王煬坤,紀(jì)世新,蘇瑩瑩,孫英旗,宋相偉

(長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130032)

CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種原核生物適應(yīng)性免疫機制,用于清除外源的核酸,從而在原核生物中獲得抵抗病毒的能力[1]。CRISPR-Cas系統(tǒng)由兩部分組成:在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列[2](Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)。該系統(tǒng)可以分為兩大類,分別為Class1和Class2[3]。Class1需要多個效應(yīng)蛋白組合作用才能完成靶向剪切功能;Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型,只需要單個效應(yīng)蛋白就可以完成靶向剪切作用。Class2因具有簡單性而被廣泛使用[4]。它們均通過向?qū)NA(guide RNA,gRNA)識別靶標(biāo)的原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM),進(jìn)而對靶標(biāo)起作用。本文對Class2中應(yīng)用最廣泛的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的作用機制及其應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行闡述,并對二者進(jìn)行比較。

1 Cas9與Cas12a的作用機制比較

1.1 PAM識別位點不同

PAM是前間隔序列的5′或3′端延伸幾個堿基構(gòu)成的十分保守的序列,長度一般為2～5 bp。PAM可以使CRISPR-Cas系統(tǒng)區(qū)分自身的核酸和外源的核酸[5],避免CRISPR-Cas系統(tǒng)出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)。

PAM存在于靶標(biāo)DNA雙鏈中,Cas9能夠識別富G序列5′-NGG-3′,通過Cas9羧基端保守的精氨酸殘基的主溝與非互補鏈的GG二核苷酸相互作用識別[6]。有研究表明,Cas9也能夠識別沒有PAM的RNA。 STRUTT等[7]證明,在Cas9亞型中,空腸彎曲桿菌Cas9(CjCas9)可以不依賴靶標(biāo)RNA分子中的PAM位點,直接利用RNA-RNA相互作用,從而識別RNA。使得CRISPR-Cas9直接靶向RNA成為可能,進(jìn)一步擴大了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,這表明Cas9可以對DNA和RNA病毒進(jìn)行細(xì)胞防御。

Cas12a能夠識別富T序列5′-TTTV -3′,相對于富G的Cas9 PAM來說,擴大了基因組靶標(biāo)的廣度[8]。KLEINSTIVER等[9]設(shè)計了一種增強型酸氨基球菌Cas12a變種(enAsCas12a)實驗,使標(biāo)準(zhǔn)PAM位點上的基因組編輯活性擴大了兩倍。除了典型的PAM外,Cas12a還可以對含C的PAM序列進(jìn)行識別,與靶標(biāo)DNA雙鏈相互作用。

1.2 gRNA的結(jié)構(gòu)不同

gRNA是一種小分子非編碼RNA[10],作用于動質(zhì)體(一種附有鞭毛的原生動物,包含某些能使人類或其他動物發(fā)生嚴(yán)重疾病的寄生蟲)體內(nèi)的RNA編輯后轉(zhuǎn)錄修飾過程。gRNA也可與前體mRNA(pre-mRNA)結(jié)合,通過在pre-mRNA中插入一定數(shù)量的U,形成成熟的mRNA。gRNA靶向結(jié)合基因組中的特定靶標(biāo)DNA序列,是CRISPR系統(tǒng)的一個共同特性。gRNA的表達(dá)水平與基因編輯效率密切相關(guān)。

Cas9的gRNA是由反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)與CRISPR RNA(crRNA)組成的100 nt的雜合體,又稱小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)[11]。sgRNA可以識別基因組上的特定序列,而Cas9可以作為剪刀,對DNA序列進(jìn)行剪切。為了提高基因組編輯的準(zhǔn)確性,研究人員對Cas9核酸酶進(jìn)行突變,使其只能剪切靶標(biāo)DNA雙鏈中的一條鏈。通過sgRNA引導(dǎo)突變的Cas9對靶標(biāo)DNA進(jìn)行剪切,可以降低脫靶效應(yīng),提高基因組編輯的特異性。

Cas12a的gRNA僅由42 nt組成,它將自己的 pre-crRNA 加工為成熟的 crRNA,而不需要tracrRNA。它與Cas12a結(jié)合可以對靶 DNA 進(jìn)行剪切[12]。另外,對crRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,增加crRNA的穩(wěn)定性,可以提高它與Cas12a的結(jié)合能力,從而增強Cas12a的活性。

