劉子赫，吳書嫻，甄向凱

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350117)

嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)作為一種帶鞭毛的革蘭氏陰性胞內(nèi)致病菌，可以誘發(fā)軍團(tuán)菌肺炎，臨床特征表現(xiàn)為急性下呼吸道感染癥狀[1-2]。嗜肺軍團(tuán)菌在1976年美國費(fèi)城退伍軍人大會(huì)上爆發(fā)的非典型肺炎中被首次分離出來[3]。嗜肺軍團(tuán)菌大多生存在天然及人工水環(huán)境，包括空調(diào)冷卻塔、淋浴器和噴泉等。人們吸入被軍團(tuán)菌污染的氣溶膠后感染，引發(fā)非典型肺炎[4]。嗜肺軍團(tuán)菌在入侵宿主細(xì)胞后，可以通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌330多種效應(yīng)蛋白[5]，用來干擾宿主細(xì)胞內(nèi)的各種生命活動(dòng)，如營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、自噬、免疫反應(yīng)等多種生理生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[6]。宿主細(xì)胞通過胞吞作用將周圍環(huán)境中的嗜肺軍團(tuán)菌內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞中，在胞質(zhì)中形成含軍團(tuán)菌的囊泡樣吞噬小體(Legionella-containing vacuole，LCV)，為軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制增殖提供生理環(huán)境[7-8]。LCV中的嗜肺軍團(tuán)菌通過IVB型(Dot/Icm)分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞內(nèi)[9]，這些效應(yīng)蛋白間彼此分工協(xié)作，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號(hào)通路，干擾宿主細(xì)胞生理進(jìn)程，包括組蛋白修飾、囊泡運(yùn)輸和基因表達(dá)等[10]。

致病菌在與宿主的對(duì)抗中不斷進(jìn)化來逃避宿主的免疫防御[11]，通過誘導(dǎo)或沉默宿主體內(nèi)基因來幫助致病菌生存[12]。病原菌進(jìn)入宿主細(xì)胞，會(huì)試圖通過阻止宿主防御因子轉(zhuǎn)錄和翻譯來抑制免疫反應(yīng)或應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。最近研究表明嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白lpg1972可以靶向Ccr4-Not復(fù)合物中的CNOT7亞基，干擾宿主細(xì)胞內(nèi)mRNA的降解，影響宿主細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。

真核細(xì)胞Ccr4-Not(carbon catabolite repressor 4-negative on TATA)復(fù)合物是一種重要的、保守的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由至少6個(gè)核心亞基組成，以模塊化結(jié)構(gòu)排列[15]。Ccr4-Not復(fù)合物調(diào)控基因表達(dá)的許多方面(如染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、mRNA輸出和RNA干擾)，其中研究最透徹的作用是用于降解mRNA，發(fā)揮去腺苷化酶活性[16-17]。Ccr4-Not復(fù)合物以分子質(zhì)量較大的多結(jié)構(gòu)域蛋白CNOT1為基礎(chǔ)[18]，通過蛋白中心的MIF4G結(jié)構(gòu)域結(jié)合DEDD(Asp-Glu-Asp-Asp)核酸酶模塊(哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的CNOT7和CNOT8)[19]。CNOT7與CNOT8亞基競爭結(jié)合MIF4G結(jié)構(gòu)域，執(zhí)行相似但不同的催化作用[20]。除了DEDD核酸酶之外，Ccr4-NOT還包含由旁系同源物CNOT6和CNOT6L組成的二級(jí)核酸內(nèi)切酶-核酸外切酶-磷酸酶(EEP)核酸酶模塊，它通過與DEDD直接相互作用結(jié)合在Ccr4-Not復(fù)合物中[21-22]。盡管催化功能相似，每個(gè)核酸酶模塊調(diào)節(jié)不同的mRNA亞群，具有特定poly(A)結(jié)合偏好[23]。

綜上將嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白Lpg1972作為主要研究對(duì)象，結(jié)合分子生物學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，探究了Lpg1972與Ccr4-Not復(fù)合物中CNOT7亞基的相互作用，對(duì)復(fù)合物晶體進(jìn)行了篩選，并基于Alphafold2預(yù)測模型，分析它們之間的相互作用位點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 分子克隆實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料試劑

