發(fā)展具有重要的意義。然而，目前許多生物質仍存在被丟棄或直接焚燒等現(xiàn)象[1]，既導致環(huán)境污染，又造成資源浪費，因此對生物質資源的有效利用逐漸成為人們關注的焦點。

生物質可以通過物理、熱化學、生物轉化等方式轉化為固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)等燃料。水熱炭化技術是近年來逐漸興起的一種生物質熱化學轉化方式，生物質在180～280℃的溫度范圍內經(jīng)歷一系列水解、脫水、脫羧和縮聚等化學反應[2]，最終形成水熱炭。水熱炭化技術比較適合含水量較高的生物質[3]，憑借其相對豐富的含氧官能團與良好的脫氧脫灰性能等特點，在吸附材料、儲能材料、催化劑等領域具有極高的潛在應用價值[4]。然而，由于水的存在，生物質中的部分有機物會溶解到水熱炭化液相中，形成小分子酸、還原糖、呋喃類和酚類化合物等可溶物質[5]，通常這部分水相的化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）和總有機碳（total organic carbon，TOC）的含量為10～40g/L和5～20g/L[6]，直接將水熱廢液排放會對環(huán)境造成嚴重的影響，因此水熱廢液的無害化處理已經(jīng)成為水熱炭化技術發(fā)展中必須要解決的瓶頸問題。

厭氧發(fā)酵是一種處理廢水的常用技術，已有研究證明利用厭氧發(fā)酵技術可實現(xiàn)水熱炭化液相中有機組分的甲烷化轉化，實現(xiàn)能量的二次回收。Aragón-Brice?o 等[7]對污泥進行水熱炭化處理，其中水熱液相發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量達到了總能量的58%。Erdogan 等[8]以橙渣為原料獲得的水相產(chǎn)物甲烷總產(chǎn)氣量在195～213mL/g COD，在經(jīng)濟上可行。Posmanik 等[9]通過對竹渣炭化水熱液相和魚加工處理廢物混合發(fā)酵的研究得知，厭氧發(fā)酵技術處理水熱炭化液相，有機物的去除率為58%～90%，甲烷累積產(chǎn)氣量在136～286mL/g COD。將厭氧發(fā)酵與水熱炭化技術結合，可實現(xiàn)生物質中有機質逐級利用，固體與氣體燃料聯(lián)產(chǎn)，具有較高的商業(yè)價值。

但是，水熱炭化液相產(chǎn)物在單獨進行厭氧消化時也存在著一些問題。由于其中含有較多的酸，可能會在厭氧消化早期出現(xiàn)酸抑制現(xiàn)象[10]。并且生物質中的纖維素、半纖維素和木質素在水熱過程中會生成糠醛、羥甲基糠醛、乙酰丙酸和酚類化合物等有機物，對后續(xù)厭氧發(fā)酵具有不同程度的抑制作用[11]。近年來，隨著厭氧發(fā)酵技術的發(fā)展和原料的多樣化，多基質厭氧發(fā)酵得到了廣泛的研究與應用?；旌习l(fā)酵可以稀釋有毒化合物，保持營養(yǎng)平衡，不同原料之間的協(xié)同作用可以提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的沼氣生產(chǎn)效率[12]。將水熱炭化液相和秸稈類原料進行混合發(fā)酵，一方面可以補充水熱炭化液相中有機質含量，稀釋水相中的呋喃類及酚類等抑制物，平衡水相產(chǎn)物的酸度，提高發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定性；另一方面可以促進秸稈類原料水解，加速產(chǎn)氣速率。

纖維素是木質纖維素類生物質中的重要成分之一，其在水熱炭化過程中會發(fā)生水解產(chǎn)生糖類、酸類和呋喃衍生物等物質，是生物質水解的主要產(chǎn)物[13]。其中糖和酸是厭氧發(fā)酵過程中重要的代謝產(chǎn)物；而呋喃衍生物對產(chǎn)甲烷微生物代謝過程具有一定的抑制作用。因此，本研究針對纖維素水熱炭化水解液與玉米秸稈混合發(fā)酵開展研究，通過分析纖維素水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵過程中有機物的轉化和微生物菌群結構，探究二者厭氧發(fā)酵過程中相互作用及水熱炭化液相產(chǎn)物降解機制，本研究可為水熱液相和秸稈混合厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