1.3 發(fā)揮功能的階段不同

CRISPR序列由前導(dǎo)序列、重復(fù)序列和間隔序列組成。CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas9和Cas12a都有獨特的適應(yīng)、表達(dá)和干擾階段(圖1)。

圖1 CRISPR-Cas9/12a的模塊化結(jié)構(gòu)

適應(yīng)階段相當(dāng)于鄰近PAM的序列的捕獲階段,細(xì)菌識別出外源DNA,利用Cas蛋白復(fù)合物與外源的靶標(biāo)DNA分子結(jié)合,導(dǎo)致其雙鏈斷裂[13]。入侵噬菌體或質(zhì)粒的短DNA片段(原間隔序列)整合在CRISPR位點前導(dǎo)序列的末端,產(chǎn)生新的間隔序列。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,Cas9-tracrRNA復(fù)合物與Csn2和Cas1-Cas2構(gòu)成的復(fù)合物一起參與間隔序列的獲取,而在CRISPR-Cas12a系統(tǒng)采用Cas12a、Cas1、Cas2和Cas4獲取間隔物。

表達(dá)階段是crRNA的合成和表達(dá),CRISPR序列連同間隔序列被轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA。pre-crRNA的加工通常會產(chǎn)生30～65 nt的成熟crRNA,這些成熟crRNA只包含一個間隔[14]。它們與一個或多個Cas蛋白結(jié)合形成效應(yīng)復(fù)合物,對靶序列進(jìn)行特異性識別,負(fù)責(zé)CRISPR-Cas免疫特異性的向?qū)10]。在 Cas9系統(tǒng)中,pre-crRNA 表達(dá)由嵌入在CRISPR序列中的富含AT的前導(dǎo)序列的啟動子控制。與pre-crRNA 具有互補序列的tracrRNA是加工pre-crRNA所必需的。靶標(biāo)DNA被Cas9特異性識別,并被內(nèi)源性RNaseⅢ進(jìn)一步切割[15]。然后,由核酸酶修剪crRNA的5′端,形成成熟的crRNA。同時,可以人為地將crRNA和tracrRNA結(jié)合為 sgRNA進(jìn)行基因編輯。與Cas9系統(tǒng)不同,Cas12a負(fù)責(zé)pre-crRNA的加工,而不需要tracrRNA與pre-crRNA的共同作用就可產(chǎn)生成熟的crRNA[8]。Cas12a在不需要tracrRNA的情況下,將其自身的前crRNA加工為成熟的crRNA,使其成為一種具有核糖核酸內(nèi)切酶活性的獨特效應(yīng)蛋白[16]。pre-crRNA轉(zhuǎn)錄完成后,Cas12a將其剪切到CRISPR序列中形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的上游4 nt處,產(chǎn)生中間crRNA分子,中間crRNA分子在體內(nèi)進(jìn)一步加工為成熟crRNA[17]。

在干擾階段中,crRNA和Cas蛋白整合成一個復(fù)合物,利用crRNA識別靶標(biāo)DNA或RNA,從而激活復(fù)合物的切割活性,使宿主細(xì)胞免受感染[2]。Cas9和Cas12a作為核酸酶(圖2),在干擾過程中起著關(guān)鍵作用。Cas9包含RuvC和HNH兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域,這兩個結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)在crRNA-target DNA復(fù)合物中移位和靶標(biāo)DNA鏈的剪切。HNH核酸酶可以剪切靶標(biāo)DNA;RuvC核酸酶可以分裂成RuvC-Ⅰ、RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ亞結(jié)構(gòu)域,并剪切非靶標(biāo)DNA[18]。Cas12a的氨基酸序列只包含一個RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域[19]。Cas12a、crRNA和靶標(biāo)DNA構(gòu)成的復(fù)合物,在結(jié)構(gòu)上揭示了具有獨特折疊的核酸酶結(jié)構(gòu)域,在功能上類似于Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域。