分子克隆實(shí)驗(yàn)所用試劑：DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×Taq PCR Mix、KOD-Plus-Neo酶、SspⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、GelStain核酸染料(10 000×)、DNA Marker、DNA上樣緩沖液、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒。

1.2 蛋白表達(dá)與純化相關(guān)試劑

蛋白表達(dá)純化過程中所用試劑如下。

感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑：BL21(DE3)感受態(tài)、氯化鈉、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG。

蛋白純化所用相關(guān)試劑：Tris、氯化鈉、咪唑、PMSF、Ni-NTA填料、硫酸鎳、Glutathione Beads填料、還原型谷胱甘肽。

蛋白質(zhì)SDS-凝膠電泳所用試劑：Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蛋白 Marker、考馬斯亮藍(lán)R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250。

1.3 蛋白晶體篩選相關(guān)試劑

晶體初篩試劑盒信息如表1所示。

表1 晶體初篩試劑盒Tab.1 Crystal primary screening kit

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所需儀器：超聲破碎儀(美國SONICS 超聲波細(xì)胞破碎儀)、高壓細(xì)胞破碎儀(永聯(lián)生物科技(上海)有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)、MiniQ超純水儀(默克Millipore)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾)、落地式低溫高速離心機(jī)(Thermo)、電泳儀(Bio-Rad)、PCR儀(Bio-Rad)、AKTApure蛋白純化系統(tǒng)(GEHealthcare)、Nanodrop(Thermo)、電子分析天平(Sartorius)、金屬浴(Coyote)、水浴鍋(常州普天儀器)、脫色搖床(Scilogex)、高壓滅菌鍋(Panasonic)、渦旋混合儀(Kylin-Bell)。

1.5 實(shí)驗(yàn)用緩沖液配制

實(shí)驗(yàn)用緩沖液配方如表2所示。

表2 緩沖液體系Tab.2 Buffer systems

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分子克隆

2.1.1 目的基因的獲取及引物設(shè)計(jì)

在NCBI (national center for biotechnology information)數(shù)據(jù)庫中查找Lpg1972和CNOT7蛋白的基因序列，利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物。

2.1.2 目的片段擴(kuò)增

用嗜肺軍團(tuán)菌基因組和HEK293T細(xì)胞基因組作為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系如表3和表4所示。

表3 PCR反應(yīng)程序Tab.3 PCR reaction procedure

表4 PCR反應(yīng)體系Tab.4 PCR reaction system

2.1.3 目的片段回收

瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，向擴(kuò)增結(jié)束的目的基因片段中按比例加入6×DNA上樣緩沖液，混合均勻后通過電泳遷移分離目的片段。

膠回收：當(dāng)上樣緩沖液中的指示劑條帶跑到合適位置時(shí)停止電泳，取出瓊脂糖凝膠，在DNA Marker的指示下，判斷PCR產(chǎn)物長度，切下目的條帶，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Gel Extractionn kit)說明書進(jìn)行膠回收，回收完成后用Nanodrop儀器測量濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 線性化表達(dá)載體制備

將含有空載環(huán)狀載體質(zhì)粒的菌株接入5 mL含有抗性的培養(yǎng)基，放置于37 ℃、220 r·min-1恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)。使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，所得質(zhì)粒用Nanodrop儀器測量回收質(zhì)粒濃度，用于質(zhì)粒線性化。

質(zhì)粒線性化：選取合適的酶切位點(diǎn)，將空載環(huán)狀載體質(zhì)粒酶切制備線性載體，按體系加入樣品，37 ℃酶切反應(yīng)4 h，反應(yīng)體系如表5所示。反應(yīng)結(jié)束通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收線性化載體。

表5 反應(yīng)體系Tab.5 Reaction system

2.1.5 目的基因與表達(dá)載體構(gòu)建

采用同源重組法，將回收的目的DNA片段構(gòu)建到表達(dá)載體上，參照無縫克隆plus One step PCR Cloning kit試劑盒說明書將線性化載體與目的片段以合適的比例加入離心管中進(jìn)行重組反應(yīng)，混合溶液50 ℃金屬浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)體系參考表6。