用于水熱炭化實驗的纖維素為微晶纖維素，阿拉丁公司，其粒徑為250μm。用于混合厭氧發(fā)酵的玉米秸稈，山東省淄博市，將玉米秸稈自然干燥，并粉碎至1～2cm。厭氧消化所用接種物沼渣，山東省濰坊市沼氣工程，使用前將其在37℃的恒溫條件下富集培養(yǎng)7 天，其中富集培養(yǎng)基包括CHNaO25g、NaAc 5g、甲醇5mL、半胱氨酸0.5g、酵母膏1g、NH4Cl 1g、KH2PO40.4g、K2HPO40.4g、水1000mL。玉米秸稈與接種物特性如表1所示。

表1 秸稈與接種物特性（質量分數(shù)，%）

1.2 水熱炭化實驗

水熱炭化實驗在高壓反應釜（WZEM250）中進行。將纖維素和水以質量比1∶20混合后置于反應器中，反應器溫度分別設置為200℃和230℃，并在設定的溫度下保持30min、60min 和120min。當反應終止時，冷卻至室溫，通過真空過濾器將其固液分離，然后將液相產(chǎn)物儲存于細口瓶中密封備用。

1.3 發(fā)酵實驗

混合厭氧實驗發(fā)酵利用全自動甲烷測試系統(tǒng)（AMPTS II）進行，反應器容積為500mL。實際發(fā)酵所用容積為400mL，發(fā)酵系統(tǒng)的有機負荷率為65g/L VS；將水熱炭化液相與玉米秸稈按質量比3∶1添加于消化器中，所加接種物占發(fā)酵系統(tǒng)VS 總含量的30%，發(fā)酵系統(tǒng)TS 總含量通過蒸餾水調節(jié)至10%。將在200℃的條件下、保溫時間為30min、60min和120min的纖維素水熱廢液的混合發(fā)酵組分別命名為H1、H2 和H3；將在230℃的條件下、保溫時間為60min的纖維素水熱液相的混合發(fā)酵組命名為H4。此外，為進行對比分析，設置了玉米秸稈單發(fā)酵實驗，命名為CS。在實驗期間每隔1h 開啟一次攪拌，攪拌轉速為200r/min，攪拌時間持續(xù)60s?；旌习l(fā)酵在37℃水浴環(huán)境中持續(xù)60天，設置三組平行實驗，分析結果取其平均值。

1.4 分析方法

TS 和VS 含量分別采用恒溫干燥箱110℃烘干法和馬弗爐550℃灼燒法測定；pH 測定使用數(shù)字pH 計（FE28，梅特勒-托萊多）；水熱炭化液相產(chǎn)物的TOC 由總有機炭分析儀（vario TOC select）測量；發(fā)酵液的總氨氮濃度（total nitrogen ammonia concentration，TAN）由全自動凱氏氮分析儀（K9860 Hanon）測定；COD 使用多功能水質分析儀（LY-4DA）根據(jù)重鉻酸鉀氧化法測定；水熱液相產(chǎn)物和發(fā)酵液里的呋喃及其衍生物使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）（GC6890/MS5973N，安捷倫）測定；揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid concentration, VFA）使用高效液相色譜儀（1260，安捷倫）定量測量。

1.5 微生物群落

通過Miseq平臺測序分析第25天厭氧發(fā)酵液中細菌和古菌群落的分布。使用E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒從厭氧消化漿液樣本中提取基因組DNA，利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應應加DNA量。對細菌和古菌進行PCR 擴增，細菌的PCR 擴增需要兩輪，第一輪PCR 擴增所用的引物已經(jīng)融合了測序平臺的16SV3-V4引物，第二輪擴增引入Illumina 橋式PCR 兼容引物。古菌引用巢式PCR 擴增有三輪：第一輪使用GU1ST-340F、GU1ST-1000R引物擴增；第二輪使用第一輪PCR產(chǎn)物進行擴增，PCR 所用的引物已經(jīng)融合了測序平臺的V3-V4 通用引物；第三輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR 擴增完成后，將得到的樣品利用Illumina MiSeq平臺進行測序并利用數(shù)據(jù)庫進行匹配分析。

