鄧慧玉，劉子愷 ，馬星竹，郝小雨，趙 月，沈菊培，賀紀(jì)正

(1.福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院/碳中和未來技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350117；2.黑龍江省黑土保護(hù)利用研究院，黑龍江 哈爾濱 150086)

施肥是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的主要管理措施，對糧食增產(chǎn)起著舉足輕重的作用。大量化肥的輸入，如氮(N)和磷(P)肥，會改變土壤養(yǎng)分含量[1]，影響土壤元素化學(xué)計(jì)量平衡，改變土壤微生物群落組成，而微生物群落結(jié)構(gòu)的改變反過來會影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響土壤健康和生態(tài)系統(tǒng)功能[2]。真菌是土壤微生物的重要組成部分[3]，其所分泌的酶可降解復(fù)雜的化合物。另外，真菌對外界環(huán)境的變化比細(xì)菌更為敏感[4]。因此，研究長期施肥等管理措施對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對提高土壤肥力、促進(jìn)有機(jī)質(zhì)降解、認(rèn)識作物抗病和抗逆性具有重要的意義[5-6]。

土壤微生物不僅受土壤環(huán)境變化(如土壤pH)的影響，同時(shí)還受養(yǎng)分(如氮、磷肥)輸入的影響。氮肥的長期輸入會導(dǎo)致土壤pH降低[7]，使土壤細(xì)菌數(shù)量減少，而真菌由于有較寬的pH耐受范圍，促使真菌細(xì)菌比值增加，致使多種病原真菌大量繁殖，對作物生長產(chǎn)生威脅。如Paungfoo-lonhienne等[8]發(fā)現(xiàn)施氮會降低真菌的生物量，減少多樣性，并改變土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)磷的輸入可以減緩氮對土壤真菌多樣性的負(fù)面影響，改善土壤功能[9]。但另有研究通過分析發(fā)現(xiàn)隨著磷肥施入量的增加砂姜黑土真菌多樣性顯著降低，且與土壤磷含量顯著負(fù)相關(guān)[10]?？梢姡蛄追实妮斎雽ν寥牢⑸锾貏e是真菌的影響與土壤類型、施用年限等息息相關(guān)，且兩者交互作用的影響目前還沒有定論。

東北黑土區(qū)是我國重要的商品糧生產(chǎn)基地，耕地面積和糧食總量均占全國的1/4[11]。然而，過去幾十年，由于對黑土資源的高強(qiáng)度利用，并受水土流失的影響，東北黑土地耕地質(zhì)量不斷下降，存在黑土層變薄、障礙層次增厚、土壤酸化等問題[12]。黑土質(zhì)量的大幅度下降，威脅著東北黑土地作為國家糧食安全中“壓倉石”和“穩(wěn)壓器”的作用[13]。目前對長期施肥處理下黑土土壤真菌類群的影響還不是很明確[14]。因此，選擇東北典型黑土作為研究對象，依托長期施肥定位試驗(yàn)平臺[1]，采用高通量測序的方法，探究長期氮磷施肥措施下真菌群落結(jié)構(gòu)的變化及其與土壤養(yǎng)分的關(guān)系，為黑土區(qū)退化土壤恢復(fù)和管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與樣品采集

研究樣地位于黑龍江省哈爾濱市黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地(126°35′E，45°40′N)，海拔151 m，屬松花江二級階地，地處中溫帶，一年一熟制，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，≥10 ℃平均有效積溫2 700 ℃，年均日照時(shí)數(shù)2 600～2 800 h，年降雨量533 mm，無霜期約135 d。試驗(yàn)地為旱地黑土，成土母質(zhì)為洪積黃土狀粘土。1980年開始按小麥-大豆-玉米順序輪作[15]。

研究選擇長期樣地4種施肥處理，即施氮(N)、施磷(P)、氮磷混施(NP)和不施肥(CK)，3次樣方重復(fù)，一共12個(gè)樣方，每個(gè)樣方36 m2。每年肥料施用量分別為 N 15 g·m-2(小麥和玉米季)和 7.5 g·m-2(大豆季)，P2O57.5 g·m-2(小麥和玉米季)和 15 g·m-2(大豆季)，氮、磷均為秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施，50%于大喇叭口期追施)。氮肥為尿素(N 46%)，磷肥為重過磷酸鈣(P2O546%)、磷酸二銨(N 18%，P2O546%)。土壤樣品采集于2021年4月玉米播種季。采樣時(shí)在每個(gè)樣方的核心區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)取樣點(diǎn)，用直徑為5 cm的土鉆，取表層土壤(0～20 cm)混勻，每個(gè)處理3次重復(fù)，冰盒冰袋保鮮條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。挑去碎石及可見的植物根系，過2 mm篩后，將每個(gè)樣方的樣品分成3部分。一份保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于DNA提?。灰环葜糜? ℃冰箱冷藏，用于鮮樣指標(biāo)和土壤含水量測定；另一份風(fēng)干后，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.2 土壤理化指標(biāo)的測定