表6 反應(yīng)體系Tab.6 Reaction system

2.1.6 轉(zhuǎn)化

取儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中的100 μL DH5α感受態(tài)置于冰上，待感受態(tài)完全融化后將步驟2.1.5中的重組質(zhì)粒全部加入感受態(tài)細(xì)胞中。冰上孵育25～30 min 后，42 ℃ 熱激90 s，冰上靜置2 min。加入500 μL無抗LB培養(yǎng)基，置于37 ℃ 恒溫?fù)u床，220 r·min-1培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)后將感受態(tài)4 000 r·min-1離心3 min，吸取去500 μL上清后，用剩余上清重懸細(xì)胞并涂于含有相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)皿中，置于37 ℃ 恒溫?fù)u床靜置培養(yǎng)14 h。

2.1.7 菌落PCR及測序

由于目的片段與載體連接可能出現(xiàn)假陽性，需對(duì)長出的菌落進(jìn)行鑒定。取滅菌EP管加入含相關(guān)抗性的LB培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落37 ℃ 培養(yǎng)4 h左右。取1 μL菌液進(jìn)行菌落PCR，按照步驟2.1.2設(shè)置相關(guān)程序。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸膠電泳，挑選與目的基因片段大小相同的樣品，取200 μL菌液進(jìn)行測序。

2.2 目的蛋白的表達(dá)及純化

2.2.1 目的蛋白的表達(dá)

取陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)型菌株E.coliBL21(DE3)中，分別挑取V7- Lpg1972、pGEX-6P-1-CONT 7以及V7-Lpg1972-CNOT7共表達(dá)的單克隆菌落接入100 mL含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng)6 h。將菌液轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性的1 L LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng)2～4 h，分光光度計(jì)測量菌液濃度D600 nm=0.8時(shí)，加入400 μL 1 mol·L-1IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，置于18 ℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)14～16 h。最后以4 000 r·min-1離心收集大腸桿菌細(xì)胞，并置于-20 ℃儲(chǔ)存。

2.2.2 蛋白質(zhì)純化

(1)高壓破菌：將收集的菌塊按每升菌液收集的細(xì)胞加入15～20 mL裂解緩沖液重懸備用，重懸后的菌液用高壓破碎儀破碎。破碎結(jié)束后，收集溶液并用高速冷凍離心機(jī)離心，離心機(jī)參數(shù)為4 ℃，17 000 r·min-1，離心30 min。

(2)親和層析：由于重組蛋白N末端具有6×His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，蛋白質(zhì)純化使用親和層析的方法[24]。帶有6×His標(biāo)簽的目的蛋白可特異性吸附在Ni填料上，帶GST標(biāo)簽的蛋白可以特異性結(jié)合谷胱甘肽瓊脂糖凝膠，雜蛋白則不結(jié)合填料或結(jié)合能力較差，從而將目的蛋白與雜蛋白分離，最后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

(3)SDS-凝膠電泳：蛋白質(zhì)在SDS電泳液中變性并帶上相同電荷，在電流的作用下遷移，移動(dòng)速度與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相關(guān)，通過考馬斯亮藍(lán)染色使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白Marker比較，判斷蛋白質(zhì)樣品純度。

2.2.3 分子排阻層析

分子排阻層析也稱為凝膠排阻層析或分子篩，根據(jù)樣品組分的分子質(zhì)量進(jìn)行分離和純化，主要步驟如下。

(1)蛋白質(zhì)濃縮：將純化的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到濃縮管中，4 ℃臺(tái)式離心機(jī)4 000 r·min-1離心，濃縮至1 mL。濃縮的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管，使用小型離心機(jī)(13 000 r·min-1，15 min，4 ℃)離心至無沉淀。

(2)分子篩緩沖液配制：20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol·L-1NaCl，用0.22 μm濾膜抽濾去除雜質(zhì)，超聲波超聲20 min去除氣泡。