2 結果與討論

2.1 水熱炭化水相產(chǎn)物

如表2 所示，在200℃的條件下，隨著保溫時間的延長，水熱液相的pH 從4.00 波動到3.68，TOC的含量從877.66mg/L上升到963.04mg/L，表明在水熱過程中隨著停留時間的增加，水相中總有機碳含量增加，同時酸性物質含量增加。將溫度升高到230℃時，水熱液相的pH降低到2.84，TOC含量上升到1994.52mg/L，表明水熱溫度升高加速了纖維素的解聚，使更多有機物進入到了液相之中。

表2 纖維素水熱炭化液相的特性

從表2中可以看出，隨著保溫時間延長，糠醛和5-羥甲基糠醛的總含量從41.23% 上升到55.86%，當溫度從200℃升高到230℃，糠醛和5-羥甲基糠醛的總含量從44.98%上升到76.99%?？啡┖?-羥甲基糠醛是常見的呋喃醛，來源于戊糖和己糖在木質纖維素生物質的預處理和水解過程中脫水[14]。研究表明水熱炭化液相的呋喃及其衍生物會抑制水解細菌及產(chǎn)甲烷細菌的生長，不利于厭氧發(fā)酵過程的進行[12]。

2.2 混合發(fā)酵產(chǎn)氣過程

圖1是水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合發(fā)酵的累計甲烷產(chǎn)量和日產(chǎn)甲烷量。由圖1(a)可知，水熱炭化液相與玉米秸稈混合發(fā)酵、單發(fā)酵相比，累計產(chǎn)氣量有了明顯的提升，在200℃保溫30min、60min、120min的條件下產(chǎn)氣量分別提升了7.32%、4.42%、22.08%，在230℃保溫60min的條件下提升了21.76%。厭氧消化前5天，水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵實驗組的甲烷累積產(chǎn)氣量明顯高于秸稈單發(fā)酵的實驗組，這表明纖維素水熱炭化液相的加入提高了混合基質啟動階段的產(chǎn)甲烷速率[15]，200℃條件下的水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實驗組的啟動速率早于230℃水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實驗組，表明較高濃度的呋喃及其衍生物在發(fā)酵初期對產(chǎn)氣產(chǎn)生了不利影響。厭氧發(fā)酵的第5～10天，5個實驗組甲烷的產(chǎn)氣量都較低，此階段處于厭氧發(fā)酵的水解產(chǎn)酸階段，發(fā)酵系統(tǒng)的環(huán)境不利于產(chǎn)甲烷菌的生長是產(chǎn)氣較低的主要原因[16-17]。在厭氧消化的第10～30天，甲烷產(chǎn)量快速積累，其中H4 組在此階段累積產(chǎn)氣量最高，達到了總產(chǎn)氣量的69.76%，CS 單發(fā)酵實驗組在此階段的甲烷累積產(chǎn)氣量占總產(chǎn)氣的46.05%，H1、H2、H3混合發(fā)酵實驗組的甲烷產(chǎn)氣量在此階段超過了秸稈單發(fā)酵的實驗組CS 實驗組，它們在此階段的甲烷產(chǎn)氣量分別達到了總產(chǎn)氣量的53.45%、54.59%、51.75%；而在厭氧消化的第15～20 天，H1、H2、H3 的甲烷產(chǎn)氣量低于CS，表明200℃的條件下水熱液在厭氧發(fā)酵前期對厭氧發(fā)酵產(chǎn)生了不利的影響，可能的原因是該條件下水熱液中的抑制物在前期抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，但這種抑制很輕微，在第20 天左右200℃條件下的混合發(fā)酵實驗組甲烷累積產(chǎn)氣量超越了秸稈單發(fā)酵實驗組，也證明了抑制不會一直存在；水熱液相的加入明顯加速了厭氧發(fā)酵過程的進行，使甲烷在厭氧發(fā)酵的中期獲得更高的累積量。在厭氧發(fā)酵的第30～60天，CS實驗組在第30～35天甲烷產(chǎn)量依舊有明顯的上升趨勢，混合發(fā)酵實驗組在第30天以后產(chǎn)氣量逐漸降低，其中H4實驗組的甲烷累積量僅為總產(chǎn)氣量的9.89%，表明水熱炭化液相添加可有效縮短玉米秸稈發(fā)酵時間。最終秸稈單發(fā)酵實驗組的甲烷累積產(chǎn)量為1136mL，混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3、和H4 的甲烷累積產(chǎn)量分別達到了1218mL、1186mL、1387mL和1383mL。