圖2 效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)域

1.4 剪切靶標(biāo)的機制不同

CRISPR-Cas作為一種分子剪刀,可以特異性地識別外源核酸并利用Cas蛋白剪切靶標(biāo)DNA序列,從而實現(xiàn)對自身的免疫(圖3)。

圖3 CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的剪切方式

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,Cas9與sgRNA相互作用。Cas9識別PAM序列后,靶標(biāo) DNA 解開雙鏈,sgRNA和DNA 互補結(jié)合。當(dāng)DNA與sgRNA結(jié)合完成后,Cas9在HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域的催化位點上剪切靶標(biāo)DNA,產(chǎn)生平末端的雙鏈斷裂[20]。

在CRISPR-Cas12a系統(tǒng)中,利用crRNA引導(dǎo)的Cas12a作用于非靶標(biāo)單鏈DNA和靶標(biāo)雙鏈DNA[8]。Cas12a在crRNA的引導(dǎo)下識別含PAM的靶標(biāo)雙鏈DNA,使其解鏈。靶標(biāo)雙鏈中的一條鏈與crRNA形成環(huán)狀復(fù)合體,進(jìn)而釋放出Cas12a中的RuvC的活性位點,使得靶標(biāo)DNA解旋后被剪切。當(dāng)Cas12a完成對靶標(biāo)DNA的剪切后,會激活Cas12a反式裂解單鏈DNA的無差別切割活性[21]。

2 Cas9和Cas12a在診斷領(lǐng)域與治療領(lǐng)域中的作用比較

2.1 Cas9主要應(yīng)用治療領(lǐng)域

癌基因的調(diào)控方式與正?；虿煌?可促進(jìn)正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。CRISPR-Cas9系統(tǒng)為改變癌基因活性提供了有效的措施,從而抑制腫瘤生長,為有效治療腫瘤奠定了堅實的基礎(chǔ)。

GAO等[22]評估了CRISPR-Cas9系統(tǒng)對宮頸癌前病變的治療效果,發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9在抑制宮頸癌前病變細(xì)胞系的細(xì)胞生長和集落形成以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面表現(xiàn)出了特異性。在K14-HPV16轉(zhuǎn)基因小鼠HPV驅(qū)動的自發(fā)性宮頸癌變模型中,應(yīng)用CRISPR-Cas9處理可導(dǎo)致E7基因突變,并恢復(fù)RB、E2F1和CDK2的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)宮頸癌變表型,證明了當(dāng)CRISPR-Cas9靶向HPV16 E7時,可以有效逆轉(zhuǎn)HPV相關(guān)的體外宮頸癌變以及K14-HPV16轉(zhuǎn)基因小鼠的宮頸癌變,在宮頸癌前病變的臨床治療中顯示出巨大潛力。LIU等[23]開發(fā)了一種名為CRISPReader的技術(shù),可以有效控制靶向轉(zhuǎn)基因和翻譯。他們利用 CRISPReader技術(shù)對基因電路進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化,將基因電路微型化和簡單化,并構(gòu)建了介導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞中基因表達(dá)的微型基因回路。通過調(diào)控CRISPR-Cas9介導(dǎo)的腫瘤抑制基因hBax、E-cadherin和p21,有效抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖,降低了細(xì)胞活力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

心血管疾病(CVD)是全球死亡的主要原因,占2019年死亡總?cè)藬?shù)的32%。Cas9可降低低密度脂蛋白膽固醇水平,加強對心血管疾病的預(yù)防。

堿基編輯器是由CRISPR-Cas9與胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域組成的,它能以序列特異的方式將基因組DNA 中的胞嘧啶堿基改變?yōu)樾叵汆奏A基,而無須雙鏈DNA斷裂?？茖W(xué)家們將其植入成年小鼠的肝臟,以評估它是否能在Pcsk9(9型枯草蛋白酶)基因中引入位點特異性無義突變。這導(dǎo)致了成年小鼠血漿PCSK9蛋白水平大幅降低,血漿膽固醇水平也有一定程度的降低[24]。研究人員通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因整合技術(shù),將LEF1基因?qū)氲?9號染色體上。結(jié)果證明LEF1/hUCB間充質(zhì)干細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的增殖和存活率提高。這項研究表明,干細(xì)胞療法與促進(jìn)細(xì)胞存活的轉(zhuǎn)錄因子LEF1基因組編輯相結(jié)合,可成為心血管疾病的有效治療策略[25]。