1.3 土壤DNA的提取和高通量測序

土壤總DNA的提取使用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，CA，USA)試劑盒，根據(jù)操作手冊逐步完成，并使用NanoDrop ND-2000驗(yàn)證DNA的濃度和純度。

利用特定引物ITS1F和ITS2R[17]對土壤真菌ITS片段擴(kuò)增，并在Illumina MiSeq 平臺測序，測序得到的序列使用QIIME2進(jìn)行質(zhì)量控制，去除真菌為低質(zhì)量(Qscore<25)，長度較短(< 200 bp)的片段以及模糊序列，并去除無重復(fù)以及單一無重復(fù)序列，得到相似度較高100%聚類的amplicon sequence variants(ASVs)。采用“microeco”包[18]計(jì)算真菌Shannon指數(shù)和ASV豐富度，并基于Bray-Curtis距離的beta多樣性指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析主要使用Excel 2019和SPSS 26進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析，測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，制圖和非度量多維尺度分析 (non-metric multidimensional scaling，nMDS)主要使用R語言“microeco”，“vegan”等包進(jìn)行。冗余分析(redundancy analysis，RDA)主要采用Canoco5.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期施肥對黑土理化性質(zhì)的影響

表1 長期施肥對黑土土壤性質(zhì)的影響
Tab.1 Effects of long-term fertilization on black soil properties

處理ω(NO-3)/ (mg·kg-1)ω(HN+4)/ (mg·kg-1)ω(DON)/ (mg·kg-1)ω(DOC)/ (mg·kg-1)ω(AP)/ (mg·kg-1)CK5.85±0.41b2.91±0.35b19.81±2.63c6.64±0.59b9.59±0.32dN26.26±5.70a4.61±0.64a50.13±8.94b7.28±0.74b15.01±1.43cNP26.57±0.99a5.20±1.24a67.20±10.05a8.98±0.09a104.71±4.29bP7.43±0.05b2.88±0.14b23.13±2.75c9.19±0.58a115.32±0.07a處理pHω(TC)/(g·kg-1)ω(TN)/(g·kg-1)ω(TP)/(g·kg-1)CK6.52±0.11a16.04±0.83b1.29±0.03b0.39±0.02bN5.22±0.03c16.90±0.49ab1.35±0.10ab0.38±0.07bNP5.35±0.05b17.17±0.41a1.66±0.32a0.58±0.06aP6.43±0.04a16.14±0.23b1.20±0.04b0.61±0.09a

2.2 長期施肥對黑土真菌群落多樣性和群落組成的影響

采用Illumina MiSeq 平臺對土壤真菌ITS片段開展多樣性分析，所有樣品共獲得1 331個(gè)真菌ASVs。基于ASV信息發(fā)現(xiàn)長期施肥處理對土壤α多樣性產(chǎn)生顯著影響(圖1(a)、1(b))。土壤真菌Shannon多樣性指數(shù)和ASVs數(shù)均在NP處理最低，分別為4.16和405，顯著低于其他處理(P<0.05)，而CK處理最高。利用Bray-Curtis距離基于ASVs相對豐度對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行nMDS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理間真菌類群群落結(jié)構(gòu)有顯著差異。具體表現(xiàn)為，沿著第一軸CK和P處理與N 和NP處理分開，而沿第二軸N和NP處理顯著分開，說明CK和P處理群落結(jié)構(gòu)較為相似，而N和NP與其他處理真菌群落結(jié)構(gòu)具有較低的相似性(圖1(c))。通過差異性檢驗(yàn)(ANOSIM)也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，即不同處理間真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(圖1(d))。

圖1 長期氮磷施肥處理下土壤真菌群落多樣性(a和b)和群落結(jié)構(gòu)特征(c和d)Fig.1 Soil fungal community diversity (a and b)and community structure (c and d)in long-term N and P fertilizers addition