圖1 甲烷產(chǎn)氣量

由圖1(b)可知，在厭氧發(fā)酵的前10天，甲烷的產(chǎn)氣速率總體較低；在發(fā)酵第10～30 天，H4 實驗組首先進入發(fā)酵過程的產(chǎn)氣高峰且峰值最高。CS組產(chǎn)氣高峰開始時間略早于H1、H2、H3實驗組但峰值比其他實驗組低，其中H4 首先進入產(chǎn)氣高峰的原因可能為水熱液相中較高的酸性物質含量促進了厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷階段的進行。混合發(fā)酵與秸稈單發(fā)酵實驗組相比，產(chǎn)氣高峰的結束時間明顯早于秸稈單發(fā)酵實驗組，峰值也明顯高于秸稈單發(fā)酵實驗組。在厭氧發(fā)酵的第30～60天，混合發(fā)酵實驗組的產(chǎn)氣高峰已經(jīng)基本結束，而秸稈單發(fā)酵實驗組CS的產(chǎn)氣高峰一直持續(xù)到第35天左右，比混合發(fā)酵實驗組延長了至少5 天。H4 實驗組在此階段產(chǎn)氣速率較低，而H1、H2、H3在此階段依舊有小的產(chǎn)氣高峰，H3 實驗組在此階段的產(chǎn)氣高峰明顯高于其他實驗組。

由最終累計甲烷產(chǎn)量和日產(chǎn)甲烷量可知，纖維素水熱炭化液相中抑制物對厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的負面作用并不明顯，在厭氧發(fā)酵過程中，糠醛和5-甲基糠醛二者同時存在時糠醛會被優(yōu)先轉化[18]，5-甲基糠醛含量最高的H4 實驗組的產(chǎn)氣總量最高且產(chǎn)氣高峰到來得最早，表明厭氧消化過程可以在早期就將發(fā)酵系統(tǒng)中的呋喃及其衍生物分解，解除其抑制作用并轉化為甲烷。混合發(fā)酵與秸稈單發(fā)酵相比，產(chǎn)氣效果有了明顯的提升，且其甲烷產(chǎn)氣高峰結束時間提前秸稈單發(fā)酵實驗組至少5天。

2.3 混合發(fā)酵過程中發(fā)酵液

2.3.1 發(fā)酵液有機物

表3顯示了第10天不同的水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵液中主要有機成分的半定量分析。在H1、H2、H3實驗組發(fā)酵液中，并沒有發(fā)現(xiàn)呋喃類化合物，在230℃的條件下水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實驗組提取的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了3.01%呋喃衍生物1-(呋喃基)乙二醇，表明呋喃類化合物可以在厭氧消化過程中被轉化為其他有機物，進而被降解。結合產(chǎn)氣過程發(fā)現(xiàn)，該反應過程在厭氧發(fā)酵的前期和中期完成，呋喃類化合物對混合發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程抑制并不明顯。有研究顯示，較高的呋喃及其衍生物濃度對發(fā)酵產(chǎn)生負面影響時，可能導致厭氧消化速率降低，發(fā)酵時間延長，甲烷收率降低；然而，當呋喃及其衍生物濃度較低時，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物可以將其作為碳源進行轉化和利用，進而促進甲烷的產(chǎn)生[19]。從甲烷總產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速率可知，在發(fā)酵過程中，水熱炭化液相中的呋喃及其衍生物可以作為碳源被分解轉化為甲烷，纖維素水熱炭化產(chǎn)生的抑制物濃度對厭氧發(fā)酵的抑制效果并不明顯，進一步表明混合厭氧發(fā)酵稀釋了抑制物對厭氧發(fā)酵的影響。

表3 第10天厭氧發(fā)酵提取液的特性（相對峰面積，%）

VFA 是厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要有機物，為探究不同條件下水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵過程中物質變化，對發(fā)酵過程中乙酸、丙酸、丁酸三種VFA進行了進一步定量分析，如圖2所示。