2.2 Cas12a主要應(yīng)用診斷領(lǐng)域

CRISPR-Cas12a與其他技術(shù)相結(jié)合,可以實現(xiàn)快速即時檢測,在病毒檢測方面具有極大的前景。

CHEN等[26]的團隊研發(fā)了一個基于CRISPR的DNA診斷平臺,命名為“DETECTR”。它結(jié)合等溫擴增技術(shù)(LAMP/RPA),可以快速、準(zhǔn)確地檢測出臨床相關(guān)的HPV。LIU等[27]利用Cas12a反式裂解單鏈DNA活性的能力,結(jié)合亞甲基藍(lán)標(biāo)記的單鏈DNA,同時利用帶負(fù)電荷的氧化銦錫電極,制作了一個簡單、無固定化、靈敏度高、均勻的電化學(xué)生物傳感器,用于檢測HPV。MAYURAMART等[28]結(jié)合RT-RPA和CRISPR-Cas12a技術(shù)檢測流感病毒和SARS-CoV-2,靈敏度高、特異性強,是檢測流感病毒和SARS-CoV-2的有效方法,并可用于其他傳染病的檢測。

食品安全直接關(guān)系到廣大人民群眾的身體健康和生命安全[29]?；贑RISPR-Cas12a系統(tǒng)的熒光傳感技術(shù)從疾病診斷擴展到食品安全監(jiān)測領(lǐng)域,為食品安全檢測提供了一種新策略。

副溶血性弧菌廣泛存在于海產(chǎn)品中,該菌可引致腸袢腫脹、充血和腸液潴留,引起腹瀉。ZHANG等[30]將副溶血弧菌特殊熱嗜性溶血素基因的一段序列作為靶標(biāo),設(shè)計出相應(yīng)的crRNA,將CRISPR-Cas12a系統(tǒng)預(yù)裝在試管蓋內(nèi),然后對提取的蝦樣品進(jìn)行PCR擴增。離心混合試劑后在37 ℃反應(yīng)5～10 min,可在紫外光下肉眼讀取結(jié)果,該方法推進(jìn)了其在食品安全保障領(lǐng)域的應(yīng)用。BONINI等[31]建立了一種基于CRISPR-Cas12a的無標(biāo)記阻抗生物傳感方法,用于檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。電化學(xué)阻抗光譜法可以靈敏而強大地檢測電極表面微小的物理和化學(xué)變化。修飾電極上的ssDNA會阻礙電極與溶液之間的電子交換。當(dāng) CRISPR-Cas12a識別到目標(biāo)細(xì)菌的特定序列時,就會開啟ssDNA的裂解模式,導(dǎo)致電荷轉(zhuǎn)移電阻下降。該方法不僅可以縮短檢測時間,還在食品安全、公共衛(wèi)生安全中具有較高的應(yīng)用價值。

3 展望

基因組信息在醫(yī)療、傳染病預(yù)防和其他許多醫(yī)療實踐中變得越來越重要。根據(jù)已經(jīng)報道的方法,CRISPR技術(shù)不僅在哺乳動物細(xì)胞的基因組編輯和基因調(diào)控中被廣泛應(yīng)用,而且在遺傳性疾病治療方面顯示出驚人的發(fā)展?jié)摿?。對CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a進(jìn)行區(qū)分,有助于其相關(guān)技術(shù)更好地應(yīng)用。目前,CRISPR介導(dǎo)的基因組工程的核心是Cas9,但其可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)制約了它的發(fā)展。因與Cas9具有巨大差異,Cas12a已成為一種可供選擇的分子基因組編輯工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a技術(shù)的應(yīng)用已趨于成熟,但其臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步完善。如今,Cas12f、Cas13a也逐漸進(jìn)入人類的視野。盡管CRISPR診斷工具已經(jīng)顯示出明顯的進(jìn)步跡象,但由于新興技術(shù)轉(zhuǎn)化為實踐的復(fù)雜性,CRISPR的臨床用途、商業(yè)試劑盒和設(shè)備較少。伴隨著新開發(fā)的應(yīng)用的出現(xiàn)和更多Cas同源物的發(fā)現(xiàn),CRISPR技術(shù)已經(jīng)被用來促進(jìn)人類健康服務(wù)診斷,在醫(yī)療方面做出了巨大貢獻(xiàn)。