(3)層析柱平衡：泵頭用ddH2O清洗后放入分子篩緩沖液中，進(jìn)行泵沖洗和系統(tǒng)清洗。清洗結(jié)束后設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：流速0.4 mL·min-1，壓力上限報(bào)警2 MPa。層析柱與AKTA連接，用當(dāng)前參數(shù)沖洗1個(gè)柱體積。

(4)上樣：平衡結(jié)束后，重新設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：流速0.4 mL·min-1，壓力上限報(bào)警2 MPa，檢測紫外(UV)吸收波長A280 nm和A254 nm，當(dāng)基線平穩(wěn)后上樣。上樣前吸取分子篩緩沖液清洗上樣環(huán)3次，洗凈后將蛋白質(zhì)樣品注入上樣環(huán)，改變系統(tǒng)流路，使上樣環(huán)中的蛋白質(zhì)樣品流進(jìn)層析柱。根據(jù)分子排阻色譜圖評(píng)估蛋白質(zhì)信息并收集樣品。

(5)SDS-凝膠電泳：通過SDS-凝膠電泳檢測，取狀態(tài)較好的蛋白質(zhì)樣品濃縮，Nanodrop測量蛋白質(zhì)濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 蛋白質(zhì)pull-down實(shí)驗(yàn)

蛋白質(zhì)Pull-down是通過誘餌蛋白來特異性識(shí)別配體蛋白質(zhì)，是在體外研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。將帶有親和標(biāo)簽(如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、6×His、生物素)的誘餌蛋白固定在固體基質(zhì)上，當(dāng)目標(biāo)蛋白或細(xì)胞、組織抽提液流經(jīng)時(shí)，與誘餌蛋白相互作用的配體蛋白質(zhì)被捕獲，通過改變洗脫條件回收被捕獲的蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡或質(zhì)譜檢測這種相互作用關(guān)系。

CNOT7蛋白的基因構(gòu)建到6p-1載體上，使其N末端帶GST標(biāo)簽，經(jīng)過表達(dá)、純化得到的蛋白樣品作為誘餌蛋白結(jié)合到GST填料上。Lpg1972蛋白的基因構(gòu)建在V7載體上進(jìn)行表達(dá)純化，N末端帶6×His標(biāo)簽。純化所得到的Lpg1972蛋白加入帶有誘餌蛋白的GST填料中，用緩沖液反復(fù)沖洗，直至不再有蛋白洗脫下來。將帶有誘餌蛋白的GST填料加入緩沖液，置于金屬浴95 ℃加熱5 min，使蛋白質(zhì)變性，從GST填料上脫離下來。取10 μL樣品通過SDS-凝膠電泳進(jìn)行鑒定，分析二者之間是否可能存在相互作用。

2.4 晶體的篩選

蛋白結(jié)晶的方法主要包括：氣相擴(kuò)散法(Vapor diffusion)、微量透析法(Crystallization by dialysis)和液-液擴(kuò)散法(Liquid-liquid diffusion)等。結(jié)晶主要原理：蛋白質(zhì)在沉淀劑作用下，溶解度不斷降低；封閉環(huán)境下，點(diǎn)晶孔中的溶液通過汽-液交換擴(kuò)散到池液中，蛋白質(zhì)濃度緩慢升高而析出，蛋白質(zhì)分子由無序轉(zhuǎn)變?yōu)橛行蚺帕校?jīng)過成核-生長，最終生成晶體。

初篩常用試劑盒為：PEG-Rx、 PEG-Ion、Index、SaltRx、Crystal Screens、Wizard classic 1/2、Wizard classic 3/4、Core Ⅰ、Core Ⅱ、Core Ⅲ、Core Ⅳ、SaltRx、PACT、Proplex。每種試劑盒中細(xì)分96個(gè)條件，使用96孔初篩板進(jìn)行初篩。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Lpg1972和CNOT7原核表達(dá)

3.1.1 引物設(shè)計(jì)與表達(dá)載體構(gòu)建

使用SnapGene軟件對(duì)Lpg1972與CNOT7的基因序列設(shè)計(jì)引物(表7)。以嗜肺軍團(tuán)菌基因組和HEK293T基因組為模板擴(kuò)增出目的片段，將兩個(gè)目的片段分別構(gòu)建到V7載體和pGEX-6P-1載體上，使目的蛋白分別在N末端帶6×His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)表達(dá)。