圖2 揮發(fā)性脂肪酸濃度

在厭氧發(fā)酵的第5 天，H3 實驗組的VFA 總量最高，其次是H1 實驗組，CS、H2、H4 實驗組沒有較大的差別，此時乙酸的累積量明顯高于丙酸和丁酸，但VFA 的總量較低，甲烷產(chǎn)氣量也相對較低。在第10 天左右VFA 總含量達到了最高，并且CS 實驗組VFA 的累積量高于混合發(fā)酵實驗組，一般情況下，VFA 的積累反映了酸生產(chǎn)者和分解者之間的不平衡[20]，其中乙酸的大量積累表明發(fā)酵系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷菌不夠活躍，研究表明當反應器內VFA 大于10mL/L 時，會抑制產(chǎn)甲烷菌活性[17]，這也是第5～10 天甲烷累積量較低的原因之一。在第10～25 天，大量的VFA 被消耗，其中H1、H2、H3實驗組的VFA 含量持續(xù)降低，VFA 的消耗量超越積累量，表明此時的產(chǎn)甲烷菌分解酸產(chǎn)甲烷的速度超越了水解菌水解產(chǎn)酸的速度[21]；而CS和H4實驗組VFA 的含量在第10～15天下降明顯，但在第15～20 天出現(xiàn)了回升，CS 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能為產(chǎn)甲烷菌分解酸產(chǎn)甲烷的速度落后于水解菌水解產(chǎn)酸的速度。而H4 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因為：在其產(chǎn)氣高峰后，甲烷菌消耗大量乙酸導致系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷基質相對含量不足，產(chǎn)甲烷速率變緩，水解菌繼續(xù)工作將底物水解，VFA 含量上升。數(shù)據(jù)顯示乙酸的大量消耗時間與甲烷的產(chǎn)氣高峰時間幾乎吻合，表明發(fā)酵過程中乙酸轉變?yōu)榧淄槭钱a(chǎn)氣的主要路徑。秸稈單發(fā)酵實驗組CS 的VFA 累積量在此階段明顯高于混合發(fā)酵實驗組，表明混合發(fā)酵實驗組在此階段VFA 的轉化效率要高于秸稈單發(fā)酵實驗組，可能的原因是水熱液相的加入促進了部分產(chǎn)甲烷菌的生長。厭氧發(fā)酵第35～60天，此時處于厭氧發(fā)酵的后期，VFA 的總含量明顯降低，甲烷累積產(chǎn)氣量相對較低，乙酸含量也處于較低的水平，表明發(fā)酵系統(tǒng)中的基質已經(jīng)消耗殆盡；丁酸的含量在整個厭氧發(fā)酵過程中未發(fā)生大的波動，可能的原因是發(fā)酵過程中缺乏將丁酸轉化的細菌。H3、H4實驗組在厭氧發(fā)酵后期VFA 出現(xiàn)了輕微積累，對應H3 實驗組在第40 天左右迎來一個小的產(chǎn)氣高峰，H4 實驗組的產(chǎn)氣量卻沒有明顯的增長，可能的原因是H4實驗組的有機質已消耗殆盡。

2.3.2 氨氮、pH、COD

圖3 為發(fā)酵系統(tǒng)中pH、氨氮濃度和化學需氧量在發(fā)酵過程中的變化趨勢。如圖3(a)所示，在厭氧發(fā)酵前期pH 總體呈下降趨勢，第10 天左右pH達到最低，之后開始回升，到第20 天左右保持穩(wěn)定，至發(fā)酵結束一直維持在7.7～8.2 的范圍內。混合發(fā)酵實驗組與秸稈單發(fā)酵實驗組相比，在厭氧消化前10 天，H1、H2、H3 的pH 明顯低于秸稈單發(fā)酵實驗組；在厭氧發(fā)酵第20～55 天pH 保持穩(wěn)定后各實驗組沒有出現(xiàn)較大的差距。如圖3(b)所示，H1、H2、H3 和CS 的氨氮濃度在厭氧發(fā)酵過程中總體呈上升趨勢，而H4 實驗組氨氮濃度保持相對穩(wěn)定。在厭氧發(fā)酵前15 天，混合發(fā)酵實驗組的氨氮濃度高于秸稈單發(fā)酵實驗組，其中H4 實驗組氨氮濃度在前10 天明顯領先于其他實驗組，厭氧微生物分解有機物的同時可以將有機物中的有機氮轉化為無機氮[22]，H4 氨氮濃度領先于其他實驗組的原因可能為230℃條件下水熱液的加入對秸稈厭氧發(fā)酵前期水解速度的促進作用最好。在第20～35 天，各實驗組的氨氮濃度保持相對穩(wěn)定，沒有較大差距；在第35～45天，H1、H2、H3和CS實驗組濃度出現(xiàn)了提升，而H4 實驗組氨氮濃度出現(xiàn)了小幅度的下滑，表明H4 中銨態(tài)氮轉化為其他物質（可能被微生物利用轉變?yōu)橛袡C氨，在此階段H4的VFA 和COD 含量有明顯的下降趨勢，表明產(chǎn)甲烷菌在正常工作。）。H1、H2、H3實驗組的氨氮濃度的上升趨勢相似，表明混合發(fā)酵過程中水熱液相的保溫時間對氨氮濃度影響并不明顯。