高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤真菌類群最豐富的3個(gè)門水平類群為子囊菌門(相對豐度為63%～68%)，毛霉門(相對豐度為15%～20%)和擔(dān)子菌門(相對豐度為9.1%～15%).不同施肥處理下土壤真菌群落在綱水平豐度大于1%的主要類群為Sordariomycetes(37%～40%)，Mortierellomycetes(15%～18%)，Dothideomycetes(12%～17%)，Tremellomycetes(5.6%～14%)，Leotiomycetes(5.2%～9.4%)，Agaricomycetes(1.8%～7.6%)，Eurotiomycetes(2.9%～3.3%)，和Pezizomycetes(1.6%～2.8%)(圖2(a))。Kruskal_wallis檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mortierellomycetes(P=0.041 5)、Agaricomycetes(P=0.037 8)綱在處理間差異顯著。進(jìn)一步對不同施肥處理下土壤真菌屬水平的類群進(jìn)行分析(圖2(b))，共有16個(gè)不同真菌屬平均豐度大于1%，其中13個(gè)真菌屬為子囊菌門(占總豐度的31%～42%)，其余2個(gè)屬和1個(gè)屬分別分布在擔(dān)子菌門(占總豐度的5.3%～12.2%)和毛霉門(占總豐度的14.4%～18.7%)(圖2(b))。

圖2 不同施肥處理下真菌綱(a)和屬(b)水平主要類群的相對豐度Fig.2 The relative abundance of fungi community at class (a) and genus (b) levels in different fertilization treatments

2.3 黑土真菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子

圖3 真菌群落相對豐度和群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子Fig.3 Main factors controlling fungi community composition and structure

采用RDA分析進(jìn)一步對不同理化因子對真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析(圖3(b))，發(fā)現(xiàn)所檢測的土壤性質(zhì)對真菌群落結(jié)構(gòu)的變化都有較高的解釋率，第一和第二軸分別解釋了真菌變異的30.75%和24.66%。另外，土壤pH是解釋CK和P處理真菌群落變化的主要影響因子，而其他土壤因子則對NP處理有重要的影響。

3 討論

土壤真菌是物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要驅(qū)動者，在養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)降解和碳固定等方面發(fā)揮著重要作用[24]。經(jīng)過40年左右的施肥處理，發(fā)現(xiàn)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在不同處理間差異顯著，特別是施氮處理，這與Zhou等[14]在同一樣地施肥處理34年的研究結(jié)果一致，而與本課題組早先在黑土施肥處理后13年的研究結(jié)果不一致[25]。引起這一差異的原因主要是施肥年限的不同，說明長期耕作對黑土土壤理化性質(zhì)和微生物群落產(chǎn)生了重要的影響[26]，也從另一方面證明開展野外樣地長期定位觀測和數(shù)據(jù)積累的必要性和重要性[27]。土壤微生物生長和活性主要受底物濃度和pH的影響。研究發(fā)現(xiàn)pH是影響土壤真菌的主要環(huán)境因子，由于氮肥的長期施用，土壤pH在N處理中下降幅度最大，盡管真菌比細(xì)菌有更高的耐酸能力，但pH的變化對真菌類群產(chǎn)生了顯著的影響，這一結(jié)論也通過基于真菌類群相對豐度與pH的Pearson相關(guān)性分析和RDA分析得到驗(yàn)證(圖3)。以上結(jié)果與前期在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)及在其他生態(tài)系統(tǒng)的大量研究結(jié)果一致[3]。近期有研究利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法基于基因組探討了細(xì)菌的 pH 偏好性，發(fā)現(xiàn)了結(jié)合生物地理和基因組數(shù)據(jù)推斷和預(yù)測不同細(xì)菌類群的環(huán)境偏好的價(jià)值[28]，因此，推測今后可以基于基因組學(xué)層面解析真菌對pH的適應(yīng)性和偏好性，以便獲取更多有價(jià)值的信息。

4 結(jié)論

(1)經(jīng)過40余年長期氮磷肥處理顯著提高黑土土壤有效態(tài)氮和土壤磷的含量，降低了土壤pH，但對土壤TC的影響不顯著。

(2)農(nóng)田黑土真菌主要類群為子囊菌門，而長期氮磷施用對真菌群落組成沒有顯著影響。