表7 引物信息Tab.7 Primer information

3.1.2 Lpg1972蛋白純化

鎳柱親和層析：將Lpg1972菌破碎并離心得到上清倒入鎳柱，待目的蛋白與鎳填料充分結(jié)合，向裂解緩沖液中分別加入20、50、300 mmol·L-1濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫。收集各組分洗脫液樣品，進(jìn)行SDS-凝膠電泳(圖1)。電泳泳道從左至右依次為蛋白Marker、沉淀、上清、流穿、20 mmol·L-1IM洗脫樣、50 mmol·L-1IM洗脫樣、300 mmol·L-1IM洗脫樣。結(jié)果顯示用300 mmol·L-1濃度的咪唑緩沖液洗脫下來的蛋白質(zhì)樣品純度較好，收集這些樣品進(jìn)行濃縮。

圖1 Lpg1972鎳柱親和層析SDS-凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The SDS-PAGE results for the Lpg1972 nickel column affinity chromatography

分子排阻層析：將蛋白質(zhì)溶液濃縮至1 mL，質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1，13 000r·min-1離心并去除沉淀。分子排阻層析選用Superdex 200層析柱，具體步驟參照2.2.3，分子排阻層析結(jié)果如圖2(a)所示，SDS-凝膠電泳結(jié)果從左至右依次為：分子篩上樣前樣品、蛋白 Marker以及峰尖樣品，由此判斷出峰尖樣品純度較好，如圖2(b)。

圖2 Lpg1972蛋白分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳結(jié)果(b)Fig.2 Results of size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE(b) for Lpg1972 protein

3.1.3 CNOT7蛋白純化

將CNOT7的表達(dá)菌破碎并離心，將上清與GST柱孵育，待目的蛋白與填料充分結(jié)合后進(jìn)行洗脫，洗脫液為20 mmol·L-1還原型谷胱甘肽。收集洗脫下來的溶液樣品，濃縮換液將谷胱甘肽濃度降至0，加入Prescission Protease酶反應(yīng)4 h切去GST標(biāo)簽，酶切后加入GST柱孵育，切除標(biāo)簽的目的蛋白不與柱料結(jié)合，從而與標(biāo)簽分離，取各組分樣品進(jìn)行SDS-凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。

從左至右依次為沉淀、上清、流穿、20 mmol·L-1谷胱甘肽洗脫樣、酶切后流穿樣、Prescission Protease酶、酶切后洗脫樣(GST標(biāo)簽)、蛋白 Marker。圖3 CNOT7親和層析SDS-凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE detection results for CNOT7 affinity chromatography

3.1.4 GST pull-down驗(yàn)證二者相互作用

將純化所得的CNOT7蛋白(帶標(biāo)簽)重新結(jié)合在GST柱上，并向?qū)游鲋屑尤爰兓玫腖pg1972蛋白，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育6 h后進(jìn)行洗脫。收集洗脫下來的溶液樣品，經(jīng)過分子排阻層析純化后，根據(jù)SDS-凝膠電泳判斷蛋白質(zhì)相互作用，結(jié)果如圖4所示，SDS-凝膠電泳結(jié)果從左至右依次為分子篩上樣前、蛋白Marker、峰1、峰 2、峰3。由第二個(gè)峰處的結(jié)果可以判斷蛋白之間具有相互作用。

圖4 GST pull-down的分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳檢測(b)結(jié)果Fig.4 Results of GST pull-down molecular size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE detection(b)

3.2 復(fù)合物蛋白純化

3.2.1 引物設(shè)計(jì)與共表達(dá)載體構(gòu)建

將CNOT7和Lpg1972序列之間通過一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)連接，并將重組序列連接在V7載體，設(shè)計(jì)共表達(dá)質(zhì)粒。其中CNOT7蛋白N末端帶6×His標(biāo)簽，引物設(shè)計(jì)如表8。構(gòu)建方法參考2.1。