圖3 pH、氨氮濃度和化學需氧量在發(fā)酵過程中的變化趨勢

如圖3(c)所示，COD在厭氧發(fā)酵初期主要呈上升趨勢，在中后期開始呈下降趨勢；其中混合發(fā)酵實驗組在5天左右開始下降，而秸稈單發(fā)酵實驗組在15 左右開始有明顯的下降。發(fā)酵系統(tǒng)中主要有機物成分為碳水化合物，在厭氧發(fā)酵第5～10 天，水解產(chǎn)生大量VFA、還原性糖和氨基酸等小分子物質[23]，VFA 快速累積是整個發(fā)酵系統(tǒng)pH 下降明顯的主要原因，而CS 實驗組在第5 天的VFA 濃度高于混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3，pH 卻低于混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3，原因可能為CS 實驗組較高的氨氮濃度緩沖了VFA 的作用；在厭氧發(fā)酵第10～25 天，pH 和氨氮濃度保持相對穩(wěn)定，COD 有明顯的下降趨勢，COD 的下降表明產(chǎn)甲烷菌將發(fā)酵系統(tǒng)中的基質轉化為甲烷；在厭氧發(fā)酵的25～55 天，pH 依舊趨于穩(wěn)定，氨氮濃度在此期間有了明顯的升高，仍遠低于產(chǎn)甲烷微生物的抑制值1.7g/L[24]，化學需氧量總體仍呈下降趨勢，表明發(fā)酵系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷基質持續(xù)減少，基質中的含碳有機物被甲烷產(chǎn)氣菌分解產(chǎn)氣，氨氮含量開始累積，導致整個系統(tǒng)的C/N比失衡，這可能是厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣在后期停滯的原因之一。

2.4 微生物群落

圖4為第25天通過對厭氧發(fā)酵提取液進行測序獲得的細菌在門和屬水平上的相對豐度。

圖4 細菌相對豐度

圖4(a)為第25 天時細菌在門水平上的相對豐度，由圖4(a)可知，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中細菌群落最主要的兩個門是Bacteroidetes和Firmicutes。在秸稈單發(fā)酵實驗組CS 中，Bacteroidetes和Firmicutes占整個細菌群落總量的83.58%；在秸稈與水熱炭化液相混合發(fā)酵實驗組中，H1、H3 和H4 實驗組和CS實驗組相比，Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度有所提升，達到89.05%、86.53%、96.18%，而H2和CS相比，Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度下降，為74.09%。Bacteroidetes和Firmicutes作為厭氧消化過程中最重要的兩個門，它們可將有機物水解為乙酸、氫氣和二氧化碳等小分子物質，從而產(chǎn)生甲烷[25]。H4實驗組的Bacteroidetes和Firmicutes相對豐度明顯高于其他實驗組，也印證了230℃的條件下的纖維素水熱液相可以促進水解菌的生長，解釋了H4產(chǎn)氣高峰領先于其他實驗組的原因。

圖4(b)為第25天時細菌在屬水平上的相對豐度。玉米秸稈單發(fā)酵實驗組和混合發(fā)酵實驗組中細菌的種類差別較小，但其相對豐度卻存在明顯差別。秸稈單發(fā)酵的實驗組Firmicutes在屬級別的主要細菌為unclassified_Clostridiales（11.18%）、Lysinibacillus（5.18%）、unclassifiedLachospiraceae（2.25%）、Tissierella（2.56%）、Sedimentibacter（2.27%）、Clostridium_III（1.29%）。秸稈和水熱液相混合發(fā)酵實驗組中，Clostridium_III 在H1、H2、H3、H4的相對分度分別為0.89%、1.67%、0.21%、1.59%；由已有的研究得知，Clostridium_III 可以將糠醛和5-羥甲基糠醛轉化為糠基醇和5-羥甲基糠醛醇[26]，因此在H4實驗組發(fā)酵液有機物分析中發(fā)現(xiàn)了1-(呋喃基)乙二醇，1-(呋喃基)乙二醇被進一步分解為小分子有機物并最終轉化為甲烷，第10 天時在其他實驗組未發(fā)現(xiàn)呋喃及其衍生物與呋喃醇，表明濃度較低的呋喃類有機物在前期已經(jīng)被轉化為甲烷。Tissierella和Sedimentibacter屬于Clostridiales_Incerta e_Sedis_XI，Tissierella在加入水熱炭化廢液的實驗組H1、H2、H3、H4相對豐度分別為4.09%、8.09%、3.17%、7.71%，除了H3實驗組外，其相對豐度與CS 實驗組相比都有明顯的提升；Sedimentibacter可以將有機物發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳、氫和乙酸等，其在水熱炭化液相與玉米秸稈混合發(fā)酵實驗組H2和H4中相對豐度有所提升，分別達到了2.34% 和2.61%；H1 和H3 中此菌屬的相對豐度有所下降，分別為1.55%和1.31%。水熱液相的加入明顯促進了Tissierella的生長，該細菌可以將基質中的糖、氨基酸、脂肪酸等有機物分解，產(chǎn)生乙酸、氨鹽和二氧化碳，是混合基質中產(chǎn)乙酸的主要微生物之一[27]。

UnclassifiedLachospiraceae在加入水熱炭化液相的實驗組H1、H2、H3、H4中，其相對豐度分別為0.87%、0.48%、0.32%、3.57%，除H4 外其他實驗組該菌屬的相對豐度明顯減少，表明水熱炭化液相的加入抑制了該菌屬的生長。Lysinibacillus屬于Planocospiraceae，在混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3、H4 相 對 豐 度 為4.48%、4.40%、23.91%、1.82%，H3實驗組中，水熱炭化液相的加入促進了Lysinibccillus在的生長。Lysinibacillus可以發(fā)酵糖、氨基酸、脂肪酸等基質，產(chǎn)生己酸[28]，其厭氧消化的基質與Clostridiales_Incertae_Sedis_XI 相似，二者存在競爭機制；然而Lysinibccillus發(fā)酵產(chǎn)物為己酸，因此Clostridiales_Incertae_Sedis_XI 更有利于產(chǎn)氣，H3 的產(chǎn)氣滯后于其他實驗組及丁酸含量明顯高于其他實驗組的原因即Lysinibccillus在競爭中處于優(yōu)勢地位。Bacteroidetes中的主要細菌為unclassified_Porphyromonadaceae，在秸稈單發(fā)酵實驗組CS 中，unclassified_Porphyromonadaceae的相對豐度為43.02%，在水熱液相與秸稈混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3、H4 中，該菌屬的比例分別為50.86%、32.02%、43.12%、53.58%，其相對豐度除H2 之外皆超過了秸稈單發(fā)酵實驗組CS，表明水熱液相的加入可以促進unclassified_Porphyromonadaceae的生長。該菌屬可以參與復雜碳水化合物、蛋白質和多肽的厭氧降解，并在水解階段參與揮發(fā)性脂肪酸的生成[29]。unclassified_Porphyromonadaceae作為最重要的水解細菌，在厭氧發(fā)酵過程中起著至關重要的作用。