表8 引物信息Tab.8 Primer information

3.2.2 復(fù)合物蛋白純化

帶6×His標(biāo)簽的CNOT7蛋白可以與Ni填料結(jié)合，Lpg1972可以通過結(jié)合CNOT7蛋白間接結(jié)合在填料上。并通過不同濃度咪唑洗脫復(fù)合物蛋白，收集洗脫下來的溶液樣品，根據(jù)SDS-凝膠電泳判斷蛋白質(zhì)表達(dá)及純化結(jié)果如圖5(b)。電泳結(jié)果從左至右依次為沉淀、上清、流穿、0 mmol·L-1IM洗脫樣、20 mmol·L-1IM洗脫樣、50 mmol·L-1IM洗脫樣、300 mmol·L-1IM洗脫樣、蛋白Marker、峰1、峰2。在峰2處可以收集到純度較好的復(fù)合物蛋白。

圖5 CNOT7-Lpg1972復(fù)合物分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳(b)結(jié)果Fig.5 Results of size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE(b) for the CNOT7-Lpg1972 complex

3.3 結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

利用AlphaFold2對(duì)Lpg1972進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測[25-26]，如圖6所示，Lpg1972主要由5個(gè)β折疊及另一側(cè)的α螺旋組成。對(duì)Lpg1972的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了Dali分析，在PDB數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與它具有相似的結(jié)構(gòu)的同源蛋白。表面電荷分析發(fā)現(xiàn)Lpg1972的C末端具有一個(gè)明顯的帶負(fù)電荷的區(qū)域。

圖6 Lpg1972三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 AlphaFold2-generated structural model of Lpg1972

COT7蛋白已經(jīng)被證實(shí)為一種去腺苷化酶，可以在體外降解RNA，它的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7所示[27]。通過電荷分析可以看出CNOT7蛋白有2個(gè)正電腔，推測可能為Lpg1972的結(jié)合位點(diǎn)。

圖7 CNOT7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB：2D5R-A)Fig.7 Three-dimensional structure of CNOT7 protein (PDB：2D5R-A)

通過軟件AlphaFold2對(duì)CNOT7-Lpg1972復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，來分析它們之間相互作用的方式[28]。CNOT7-Lpg1972復(fù)合物的結(jié)構(gòu)如圖8(a)所示。根據(jù)復(fù)合物的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型分析了二者的相互作用位點(diǎn)，如圖8(b)，Lpg1972的C末端深入CNOT7的正電荷口袋中，Lpg1972蛋白的Lys124與CNOT7蛋白的Asp40之間可以形成氫鍵相互作用，同時(shí)分析二者的表面電荷發(fā)現(xiàn)Lpg1972蛋白的Glu114和Glu117與CNOT蛋白的Arg49可以發(fā)生靜電相互作用。

圖8 復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測(a)和相互作用位點(diǎn)分析(b)Fig.8 AlphaFold2-generated structural model of the complex(a) and analysis of their interaction sites(b)

4 總結(jié)與討論

嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白數(shù)量繁多，功能豐富，通過IVB型分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)，在致病過程中發(fā)揮重要的作用。其中Lpg1972作為一種效應(yīng)蛋白，可以與Ccr4-Not復(fù)合物發(fā)生相互作用。Ccr4-Not復(fù)合物可以調(diào)控真核細(xì)胞內(nèi)mRNA降解，在細(xì)胞增殖、凋亡和自噬過程中發(fā)揮著重要作用，因此研究效應(yīng)蛋白Lpg1972與CNOT7亞基的相互作用關(guān)系具有重要意義。

本研究通過體外生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Lpg1972和CNOT7蛋白的相互作用，并在此基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了共表達(dá)重組質(zhì)粒，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，分離純化了純度較好的復(fù)合物蛋白。因此嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白Lpg1972可以通過相互作用的方式影響Ccr4-Not復(fù)合物的生理活性，進(jìn)而干擾真核細(xì)胞內(nèi)mRNA的降解，影響宿主細(xì)胞的正常生理進(jìn)程。最后通過AlphaFold2軟件預(yù)測了復(fù)合物結(jié)構(gòu)并分析了可能的互作位點(diǎn)，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。