圖5為第25天通過對發(fā)酵提取液進行測序獲得的古菌屬水平上的相對豐度。Methanosarcina是古菌中的優(yōu)勢菌屬，Methanosarcina屬于乙酸產(chǎn)甲烷途徑，它可以將發(fā)酵系統(tǒng)中的乙酸還原為甲烷[30]，在秸稈單發(fā)酵實驗組CS中，Methanosarcina的相對豐度為94.21%；在混合發(fā)酵實驗組中，H1、H2、H3、H4 中相對豐度分別為88.01%、87.22%、76.67%、94.11%，H3 實驗組Methanosarcina相對豐度低于混合發(fā)酵其他實驗組的原因可能是H3 實驗組中Lysinibacillus的相對豐度高于其他實驗組導致丁酸含量過高，不利于Methanosarcina的生長；混合發(fā)酵H1、H2、H3 中Methanosarcina的相對豐度低于秸稈單發(fā)酵CS 實驗組表明糠醛抑制了Methanosarcina的 生 長。Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter屬于氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷途徑，秸稈單發(fā)酵 中，Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter的 相 對 豐 度 分別為2.69%、0.42%、0.72%和0.60%；混合發(fā)酵實驗組H1、H2、H3、H4 中，Methanomassiliicoccus的相對豐度為3.03%、4.47%、10.49%、1.15%，Methanobacterium的相對豐度為1.64%、1.17%、4.67%、0.90%，Methanoculleus的相對豐度為4.16%、4.27%、4.14%、1.95%，Methanobrevibacter的相對豐度為1.65%、1.38%、3.37%、0.41%?；旌习l(fā)酵H1、H2、H3 的Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter相對豐度明顯高于CS和H4實驗組，證明水熱炭化液相可以促進氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌生長。H4在第25天時古菌的相對豐度更接近秸稈單發(fā)酵實驗組，表明此時其產(chǎn)氣途徑與秸稈單發(fā)酵相同，可能的原因是H4 實驗組產(chǎn)氣高峰領先其他實驗組，在厭氧發(fā)酵前期水熱液相中的基質已經(jīng)消耗完畢，其厭氧發(fā)酵中期的發(fā)酵環(huán)境不利于氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷的生長。

圖5 古菌屬水平相對豐度

由于核心微生物群中的細菌群落和產(chǎn)甲烷菌之間的代謝相互作用，底物特異性將厭氧發(fā)酵引向特定的產(chǎn)甲烷路徑[31]。圖6為纖維素水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵過程中有機物轉化甲烷路徑圖。

圖6 纖維素水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷路徑

在厭氧發(fā)酵過程中，水熱炭化液相的加入促進了氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長。在發(fā)酵過程中，微生物在厭氧發(fā)酵過程中相互生存、相互依賴使得復雜有機物得以分解[32]，在實驗厭氧發(fā)酵過程中最主要的產(chǎn)甲烷途徑為乙酸產(chǎn)甲烷途徑，水解菌（Porphyromonadaceae） 將木質纖維素分解為小分子糖，小分子糖通過發(fā)酵細菌（Tissierella、Sedimentibacter、Lysinibacillus）將小分子有機物發(fā)酵分解為VFA （主要為乙酸），最終產(chǎn)甲烷菌（Methanobacterium）將乙酸轉化為甲烷。水熱液相的加入促進了氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷途徑，混合基質中糠醛及其衍生物可以被Clostridium_III 轉化為糠 醛 醇， 糠 醛 醇 通 過 細 菌 （Tissierella、Sedimentibacter）還原為氫氣和二氧化碳，最終通過氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter）將氫氣和二氧化碳轉化為甲烷。此過程中不同功能的微生物相互作用，相互依賴[33]，共同促進產(chǎn)氣。

3 結論

（1）纖維素水熱炭化液相和秸稈混合發(fā)酵與秸稈單發(fā)酵相比，產(chǎn)氣量有明顯的提高，在200℃保溫30min、60min、120min 的條件下產(chǎn)氣分別提升了7.32%、4.42%、22.08%，在230℃保溫60min 的條件下提升了21.76%；表明在一定范圍內，水熱炭化溫度升高和保溫時間延長獲得的水熱炭化液相對甲烷產(chǎn)氣具有正向的促進作用。

（2）水熱炭化液相中的有機物可以提高混合發(fā)酵厭氧消化潛力，纖維素水熱廢液中的呋喃及其衍生物在濃度較低的情況下對厭氧發(fā)酵過程并不會產(chǎn)生明顯的抑制作用。

（3）微生物群落分析表明，纖維素水熱炭化液相和秸稈厭氧共消化可以促進氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長，協(xié)同乙酸產(chǎn)甲烷途徑，促進了甲烷生產(chǎn)。同時微生物群落中存在Clostridium_III，可以將糠醛和5-羥甲基糠醛轉化為糠基醇類有機物，促進產(chǎn)氣。